些 细胞，并保持在血液中。血糖水平升高，并被用于诊断前驱糖尿病或糖尿病。
[0092]美国糖尿病协会将前驱糖尿病定义为空腹血糖水平为100mg/dl至125mg/dl，或者 口服葡萄糖耐量试验(〇GTT)2h后的血糖水平为140mg/dl~125mg/dl，并且血红蛋白Alc水 平为5.7%~6.4%。
[0093] 1型糖尿病，以前称作幼年型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病，通常首先在儿童、青 少年、或年轻成人中被诊断。患上这种形式的糖尿病后，胰腺不再制造胰岛素，因为身体的 免疫系统会攻击和破坏产生胰岛素的细胞。1型糖尿病的治疗包括注射胰岛素。
[0094] 2型糖尿病，以前称作成人发病型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病，是糖尿病最常 见的形式。人们可以在任何年龄，甚至在童年发生2型糖尿病。这种形式的糖尿病通常始于 胰岛素抵抗，这是一种脂肪、肌肉和肝细胞不能适当利用胰岛素的状况。最初，胰腺通过产 生更多的胰岛素来满足增加的需求。然而，随着时间的推移，它丧失了响应用餐而分泌足够 胰岛素的能力。超重和不活动会增加发生2型糖尿病的几率。
[0095] 有些妇女在怀孕晚期会发生妊娠糖尿病。虽然这种形式的糖尿病通常在婴儿出生 后消失，但是曾患有妊娠糖尿病的妇女在将来更有可能发生2型糖尿病。
[0096] 糖尿病的症状包括口渴增加、尿频、频繁感染、视力模糊、感到劳累、伤口愈合慢、 手和(或)脚刺痛和(或)麻木，和经常性皮肤、牙龈、或膀胱感染，体重减轻，恶心和呕吐。如 果不治疗，则患者将有更大的危险发生许多其它疾病。
[0097] 糖尿病患者有更大的危险发生眼部并发症，如视网膜病变。糖尿病患者也有更高 的危险发生神经损伤。溃疡最常发生在跖球(ball of the foot)或者大脚趾的底部。有多 达三分之二的成人糖尿病患者患有高血压。通常，糖尿病患者的听力损失的常见程度是不 患有糖尿病的人的两倍。研究显示，糖尿病患者中牙龈疾病的发病率增加。胃轻瘫是一种既 影响1型糖尿病患者又影响2型糖尿病患者的疾病，其中胃清空其内容物所需要的时间太长 (胃排空延迟）。糖尿病会损伤肾脏并导致它们衰竭。三分之二的糖尿病患者死于中风或心 脏疾病。
[0098] 糖尿病的改善通常通过分析空腹、餐后、摄入葡萄糖饮料后和睡前的血糖水平进 行测量。更低的空腹葡萄糖水平、以及在餐后或口服葡萄糖挑战后更快速和完全地返回到 基线葡萄糖，可以作为改善的指示。
[0099]胃肠生态失衡的治疗
[0100]在某些实施方案中，胃肠生态失衡的治疗是指部分或完全减轻、改善、缓解、抑制 症状，延缓的发作，降低症状的严重程度和/或发生频率。
[0101 ]可以表征健康个体和患有疾病的个体中的GI微生物组。健康个体中的GI微生物组 定义为正常。在患有某些疾病如糖尿病、肥胖、肠易激综合征（IBS)和肠易激病症（IBD)的个 体中表征的GI微生物组称为处于生态失衡状态。目前，用病理状态的症状和后果定义疾病。 并不知道生态失衡对病理状态有多大程度的贡献，也不知道生态失衡在何种程度上是该病 理状态的后果。尽管如此，可以通过将生态失衡回转到正常的GI微生物组来治疗病理状态 或病理状态的后果。
[0102] GI生态失衡通常作为病理状态个体的粪便样品中的微生物群体被表征。在一些情 况下，生态失衡导致粪便中的短链脂肪酸(SCFA)的水平降低，粪便pH增加，硫化氢和甲烷气 体的产生增加，抗氧化能力降低，存在机会性微生物群，存在致病真菌和酵母，肠道炎症增 加，肠道粘膜厚度降低，结肠溃疡和肠漏。改善可以观察到粪便SCFA水平增加，降低粪便pH， 硫化氢和甲烷气体的产生减少，抗氧化能力增加，没有机会性微生物群，没有致病性真菌和 酵母，降低肠道炎症，正常的肠粘膜厚度，健康的结肠解剖和更少的循环免疫球蛋白A抗体。 实施例
[0103] 本发明进一步通过如下的实施例进行示例说明。这些实施例的提供仅仅出于举例 说明的目的。它们不应被看作在任何方面对本发明的范围和内容具有限制。
[0104] 实施例1.大豆抗毒素生物利用度
[0105] 雄性ZDSD/Pco大鼠在PreClinOmics(PreCclinOomics，Indianapolis，Indiana)现 场选育，单独饲养在悬挂铁丝笼中，并保持在12:12小时光照-黑暗循环和受控的室温(20-21°C)的标准实验室条件下。实验规程和所有程序均经过PreClinOmics的研究所动物护理 和使用委员会的批准。选择3月体重约500g的大鼠用于实验，因为它们尚不会发生糖尿病。 糖尿病同步可以通过喂食高热量饮食来实现。然而，因为本研究需要前驱糖尿病模型， ZDSD/Pco大鼠接受了磨碎的经福照的Purina 5008饲料(Ralston Purina，Belmont，CA)，以 在整个研究期间保持前驱糖尿病状态。饲料被放置在防溢出罐中，以便准确地测量食物摄 入量，并且大鼠可以自由饮水。
[0106] 将大豆抗毒素通过经口灌胃（3mL)施用给饱食状态下的大鼠。研究设计包括以下 分组(每组η = 3只大鼠）：溶媒(泊洛沙姆407; 7.5 %水溶液），溶于泊洛沙姆中的大豆抗毒素 以施用30mg/kg和90mg/kg。在口服灌胃后0.5、1、2和4h测量血中大豆抗毒素的水平。通过断 头处死动物，并收集躯干血到补充有抑肽酶的EDTA包被的试管中。分离血浆并保存在-80 °C，直至通过HPLC-ESI-MS/MS进行分析（图1)。这些数据表明，大豆抗毒素在口服给药后被 一定程度地吸收进入循环，从而使细胞暴露于异黄酮。血浆水平较低，但保持了 4小时。
[0107] 实施例2. 口服葡萄糖耐量试验
[0108] 并保持在12:12小时光照-黑暗循环和受控的室温（20-21°C)的标准实验室条件 下。实验规程和所有程序均经过PreClinOmics的研究所动物护理和使用委员会的批准。选 择3月体重约500g的大鼠用于实验，因为它们尚不会发生糖尿病。糖尿病同步可以通过喂食 高热量饮食来实现。然而，因为本研究需要前驱糖尿病模型，ZDSD/Pco大鼠接受了磨碎的经 福照的Purina 5008饲料(Ralston Purina，Belmont，CA)，以在整个研究期间保持前驱糖尿 病状态。饲料被放置在防溢出罐中，以便准确地测量食物摄入量，并且大鼠可以自由饮水。
[0109] 8只大鼠在如实施例1所述的光周期黑暗循环开始时被随机指定为接受大豆抗毒 素(30mg/kg或90mg/kg)或溶媒。在治疗的第一天(dl)，如下文所述地执行口服葡萄糖耐量 试验(OGTT)。
[0110] 在光周期的黑暗循环中禁食5h之后，如上所述地通过口服灌胃施用大豆抗毒素。 本实验中每组有8只大鼠。在第6h，对大鼠施用葡萄糖(2g/kg, 10ml/kg，p.o.)。在葡萄糖挑 战后15、30、60、90和120分钟尾静脉采血样用于葡萄糖测量。全血葡萄糖水平用4丨？1^1^ &1^ 血糖仪(Abbott Laboratories ,Abbott Park, Illinois)测量。
[0111] ZDSD/Pco大鼠处于前驱糖尿病状态，其证据是空腹血糖值为127.6 ± 1.5mg/dl (η = 24)。血糖在口服葡萄糖灌胃后30分钟增加到最大值，在溶媒组中它保持升高直到60分 钟，但在两个大豆抗毒素组中在该时刻显著较小(ρ〈〇. 05)(图2)。在120分钟口服挑战期间 的循环葡萄糖的处理(disposal)在两个大豆抗毒素组中显著大于(ρ〈0.05)溶媒组(对于溶 媒组(n = 8)、30mg/kg大豆抗毒素组(η = 8)和90mg/kg大豆抗毒素组(n = 8)，0GTT的AUC是 26890 ±876，24310 ±496和23401 ± 754mg/min/dl)。两个大豆抗毒素组之间没有显著差异。 [0112]数据表明，用三种大豆抗毒素的混合物进行预处理可改善前驱糖尿病ZDSD大鼠对 口服葡萄糖挑战的血糖响应。
[0113]实施例3.脂肪细胞中的活性
[0114]为了确定大豆抗毒素在前驱糖尿病模型中改善口服葡萄糖挑战的一个机制是否 是通过增加脂肪的葡萄糖摄取，在3T3-L1细胞中研究了大豆抗毒素药理学。鼠前脂肪细胞 (Zen-Bio Inc.)用PM-I-Ll培养基(Zen-Bio inc.)培养，该培养基含有Dulbecco改良Eagle 培养基(DMEM)/HamF-10培养基（l:l，v/v)，HEPES15mM(pH7·4)，10%(v/v)胎牛血清，青 霉素（100U/ml)，链霉素 （IOOmg ml)和两性霉素 B(0 · 25yg/'ml)，置于湿润气氛下（5%C〇2/ 95 %空气）。3-4天后，将汇合细胞置于分化培养基中（DM-2-L1，Zen-Bio Inc.)，其含有 DMEM/HamF-10培养基（l:l，v/v)，HEPES15mM(pH7·4)，3%(v/v)胎牛血清，生物素（33μ M)，泛酸（17μM)，人胰岛素（100 nM)，地塞米松（lμM)，青霉素（100U/ml)，链霉素（100mg/ ml)，两性霉素 B(0. SSyg/ ml)，异丁基甲基黄嘌呤(0.20μΜ)，和PPAR γ激动剂（ΙΟμΜ)，并 进一步在湿润气氛下温育3天。然后，将培养基变成AM-I-Ll培养基(Zen-Bio Inc.)，其含有 DMEM/HamF-10培养基（1:1，v/v)，HEPES 15mM(pH 7 · 4)，3 % (v/v)胎牛血清，生物素（33μ M)，泛酸（17μM)，人胰岛素（100nM)，地塞米松（lμM)，青霉素（100U/ml)，链霉素（100μg/ ml)，和两性霉素 Β(0.25yg/ 'ml)。在额外的10天温育中，每2-3天更换AM-I-Ll培养基（SP月旨 肪细胞保持培养基，例如由ZenBio?市售的那些）。
[0115] 将脂肪细胞在无菌、新鲜的KRH缓冲液(HEPES pH = 7.4，lmM CaCl2，1.2mM MgS〇4， ImMK H2F〇4，1.4mM KCl，20mM，130mM NaCl)中漂洗，然后在KRH缓冲液中预温育24h。除去 缓冲液，将脂肪细胞在含有大豆抗毒素(标示浓度，例如〇.5μΜ-5μΜ)的KRH缓冲液中温育 规定的时间。向每个孔中添加 IOyL用D-葡萄糖（IOOmM)稀释成0.0 lyCiAiL的[3!1]-2-脱氧-D-葡萄糖(￥1廿&1，？1&(^1^1 &^)，并在37°(3水浴中温育10分钟。除去上清液，将平板在冰 冷KRH中快速漂洗三次。将最后一次漂洗吸干，注意不要除去细胞单层，然后添加500yL冰冷 的RIPA缓冲液(Sigma-Aidri Ch，St.L〇uis，M0)以裂解细胞。每个孔中的细胞内容物用Iml移 液器吹打数次以便从平板底部除去附着的细胞和细胞组分。将450yL等份转移到含有5mL EcoIume闪烁液(MP Biomedical，Santa Ana，CA)的小瓶中。将小瓶混合，并在Appl ied Biosystems 1100液体闪烁计数器中使用的工厂预设的窗口计数10分钟以检测氚。
[0116] 这些脂肪细胞对胰岛素刺激响应良好（图3)。葡萄糖以剂量依赖的方式(0.3nM-300nM胰岛素)转运到脂肪细胞中。观察到的最大刺激是基础葡萄糖摄取的约3倍，产生该响 应的一半的胰岛素浓度(EC 5q)算得为1.9± 1.5nM(n = 6)。
[0117]为了确定脂肪细胞对胰岛素的响应是否被大豆抗毒素所增强，将3T3-L1分化细胞 与DMSO(溶媒对照）、0.3nM胰岛素、5μΜ大豆抗毒素、或两种大豆抗毒素与胰岛素的混合物 一起温育。尽管大豆抗毒素与胰岛素一起刺激的葡萄糖摄取倾向于更大，但是该增加没有 显著差异（图4)。令人惊讶的是，大豆抗毒素混合物在激发葡萄糖摄取方面与胰岛素同样有 效，只是强度较小。
[0118] 为了研究葡萄糖摄取对大豆抗毒素的剂量响应，实施了剂量范围研究（图5)。通过 暴露于〇.5μΜ-1〇μΜ剂量范围的大豆抗毒素45分钟激发了葡萄糖摄取，EC50是2.40±0.43 μΜ，最大摄取是高于基础葡萄糖摄取的2.04±0.24倍(η = 3)。
[0119] 为了确定大豆抗毒素激发葡萄糖摄取的内在机制，检查了编码GLUTl和GLUT4的基 因的表达，GLUTl和GLUT4是在脂肪细胞中表达的关键葡萄糖转运蛋白基因。
[0120] 让脂肪细胞在6孔板中生长，如上所述，并在分化开始后10-11天使用。将脂肪细胞 在无菌KRH缓冲液中漂洗，然后在KRH缓冲液中预温育24h。除去缓冲液，用作为溶媒的DMSO 或用大豆抗毒素(标示的浓度，例如ΙμΜ或1〇μΜ )处理3h。使用Trizol试剂（Invitrogen)分 离总RNA，并在RNeasy柱(Qiagen)上根据制造商的方案进行纯化。RNA质量和浓度通过260nm 和280nm的吸光度确定。使用QUANTITECT反转录试剂盒(Qiagen)反转录总RNA。用于GLUTl、 GLUT4,以及管家基因核糖体蛋白L32(RPL32)(NMJ 72086)的正向引物和反向引物的序列在 Obesity. 2008,16:1208-1218中描述。反应在96孔板中在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad) 上实施。热循环条件如下：50°C 2min，95°C lOmin，随后50个循环，每个循环为95°C 15s和 60°C 60s。使用△ ACt相对定量法确定表达的倍数变化。这是如下实现的：先将所得的靶 mRNA的阈值循环(Ct)数值相对于同一样品中内参Rp 132的Ct值标准化。这些数据与DMSO对照 进行比较。
[0121] 在暴露于1μΜ-1〇μΜ范围的大豆抗毒素的细胞中，GLUTl和GLUT4的表达均显著增 加（图6)。
[0122] 这些发现证明，大豆抗毒素介导葡萄糖摄取进入脂肪细胞的一个机制是增加 GLUTl和GLUT4基因二者的表达。GLUTl被认为负责脂肪细胞和大多数其它细胞的基础葡萄 糖摄取。GLUT4也被脂肪和其他胰岛素靶组织所表达。它被认为负责胰岛素激发的葡萄糖摄 取。3T3-L1细胞在分化为成熟的脂肪细胞之后表达两种GLUT。因此，大豆抗毒素可能和胰岛 素协同、或独立于该激素激发脂肪细胞摄取葡萄糖。
[0123] 实施例4.对前驱糖尿病大鼠长期施用大豆抗毒素
[0124]给前驱糖尿病ZDSD/Pco大鼠施用3种大豆抗毒素（大豆抗毒素 I、大豆抗毒素 II和 大豆抗毒素 III)的混合物可以改善对口服葡萄糖挑战(challenge)的血糖响应(见实施例 2)。还证明了，大豆抗毒素在口服施用后只有部分可被生物利用，因为在施用30mg/kg或 90mg/kg后的3h内，血浆水平均较低(见实施例1)。使用ZDSD/Pco大鼠进行了研究，以确定口 服施用大豆抗毒素是否影响GI微生物组和体质(body composition)。
[0125] 大鼠用口服剂量的大豆抗毒素混合物(90mg/kg)处理11天，在处理前和处理第11 天时对奠便中微生物类群进行分析。使用Beckman Synchron CX4随机存取多重分析仪 (Beckman Coulter, Inc. ,Brea, CA)测量末梢血血衆中的葡萄糖（cat#0S 6121)、胆固醇 (cat#0SR6116)和甘油三酯（cat#QSR6018)。用Meso Scale Discoveiy多路复用仪器和 K11159c_l试剂盒(Meso Scale Discoveiy, Inc. ,Gaithersburg,MD)测量活性GLP-1 和膜岛 素。用ALPCO免疫大鼠/小鼠瘦素试剂盒(22-LEPMS-E01)通过ELI SA测量瘦素。
[0126] 在比较基线和大豆抗毒素处理11天后获得的粪便的微生物区系特征(microbiota signature)时，观察到3个菌属的丰度有差异(表1)。特别地，观察到Blautia属的菌种急剧 增长。在比较处理前与处理11天的粪便微生物区系时，溶媒处理大鼠的类群在多样性或丰 度上没有变化。