的详细描述，但本发明并不限于送些 实施例。
[0039] 实施例1
[0040] 1、骨髓单个核细胞分离
[0041] 无菌取巧7BL/6小鼠股骨，含2% FCS的Hanks液冲洗骨髓，密度梯度离必法分离， 制备骨髓单个核细胞悬液，PBS洗涂，计数后调整所需的细胞浓度后待用。
[0042] 2、细胞活力测定
[0043] 向96孔板中设定孔加入100 U 1的单个核细胞悬液，按设计加入处理药物100 U 1， 置入37°C二氧化碳赔箱中，培养化或者1她。取出培养板，放置室温，加入生物发光试剂 cel^titer 20 y 1，振荡混匀后，转入黑色测定板，GloMax?发光检测仪采用Promega自带 检测程序Cell-titer Protocol进行检测。检测结果自动生成Excel数据。
[0044] 3、集落形成（克隆）能力测定
[0045] 分装甲基纤维素培养基（M3534)，每管2ml，-2(TC保存。用前置于2-8C冰箱内或 室温下解冻；分离小鼠骨髓细胞，台盼藍染色要求存活细胞数大于95%，计数细胞，调整细 胞浓度加入M3534,振荡器充分混匀，静置待气泡消失，用3ml注射器连接16#平头注射器针 头，加入24孔板放入湿盒，置入37C，5% C〇2培养箱中培养7天。
[0046] 从培养第5天开始在倒置显微镜下进行观察。低倍观察集落形成情况，细胞数 > 30为阳性集落，集落形成率W每1〇5个细胞形成的集落数表示。
[0047] 4、竞争移植实验
[0048] 准备 C57BL/645. 1 小鼠，C57BL/645. 2 小鼠和 C57BL/645. 1/2 杂合小鼠。 巧7BL/645. 2小鼠作为受体，4. 5Gy剂量的"7Cs源Y射线照射2次后备用；冲洗杂合小鼠 骨髓单个核细胞，用无血清1640培养基调整浓度作为竞争细胞备用；冲洗巧7BL/645. 1小 鼠骨髓单个核细胞，用药物赔育并接受Y射线照射后作为供体细胞备用；供体细胞和竞争 细胞按1:1比例混合后从外她静脉窦注射入受体小鼠，每只小鼠注射2X10 6个细胞；注射 细胞8w后检测受体小鼠外周血、骨髓单个核细胞淋系和粒系的分型，W分析药物对供体细 胞中造血干细胞的保护作用。
[0049] 结果与讨论
[0050] (1)对造血细胞免疫细胞毒性
[0051] 分离小鼠骨髓单个核细胞，调整细胞浓度至2 X 1〇6个/ml。不同浓度的ISO分别由 RPMI-1640培养基进行配制。取细胞悬液100 U 1及不同浓度处理药物加入96孔培养板，赔 育1化后，生物发光法进行细胞活力测定。结果发现利用RPMI-1640培养基进行实验，ISO 在浓度低于10 4M时未发现明显的细胞毒性作用。结果见表1、表2。
[0052] 表1 ISO对骨髓细胞活力的影响（RLUX 1000)
[0054] 表2 ISO对骨髓细胞活力的影响（％ )
[0056] (2)对造血免疫细胞体外福射损伤的保护作用
[0057] 分离骨髓单个核细胞，加入不同浓度的药物后，赔育30min，进行照射。照射后继 续赔育1她，进行细胞活力测定。结果发现；IGy剂量照射组细胞活力较对照组下降16. 7% (p<0. 05)，ISO未见防护作用；4Gy剂量照射组的细胞活力较对照组下降51. 6% (p<0. 05)， ISO 组提高 28. 8% (1 X 10 7m，p<0. 05)，结果见表 3、表 4。
[0058] 表3 ISO对受照射骨髓细胞活力的影响（RLUX 1000)
[0060] 表4 ISO对受照射骨髓细胞活力的影响（％ )
[0062] 实验结果表明，照射后骨髓细胞活力l、4Gy分别下降16.7%、51.6%，提示照射 可W导致造血系统中骨髓单个核细胞功能活力下降。与放射对照组比较，ISO对骨髓单 个核细胞活力有一定的保护作用；有效保护浓度在10 6-10 %，是细胞毒性剂量10 4M的 1/100-1/10000,提示ISO在用于药物或保健品时具有良好的安全性。
[0063] (3)集落形成率
[0064] 分离骨髓单个核细胞，加入不同浓度药物后，赔育30min，进行照射，照射后接种， 进行CFU-GM测定。IGy剂量照射组的CFU-GM克隆数较对照组下降35. 7 % (p<0. 05)， ISO(IXlO6M)组较照射组CFU-GM克隆数提高了 31.4%，差异具有统计学意义（p<0. 05); 4Gy剂量照射组的C即-GM克隆数较对照组下降87. 3% (p<0. 05)，ISO (1 X 10 7M)组较照射 组CFU-GM克隆数提高了 26. 5%，差异具有统计学意义（p<0. 05)。结果见表5。
[006引表5 ISO对照射小鼠骨髓CFU-GM的影响（/5 X IO5)
[0067] 结果发现，不同照射剂量对小鼠 CFU-GM具有明显的抑制作用，提示照射可W抑制 造血系统中造血祖细胞化ematopoietic progenitor cell, HPC)的功能，而ISO对l、4Gy 照射对HPC的功能抑制具有明显的保护作用。
[0068] (4)竞争移植实验
[0069] 巧7BL/645. 2小鼠9Gy剂量的"7Cs源Y射线照射后作为受体；冲洗杂合小鼠骨髓 单个核细胞作为竞争细胞备用，冲洗C57BL/645. 1小鼠骨髓单个核细胞用药物赔育并接受 Y射线照射后作为供体细胞，供体细胞和竞争细胞按1:1比例混合后从外她静脉窦注射入 受体小鼠；8w后进行检测。根据竞争移植实验结果计算供体细胞再殖能力巧epopulating units Of donors,RUd),结果表明照射可W降低供体细胞的再殖能力，提示可W抑制造血系 统中HSC的功能。结果见表6。
[0070] 表6 ISO对竞争移植实验供体细胞再殖能力的影响（％ )
[0072] 根据细胞毒性实验、骨髓单个核细胞活力实验、集落形成实验和竞争移植实验，实 验结果发现，ISO对福射诱导的造血系统功能损伤具有一定的保护作用，保护作用体现在骨 髓单个核细胞、HPC和HSC H个层次，提示预防性给药可防治福射诱导骨髓的损伤；实验结 果还表明ISO毒副作用低，可W作为临床用药或保健品为放疗病人和职业接触福射人员提 供保护。
【主权项】
1. 如式I所示化合物ISO制备预防和\或治疗骨髓抑制疾病的药物中的应用2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的骨髓抑制是由福射和\或化学毒物 诱导。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的骨髓抑制包括外周血白细胞下降、 骨髓增生不良、再生障碍性贫血。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的由福射诱导的骨髓抑制疾病是选 自如下人员患有的疾病：接受放射治疗的肿瘤患者、福射暴露的工作人员、意外福射性同位 素暴露的人员。5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的由化学毒物诱导的骨髓抑制疾病 是选自如下人员患有的疾病：接受化学治疗的肿瘤患者、抑制骨髓的化学物接触的工作人 员及意外暴露的人员。6. -种预防和\或治疗骨髓抑制疾病的药物组合物，其特征在于，含有有效剂量的如 式I所示化合物ISO和药学上可接受的载体7. 根据权利要求6的药物组合物，其特征在于，还含有其他有效成分。8. 根据权利要求7的药物组合物，其特征在于，所述的其他有效成分选自其他营养物 质、促进骨髓造血细胞增殖的药物、抗福射药物。
【专利摘要】本发明提供了如式I所示的白藜芦醇同系物ISO在制备防治辐射诱导骨髓抑制药物中的应用。结果表明ISO对辐射诱导的骨髓细胞损伤、功能下降具有明显的保护作用。
【IPC分类】A61K31/085, A61P7/00, A61P7/06
【公开号】CN105560218
【申请号】CN201410529265
【发明人】侯琦, 孟爱民, 姚春所, 王琳, 玄玲玲
【申请人】中国医学科学院药物研究所
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年10月10日