9g、虎掌草209g，加入到C〇2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，溫度60°C，0)2 流量3ml/g生药· min,萃取时间SOOmin，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙 醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.30g。
[0024] 经检测，成品中齐墳果酸的含量为3.22mg/片。
[0025] 实施例4:天胡姜愈肝片抑制人卵巢癌细胞CoC2细胞增殖的实验研究资料 1.实验材料 1.1实验用细胞株 人卵巢癌细胞CoC2细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。
[0026] 1.2实验药物 研究药物:本发明天胡姜愈肝片:按实施例1方法制备。
[0027] 药液储液：称取lOOmg天胡姜愈肝片，溶于5ml无水乙醇中，0.2叫1滤器过滤，500μ Idoff管分装，-20°C存储，同时0.化m滤器过滤无水乙醇W备对照组之用。
[002引1.3实验试剂 DMEM( GIBC0公司Cat. No. 12100-061 Lot. No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技 有限公司Lot. No. 100419); NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat. No. 11810-033 Lot.No. 1088387) shypsinUMRESCO公司）；抓TAUMRESCO公司）；Penicillin G Sodium SalUAMRESCO公司1);S化eptomycin Sulfate(AMRESCO);无水乙醇（溜博亚杜兰经贸有限 公司）;MTT (Biosha巧批号：0793) :PBS(实验室自配）； 1.4实验器材 莱卡倒置显微镜（德国Leica型号:DMIL);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型 号：S阳CTRAMAX 190) ; C化培养箱(FORMA型号：3111);超净台（苏净集团安泰公司制造型号： SW-CJ-ZFD);纯水仪(美国Spring公司型号：S/N 020579);精密移液器(法国吉尔森公司型 号:P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号:BT323S);全自动高压灭菌锅（日本SANYO公 司型号:MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱（上海精密实验设备公司型号：DHG9123A);冰箱 (西口子公司型号:KG18V21TI);液氮罐(CBS型号：2001);低速离屯、机(上海安亭科学仪器厂 型号:KA-1000) ;0. 滤器(MILLIP0RE型号：SLGP033RB) ; 1cm培养皿(肥ST公司）、96孔培养 板(肥ST公司）;细胞计数板;离屯、管、移液管、Tips若干。
[0029] 2.实验方法 l)CoC2细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养（10cm培养皿），当细胞生长至 对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml ο. 25%膜蛋白酶-ο. 04%EDTA，37 °C 消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离屯、管中，10(K)rpm 离屯、5min，调整细胞悬液浓度3 X 104个/ml。
[0030] 2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液18化1，培养板放入细胞培养箱中 (37°C，5%0)2)常规培养。
[0031] 3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入天胡姜愈肝片溶液，继续培养2地。
[0032] 4)2地后加入2化1 MTT溶液巧mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养地。
[0033] 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入20化1二甲基亚讽，置摇床 上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0034] 6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液），对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT、二甲基亚讽），每组设定6个复孔。
[0035] 7)结果W药物对细胞的抑制率表示:细胞增值抑制率(％)=(对照孔0D值-给药孔0D 值）、对照孔0D值X 100%。实验重复3次。
[0036] 3.统计处理 采用Microsoft Excel 2007软件中的相关分析和Student t检验，数据Wmean±S.D. 表不。
[0037] 4.实验结果 MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对CoC2细胞增殖抑 制有差异(P<〇.〇5)，剂量在lOmg/ml时该差异具有显著性(P<0.01)，当剂量达到15-20mg/ml 时有极显著性差异(P<〇. 001)。
[003引表1天胡姜愈肝片对CoC2细胞增殖抑制影响研究（X±SD)
注：与对照组比较，冲<0.01; *冲<0.001。
[0039] 5.实验结论 本发明的天胡姜愈肝片可W抑制CoC2细胞增殖，减少CoC2细胞的细胞生长数目，该作 用呈剂量依赖性。
【主权项】
1. 天胡荽愈肝片在制备抑制卵巢癌细胞C〇C2细胞增殖药物中的应用，所述天胡荽愈肝 片由天胡荽699g、杏叶防风1398g、酢楽;草699g、虎掌草209g作为原料药制成，其特征在于， 所述天胡荽愈肝片的制备方法包括如下步骤:取天胡荽699g、杏叶防风1398g、酢浆草699g、 虎掌草209g，加入到C0 2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百 分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C，C0 2流量l-3ml/g生药· min，萃取时间800-lOOOmin，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500 片，每片重0.30g。2. 根据权利要求1所述的天胡荽愈肝片在制备抑制卵巢癌细胞C〇C2细胞增殖药物中的 应用，其特征在于，所述天胡荽愈肝片的制备方法包括如下步骤:取天胡荽699g、杏叶防风 1398g、酢浆草699g、虎掌草209g，加入到C0 2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总 萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40°C，C0 2流量2ml/g生药· min，萃取时 间900min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成 500片，每片重0.30g。
【专利摘要】本发明属于中药技术领域，具体涉及一种天胡荽愈肝片在制备抑制卵巢癌细胞CoC2细胞增殖药物中的应用及天胡荽愈肝片的制备方法。所述天胡荽愈肝片由天胡荽699g、杏叶防风1398g、酢浆草699g、虎掌草209g作为原料药制成，采用超临界萃取制备而成，使得齐墩果酸含量有很大提高。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/71, A61K9/20
【公开号】CN105596449
【申请号】CN201610183021
【发明人】孙霞
【申请人】济南新时代医药科技有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年3月28日