短改变其状态。
[0043] 小鼠进行进行悬尾刺激。实验时将大鼠尾部夹住悬起，悬尾大鼠为克服不正常体 位而挣扎活动，但活动一定时间后，出现间断性不动。表现出放弃调整的希望。每次刺激从 大鼠尾部夹住悬起到放下休息，时间为IOmin ((适应6分钟，取样测定4分钟）。
[0044] 3. 4高架十字迷宫（EPM)
[0045] 高架十字迷宫是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛 盾冲突行为来考察动物的焦虑状态。高架十字迷宫具有一对开臂和一对闭臂，啮齿类动物 由于嗜暗性会倾向于在闭臂中活动，但出于好奇心和探究性又会在开臂中活动，在面对新 奇刺激时，动物同时产生探究的冲动与恐惧，这就造成了探究与回避的冲突行为，从而产生 焦虑心理。而抗焦虑药物能明显增加进入开臂的次数与时间。木质十字（65amX5cm)，包 括3部分：两相对开臂区（30cmX5cm)，两相对闭臂区附有立墙（30cmX5cmX30cm)，中央区 (5cmX5cm);十字迷宫离地面50cm，实验由25W红灯泡离中央区40cm高处照明；EPM将小鼠 放入高架十字迷宫中央区，头面对开臂区，用摄像系统记录动物5min内的行为变化，包括 两臂停留时间、进入次数；其中，4只爪子经中央区均进入一臂方可开始记录实验参数。进 入开放臂次数及停留时间与大鼠的焦虑情绪成负相关，进入开放臂次数越少，停留时间越 短，说明老鼠的焦虑情绪越严重。3. 5脑内神经递质的测定
[0046] 末次行为学实验结束后，小鼠摘眼球取血，处死后于冰浴中迅速取出小鼠脑组织， 并分离海马，迅速置于液氮中，随后转移至-80°C保存，备用。
[0047] 3. 5. 1神经递质样品前处理方法：
[0048] 3. 5. I. 1海马及前额叶皮质样品的处理
[0049] 组织称重+400 μ L 0. 1 %甲酸-甲醇+10 μ L IS (3,4-二羟基苄胺，10 μ g/mL，甲 醇溶）一匀浆一13000印111，151^11，4°(：离心一取上清，氮吹干一10(^1^初始流动相（0.1% 甲酸-水：乙腈=98:2)复溶，涡旋一13000印111，151^11，4°(：离心一小心吸取上清，1(^1^进 样。（最终样品浓度：组织重/100 μ L，内标浓度：1 μ g/mL)
[0050] 3· 5. I. 2血清样品前处理方法：
[0051] 未抗凝的Ep管摘小鼠眼球取全血一13000rpm，15min，4°C离心取上清（置4°C 冰箱备用）一取IOOvL血清+IOyL IS(3,4-二羟基苄胺，10yg/mL，甲醇溶）一涡旋 -13000rpm，15min，4°C离心一取上清，氮吹干一100 μ L初始流动相（0· 1 %甲酸-水：乙 腈=98:2)复溶，祸旋一13000rpm，15min，4°C离心一小心吸取上清，10 μ L进样。
[0052] 3. 5. 1. 3神经递质测定条件
[0053] UPLC :Agilent Technologies 6410Triple Quad LC/MS，液相条件：色谱柱： Waters ACQUITY HSS T3柱（2. 1_X 100mm，1.8 μ m);流动相：梯度洗脱，流动相组成件表 1，流动相A为，流动相B为。流速：0.1 mL · min-1 ;进样室温度：4°C ;柱温：35°C ;进样量： 10. 0 μ L。质谱条件见表2,质谱参数见表3.
[0054] 表1神经递质测定的流动相
[0060] 3· 6统计分析
[0061] 采用SPSS 13. 0软件进行统计分析，实验数据以采用单因素方差分析，组间差异 采用Dunnett ' S后检验，P〈0. 05表示有统计学意义。
[0062] 4实验结果
[0063] 4. 1 旷场（OFT)实验
[0064] 术后恢复14天，第十五天进行OFT实验，结果表示OB模型成功，OB手术引起小鼠 在矿场活动总路程明显增加。给药28天后，旷场实验（OFT)测试动物在新奇环境下的自发 性活动和探索行为，青娥丸组行走总距离均较模型组提高，表明青娥丸可增加抑郁模型动 物在新奇环境下兴趣度。
[0065] 表4给药28天后各组动物在旷场中活动总路程
[0066]
[0067] 4· 2 悬尾实验（FST)
[0068] 给药28天后，悬尾实验的结果见表5,由结果可知，青娥丸高剂量和青娥方提取物 组可明显缩短OB小鼠悬尾不动时间，这表明青娥丸及青娥方提取物对抑郁的治疗作用，小 鼠悬尾后企图逃脱，挣扎逃脱的欲望增加。
[0069] 表5青娥丸对小鼠悬尾不动时间的影响
[0070]
[0071] 4. 3高架十字迷宫（EPM)
[0072] 给药28天后，高架十字迷宫实验的结果见表6,由结果可知，阳性药物百忧解和文 拉法辛均能增加小鼠在开臂的停留时间，青娥丸能显著增加 OB小鼠进入开臂的时间，表明 青娥丸能增加抑郁小鼠对新异环境的探究特性，青娥丸对抗动物的焦虑情绪具有很好的作 用。其抗焦虑情绪作用甚至强于阳性药物百忧解及文拉法辛。相对开臂时间是进入开臂时 间和进入闭臂时间的比值，是衡量抗焦虑作用的一个重要参数。青娥丸可显著增加 OB小鼠 的相对开臂时间，表明其具有较好的抗焦虑作用。
[0073] 表6青娥丸抗焦虑作用
[0074]
[0075] 4. 4 游泳实验（FST)
[0076] 给药28天后，游泳实验结果见表7,结果表明给予青娥丸及提取物治疗后，OB小鼠 强迫游泳不动时间明显较模型组缩短，表明青娥丸的抗抑郁作用明显。
[0077] 表7青娥丸对抑郁小鼠强波游泳实验不动时间的影响
[0078]
[0079] 4. 5嗅球切除小鼠给予药物治疗后对海马神经递质的影响
[0080] 嗅球切术小鼠给予阳性药物和青娥丸治疗后，海马γ -GABA水平较模型组显著增 加 （ρ〈0. 05)，海马Glu水平较模型组显著降低（ρ〈0. 05)，且Glu/GABA较模型组有显著降 低，且青娥丸治疗28天后，小鼠海马Glu/GABA趋于和假手术组一致。海马多巴胺和NE的 含量较模型组显著增加（P〈〇. 05)，且5-HT/5-HIAA比值显著增加（p〈0. 05)，结果见表8。
[0081] 表8嗅球切除小鼠给予药物治疗后对海马神经递质的影响
[0083] (三）结论
[0084] 海马在解剖结构上属于边缘系统前脑皮质，它与下丘脑，杏仁核，脑干有着极其复 杂的相互联系，与情绪认知密切相关，尤其是控制抑郁方面非常重要。是目前情绪应激，抑 郁症研究涉及最多的脑区。抑郁模型大鼠存在Glu/GABA平衡的失调。青娥丸能够逆转OB 造成的Glu/GABA比值的增加，该研究结果提示青娥丸及提取物可能通过影响脑内的Glu和 GABA代谢，即主要通过Glu/GABA-Glu代谢环路循环而发挥抗抑郁作用。
[0085] 5-羟色胺属于吲哚胺类神经递质，不能透过血脑屏障，所以中枢的5-羟色胺是 脑内合成的。值得一提的是，5-HIAA是5-HT的代谢产物，5-HT/5-HIAA的比值的增加，说 明5-HT的代谢受到了抑制，该过程由单胺氧化酶所催化，青娥丸能显著增加 OB鼠海马 5-HT/5-HIAA的比值，提示青娥丸可通过抑制单胺氧化酶的活性发挥抗抑郁作用。
[0086] 本实验结果表明，青娥丸可增加抑郁小鼠矿场活动总路程，降低悬尾不动时间，增 加小鼠进入高架十字迷宫开臂时间，减少抑郁小鼠强迫游泳不动时间，表现出较好的抗抑 郁作用。青娥丸的抗抑郁的作用可能通过多条途经发挥作用，一方面，青娥丸对γ-GABA的 增加作用和Glu的降低作用说明青娥丸具有调节中枢神经系统神经递质Glu和γ -GABA代 谢的作用，降低Glu/ γ -GABA的比值，减弱GABA能神经递质的传递，调控受体儿茶酚胺的反 应性，从而发挥抗抑郁作用的。另一方面，青娥丸通过抑制单胺氧化酶的活性，增加中枢神 经系统5-ΗΤ的水平，发挥抗抑郁作用。该研究的结果很好的解释了中药发挥药效的多靶点 多途径的作用。
[0087] 具体实施例2
[0088] 青娥丸在制备抗抑郁抗焦虑的组合物中的用途，其特征在于：青娥方由杜仲（盐 炒）480克，补骨脂（盐炒）240克，核桃仁（炒）150克，大蒜120克组成。
[0089] 以上四味，将大蒜蒸熟，干燥，与盐炒杜仲、盐炒补骨脂粉碎成细粉，过筛，再将炒 核桃仁捣烂，与上述粉末掺研，过筛，混匀。每100g粉末用炼蜜30g加适量的水泛丸，干燥， 制成水蜜丸；或加炼蜜70g制成大蜜丸，即得。
【主权项】
1. 青娥丸在制备抗抑郁抗焦虑的组合物中的用途。2. 根据权利要求1的青娥丸在制备抗抑郁抗焦虑的组合物中的用途，其特征在于：青 娥丸由杜仲（盐炒）480克，补骨脂（盐炒）240克，核桃仁（炒）150克，大蒜120克组成。3. 根据权利要求2的青娥丸在制备抗抑郁抗焦虑的组合物中的用途，其特征在于：以 上四味，将大蒜蒸熟，干燥，与盐炒杜仲、盐炒补骨脂粉碎成细粉，过筛，再将炒核桃仁捣烂， 与上述粉末掺研，过筛，混匀。每l〇〇g粉末用炼蜜20~30g加适量的水泛丸，干燥，制成水 蜜丸；或加炼蜜50~70g制成大蜜丸，即得。
【专利摘要】本发明公开了青娥丸在制备抗抑郁抗焦虑的组合物中的用途。青娥丸口服给药，增加实验动物矿场活动总路程，降低悬尾不动时间，增加进入高架十字迷宫开臂时间，减少强迫游泳不动时间，表现出较好的抗抑郁作用。青娥丸可增加海马区5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、γ-氨基丁酸(γ-GABA)的含量，降低谷氨酸(Glu)的含量。一方面，青娥丸对γ-GABA的增加作用和Glu的降低作用说明青娥丸具有调节中枢神经系统神经递质Glu和γ-GABA代谢的作用，降低Glu/γ-GABA的比值，减弱GABA能神经递质的传递，调控受体儿茶酚胺的反应性，从而发挥抗抑郁抗焦虑作用。另一方面，青娥丸通过抑制单胺氧化酶的活性，增加中枢神经系统5-HT的水平，发挥抗抑郁抗焦虑作用。
【IPC分类】A61P25/24, A61K9/20, A61K36/8962, A61P25/22
【公开号】CN105687647
【申请号】CN201410692612
【发明人】王峥涛, 胡芳弟, 张紫佳, 吴晓俊, 陈文霞
【申请人】上海中医药大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2014年11月26日