专利名称：：一种天然香兰素复合香味料及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种天然香兰素复合香味料及其应用，属应用微生物
技术领域：
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背景技术：
：香兰素(vanillin)是香荚兰豆中的主要成分，又名香草醛、香兰醛等,化学名称为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛(3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde)，相对分子量为152.15，白色至淡黄色结晶粉末或针状结晶。香兰素以游离态或糖苷的形式存在于植物中，占香荚兰豆干重的2%-3%。纯净的香兰素具有浓郁的奶香气，无异味。香兰素是一种重要的香料物质，广泛应用于食品、饮料、香料和医药等领域中。60%左右用作食品、糖果、饮料中的香味物质，33%左右用作香料和化妆品中的成分，7%左右用于医药中间体(汪多仁2000)。香兰素是目前世界上产量最大的合成香料，年消费量约1,2万吨(Nicholasetal.2000)。从香荚兰中提取制备的天然香兰素产量较低，每年实际只有约20-50吨，而且价格相当昂贵，余下的消费缺口都是通过化学合成法填补。近年来，随着消费者对食品安全的重视，对天然香兰素的需求量越来越大。但是，由于香荚兰种植受到气候、地域等条件限制，其生香处理又较复杂，因此天然香兰素的产量难以满足市场需求。国外(例如欧洲)的立法机构认为采用生物活细胞或其中的组成部分(例如酶)等生物资源所生产的物质均属于天然产物。因此，用生物转化法来生产天然香兰素已成为当前各国研究的一个热点。许多天然物质如阿魏酸、1，2-二苯乙烯酚、丁香酚、木质素、异丁香酚等都可以作为生物转化生产香兰素的前体物质(e.g.Gassonetal.1998;Laurenceetal.1999;Rabenhoretetal.2000)。阿魏酸(Ferulicacid)，化学名称为4-羟基-3-甲氧基苯丙烯酸(4-hydroxy-3-methoxycinnamicacid),广泛存在于玉米麸、谷糠等农副产物中(Yoshimotoetal.1990)。与丁香酚等其它天然物质相比较，阿魏酸对微生物的毒性小，并在自然界广泛分布。因此，以阿魏酸为底物用微生物转化法生产香兰素备受研究人员的重视。关于用多种微生物能将阿魏酸转化为香兰素已有报道。但经文献检索，未发现与本
发明内容相同文献的公开报道。
发明内容本发明的目的在于通过对一株能够转化阿魏酸生产香兰素的细菌五Wera6a"wsp.Px6-4的研究，开发天然香料。本发明从香荚兰植株上分离了一株具有转化阿魏酸形成香兰素的细菌(Px6-4),对其进行了形态学、生理生化性质和16SrRNA分析，鉴定结果表明该细菌的分类命名为肠杆菌(五Wera6ac^sp.)。该菌株已经保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址北京市海淀区中关村北一条13号、中国科学院微生物研究所；保藏日期2007年4月12日;保藏号CGMCCNo.1999。肠杆菌(五"^o6flcto"sp.)Px6-4的主要形态特征和生理生化性质为菌株Px6-4能以阿魏酸为唯一碳源进行生长，直杆状，宽0.6L0nmx1.22.0pm，兼性好氧，革兰氏染色阴性，无芽孢，可氧化葡萄糖产酸和气。能够以柠檬酸盐作为唯一的碳源和氮源生长，明胶水解试验和乙酰甲基甲醇试验(V.P.)反应为阳性，甲基红试验(M.P.)反应阴性。肠杆菌(五Wera6fl"ersp.)Px6-4的分子鉴定特征为利用通用引物16F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1500R(5-GGTTACCTTGTTACGACT-3)，以细菌Px6-4的基因组DNA作为模板扩增得到1500bp左右的PCR产物，回收测序、校正之后得到的菌株Px6-4的16SrRNA序列。Px6-4菌株的16srRNA核苷酸序列全长1503bp,该序列已经递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列索引号为EF175731。本发明按常规方法制备。即将肠杆菌(五",m^flc^sp.)Px6-4扩大发酵培养后，溶剂萃取分离出发酵产物中包含香兰素在内的多种转化香味组份，制成复合香味料。本发明的香兰素复合香味料的香味物质及相对百分含量分别为香兰素0.69%、4-乙基愈创木酚0.75%、4-乙烯基愈创木酚70.31%、4-乙酰基愈创木酚0.08%、4-丙基愈创木酚0.09%、4,4'-二联愈创木酚1.63%、1-丁醇0.34%、3-羟基-2-丁酮0.05%、结构未确定的未知物6.34%。本发明的香兰素复合香味料作为巻烟加香的应用。本发明的天然复合香味料具有能与烟支较好谐调，明显提调烟香、细腻醇和烟气、改善巻烟吸味等优点。具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。一香兰素复合香味料的制备本发明是这样实现的肠杆菌(E"tero6actersp.Px6-4)的培养方法l.试管斜面培养采用Luria-Bertani(LB)培养基，配方为1%蛋白胨，1%氯化钠，0.5%酵母提取物，1.8-2%琼脂。121。C灭菌25分钟，摆成斜面。接种五"fcra6ac^"sp.Px6-4，37'C培养18-24小时，获得试管种。2.液体扩大培养采用Luria-Bertani(LB)培养基，但不添加琼脂，在18xl80mm的试管中分装3-5mL液体LB培养基，灭菌后接入细菌五她ra6acto"sp.Px6-4，37。C培养18-24小时，获得液体菌种。3.液体发酵培养发酵培养基成分为阿魏酸0.5g/L，酵母膏0.5g/L,Na2HP0410g/L，MgS04.2H200.2g/L，CaCl20.1g/L，FeS04.2H200.01g/L。培养基初始pH7.0，接种量5-8%，转速180rpm，温度37'C。香兰素的发酵生产接种五"fera6"cto"sp.Px6-4试管种于液体种子培养基，37'C培养18-24小时，获得液体菌种。取5-8%的液体种接入发酵培养基，30'C培养4-5天，直到发酵液中积累较多的香兰素。香兰素复合香味料的制备和挥发性致香成分的分析发酵液离心(8000rpm,15min)处理，收集上清液，上清液中的香兰素通过有机溶剂(乙酸乙酯)进行萃取，有机相合并进行减压浓縮除去挥发性溶剂，再用四倍浓縮物量的75%乙醇回溶，获得浅黄色的提取液即为制备的天然香味料。采用气相色谱/质谱(GC/MS)对生物转化制取的天然香味料中挥发性致香成分进行半定量分析鉴定。具体操作是用二氯甲垸直接萃取天然香味料(30mL)三次(25mLx3)，合并二氯甲垸层，加无水硫酸钠干燥过夜；过滤，滤液经减压浓縮去除大部分溶剂，得到挥发性致香物质。所得挥发性组分用HP5890GC/6972MS联用仪进行分析。气相色谱条件色谱柱为HP-5毛细管柱(30mx0.25mmi.d)，柱温5025(TC，程序升温8。C/min.，载气He,流速40cm3/sec;进样口温度250。C，进样量l.O(iL，分流比为50:1。质谱条件EI电离源，电离电压70eV，离子源温度200"C，扫描范围30500n。所得图谱经计算机谱库(NBS75Wiley138)检索，并与各组份的裂解方式、有关标准图谱资料及标准品的保留时间与质谱图进行核对鉴定。从香荚兰产香内生菌Px6-4发酵制备的天然香味料中，分离鉴定出8种主要挥发性香味成分，占总检出峰的80.22%(表l)。检出的香味物质及相对百分含量分别为香兰素(0.69%)、4-乙基愈创木酚(0.75%)、4-乙烯基愈创木酚(70.31%)、4-乙酰基愈创木酚(0.08%)、4-丙基愈创木酚(0.09%)、4,4'-二联愈创木酚(1.63%)、i-丁醇(0.34%)、3-羟基-2-丁酮(0.05%)。另外还检出结构未确定的未知物(6.34%)。在以上检出的香味化合物中，香兰素是存在于香荚兰豆中、赋予其主要感官特性的香味化合物，具有浓而甜的持久的香荚兰豆特征气味。含量较高的4-乙烯基愈创木酚及其同系物乙基愈创木酚、丙基愈创木酚带有丁香样辛香和烟草特征酚香的温甜香韵，被视为是阈值更低、品质更高的替代愈创木酚的烟用添加剂。这些香味化'合物均是构成天然香荚兰特征香气的关键成分，正是它们的有机组合赋予了复合香味料的特征香韵。在巻烟加香中，这几种香味化合物都是非常重要的调配原料，用以修饰烟用香精的甜香、坚果香或辛香香韵，赋予巻烟丰满柔和的烟香风味。表l:香兰素复合香味料的挥发性致香成分分析序保留时间号(min.)化合物结构式相对百分含量(％)1.9322.30512.011-丁醇3-羟基-2-丁酮310.204-乙基愈创木酚411.114-乙烯基愈创木酚香兰素CH3(CH2)2CH2OHCH3COCH2OHCH3CH2CH3^丫HCOCHjOCHjCH=CHCHO0CH3CH2CH2CH3612.744-丙基愈创木酚0.340.050.7570.310,630.0912.92未知物6.3413.104-乙酰基愈创木酚o,t'CH30.0821.164,4'-二联愈创木酚二、香兰素复合香味料的在巻烟加香应用准确称取5g利用Px6-4产香菌制备的天然复合香味料，加入10g乙醇(75%)稀释混匀后，用微量喷雾器按烟丝量0.5%的添加比例均匀地喷加在50g待试烟丝上。将加香烟丝巻制成烟支，放入恒温恒湿箱内平衡24h后，由省级专业巻烟评吸委员组成的评吸小组按照巻烟感官评吸2006国标要求进行评吸。经专家评吸小组反复评吸，认为利用五加era6""wsp.Px6-4制备的天然复合香味料能与烟支较好谐调，具有明显提调烟香、细腻醇和烟气、改善巻烟吸味的良好效果(如表2所示)。表2:天然复合香味料在巻烟加料中的应用试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1、一种天然香兰素复合香味料，由生产菌株及辅料经液体扩大培养、液体发酵培养、及萃取分离后得到，其特征在于.生产菌株为肠杆菌(Enterobactersp.Px6-4)，菌株已于2007年4月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1999。2、权利要求1所说的天然香兰素复合香味料，其特征在于该香兰素复合香味料的香味物质及相对百分含量分别为香兰素0.69%、4-乙基愈创木酚0.75%、4-乙烯基愈创木酚70.31%、4-乙酰基愈创木酚0.08%、4-丙基愈创木酚0.09%、4,4，-二联愈创木酚1.63%、1-丁醇0.34%、3-羟基-2-丁酮0.05%、结构未确定的未知物6.34%。3、权利要求1和2所说的天然香兰素复合香味料，其特征在于该香兰素复合香味料作为巻烟加香的应用。全文摘要本发明涉及一种天然香兰素复合香味料及其应用，属应用微生物
技术领域：
。由生产菌株及辅料经液体扩大培养、液体发酵培养、及萃取分离后得到，其中生产菌株为肠杆菌(Enterobactersp.Px6-4)，菌株已于2007年4月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1999。该香兰素复合香味料的香味物质及相对百分含量分别为香兰素0.69％、4-乙基愈创木酚0.75％、4-乙烯基愈创木酚70.31％、4-乙酰基愈创木酚0.08％、4-丙基愈创木酚0.09％、4，4’-二联愈创木酚1.63％、1-丁醇0.34％、3-羟基-2-丁酮0.05％、结构未确定的未知物6.34％。该香兰素复合香味料作为卷烟加香的应用。本发明的天然复合香味料具有能与烟支较好谐调，明显提调烟香、细腻醇和烟气、改善卷烟吸味等优点。文档编号C11B9/00GK101157881SQ20071006591公开日2008年4月9日申请日期2007年5月29日优先权日2007年5月29日发明者张克勤,李雪梅,杨金奎,雯顾申请人:云南大学