专利名称：：高山松针活性提取物的制备方法及美白抗衰老活性化妆品的制作方法
技术领域：
：本发明涉及高山松针活性提取物以及具有美白和抗衰老功能的活性化妆品，尤其涉及一种从高山松针中提取美白和抗衰老活性提取物的制备方法，以及应用该提取物制备而成的具有美白和抗衰老活性的化妆品。
背景技术：
：青藏高原是藏医药学的发源地；是资源丰富的超高药源基地；是回归自然还我绿色药物的天然宝库；在主产种和特有种的数量上是世界上任何民族药都不可比拟的；活性成分含量高且无污染是国内外罕见的。高山松针由于青藏高原特殊的自然环境，而具备特有的生理特征和生态特征抗紫外辐射能力强；抗寒、抗旱性能强；光合作用有效物质积累高等。松针属松属植物的叶，其味苦，性温，归肝肾经。《本草纲目》中记载"松为百木之长，久服，固齿驻颜，肌肤玉泽，轻身不老"。据史料载述，神农黄帝时的雨师，中国药王、唐朝道教真人孙思邈，晋代浙江人皇初平兄弟等均因服食松叶、松子、松脂得以长寿至一百多岁。松针中含有丰富的营养成分、多种具有生物生理活性的成分，包括挥发油、粗蛋白、氨基酸、维生素、脂肪酸、可溶性糖和一些无机元素如钙、钾、铁、锌、磷、硒等，还含有黄酮、苷类(黄酮苷)等。氧化是伴随着生命活动的自然现象，人体在利用氧的过程中，会因各种内因和外因而产生各种活性氧和自由基，现代科学认为氧化与衰老息息相关。自由基学说是现代衰老学说中重要的一种。衰老或某些疾病与自由基损伤有关，过多的自由基损伤会加速细胞膜的脂质过氧化速度，引起生物膜结构的改变和膜脂流动性降低，进一步使Na+-K+-ATPaSe的构象改变，而后者也是膜的组份，最终导致该酶活性的降低，使机体发生退行性变化。松针能够显著增加老年大鼠抗氧化酶活性和总抗氧化能力，降低自由基代谢产物含量，提高组织膜酶的活性，改变膜脂流动性，表明松针可通过提高体内抗自由基能力、减少脂质过氧化，从而保护细胞膜的完整性和功能的正常发挥，起到延缓衰老的作用。目前对松针的研究与应用不断深入，但主要还是集中在食品、药用、保健方面，对于化妆品中的研究还很少，尤其将其应用于美白化妆品中的研究尚未见报道。
发明内容本发明的目的旨在提供一种高山松针活性提取物的制备方法及美白抗衰老活性化妆品，利用绿色植物的天然保护机制，从高山松针中提取具有美白、抗衰老活性的稳定成分，并将其应用于美白抗衰老活性化妆品中，开发高山松针的美白价值。本发明的技术解决方案是高山松针活性提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤I、将高山松针制成粉末；3II、按以下质量体积比将高山松针粉末加入到盛有乙醇水溶液的提取器中，每lg高山松针粉末使用15ml30ml乙醇水溶液，乙醇水溶液当中乙醇的质量浓度介于45%55%，然后在60°C85。C条件下浸泡提取1.5h2h，得到提取液；III、将步骤II制得的提取液冷却后过滤，并将滤液减压浓縮；IV、分别用石油醚和乙酸乙酯依次萃取步骤III制得的浓縮液，再将乙酸乙酯萃取液经减压浓縮、真空干燥成浸膏。进一步地，上述的高山松针活性提取物的制备方法，其中步骤II中，浸泡提取的次数可为两次，且将两次提取液合并后得到的过滤液，应用于后续制备步骤中。该浸泡制程可以按lg高山松针粉末与30ml乙醇水溶液的用量加入提取器，在75t:85t:条件下浸泡浸提1.52小时；也可以按lg高山松针粉末与15ml乙醇水溶液的用量加入提取器，在60°C75t:条件下浸泡浸提1.52小时。—种美白抗衰老活性化妆品，其特征在于该化妆品包含采用前述制备方法获得的高山松针活性提取物，具有抑制酪氨酸酶活性和抗氧化活性的功效。该化妆品的剂型包括但不限于水剂、霜剂、油剂、洗液或乳状液。与现有技术相比，本发明具有如下优点1、高山松针美白抗衰老活性提取物的提取方法简便易行，实验条件温和而且容易控制；2、高山松针资源丰富，成本低廉；美白抗衰老活性提取物制备过程中应用的有机溶剂全部为回收再利用。3、在上述制备工艺中经8(TC所提取出来的活性原料具有很好的高温稳定性，在化妆品配制的高、低温阶段均可添加，应用方便。具体实施例方式本发明从高山松针中提取美白抗衰老活性成分，具有抗自由基、美白的功能，从而应用于具有美白抗衰老功效的化妆品。本发明从高山松针中提取美白抗衰老活性成分的方法包括以下步骤I、将高山松针制成粉末；II、按以下质量体积比将高山松针粉末加入到盛有乙醇水溶液的提取器中，每lg高山松针粉末使用15ml30ml乙醇水溶液，乙醇水溶液当中乙醇的质量浓度介于45%55%，然后在60°C85。C条件下浸泡提取1.5h2h，得到提取液；III、将步骤II制得的提取液冷却后过滤，并将滤液减压浓縮；IV、分别用石油醚和乙酸乙酯依次萃取步骤III制得的浓縮液，再将乙酸乙酯萃取液经减压浓縮、真空干燥成浸膏。具体来看，步骤II中可以按lg高山松针粉末与30ml乙醇水溶液的用量加入提取器，控制75t:85t:条件下浸泡提取1.52小时；或者可以按lg高山松针粉末与15ml乙醇水溶液的用量加入提取器，控制6(TC75t:条件下浸泡提提1.52小时，将两次的提取液合并，以备后续制程之用。经实验反复验证，在上述步骤II的提取过程中，选用50%乙醇水溶液作为提取试剂、且在8(TC恒温条件下浸提制得的提取液效果最佳。采用上述方案获得的活性物具有良好的高温稳定性，实验人员对最终制成的浸膏，进行抗自由基、抑制酪氨酸酶活性检测，黑色素细胞黑色素产生的抑制测试，发现提取物具有较高的活性。其功效检测方法如下—、活性物抗自由基能力的体外检测方法1、准确称取20mgDPPH(1，1-二甲基苄基苯肼，C18H12N506)，用无水乙醇定容于250ml容量瓶，浓度2X10—4mol/L;2、取若干试管编号，参照表l，添加试剂。表1:试剂添加量(单位ml)组别DPPH样品提取溶剂空白o2.001.0样品溶液12.01.00样品溶液22.01.00样品溶液32.01.003、混合均匀，室温下(25t:或水浴25t:)反应10min后，测定517nm波长下的吸光度值。4、根据下式计算清除率清除率(％)=(l-A/A空白)X100XA空白空白对照在517nm波长下的吸光度值At:样品在517nm波长下的吸光度值5、以清除DPPH自由基50%的活性物浓度(IC50)来表征自由基清除剂的功效。抗DPPH自由基活性检测结果见表2。结果表明高山松针提取物有较强的DPPH自由基清除能力，其活性与Vc乙基醚、熊果苷相当。表2:各样品抗DPPH自由基活性检测结果高山松针提取物IC50(ug/mL)Vc乙基醚IC50(ug/mL)熊果苷IC50(ug/mL)4615200二、抑制酪氨酸酶活性的检测方法1、取四只试管分别标上1#、2#、3#、4#;2、参照表3，在四只试管内分别加入相应各列所列的反应液；3、振摇混匀，37t:预热10min;4、然后在各管分别加入酪氨酸酶溶液，37t:准确反应5min，迅速转移至比色皿中，于475nm处测吸光度值(A);5、酪氨酸酶抑制率的计算按下式计算对酪氨酸酶抑制率。抑制率=[1-(A3-A4)/(A1-A2)]X100%5式中Al、A2、A3、A4分别代表表3中1#、2#、3#、4#四个反应体系在步骤4中所测得的吸光度A^皿。表3:待测液的组成(单位ml)反应液1#2#3#4#酪氨酸溶液0.700.70美白剂溶液000.50.5美白剂的空白溶剂0.50.500PH6.8磷酸盐缓冲液0.81.50.81.56、以导致酪氨酸酶活力下降50X的抑制剂浓度(IC50)来表征抑制剂的功效。抑制酪氨酸酶活性检测结果见表4。结果表明高山松针提取物有较强的酪氨酸酶活性抑制能力，其活性亦与Vc乙基醚、熊果苷相当。表4:各样品抑制酪氨酸酶活性检测结果高山松针提取物IC50(mg/mL)Vc乙基醚IC50(mg/mL)熊果苷IC50(mg/mL)0.1031.350.17三、黑色素细胞测试1、小鼠B16黑色素细胞培养用含质量分数为10X小牛血清的1640培养液在37t:、5%C02的条件下培养B16黑色素细胞，细胞接种量为3Xl(f个/L，每3d传一次代。2、细胞增殖率的测定选择对数生长期的B16黑色素细胞，用0.25%胰酶消化，调整细胞浓度为2X104个/mL，接种于96孔培养板，每孔180iiL，置于37。C、5%C02的培养箱内培养24h。镜下观察生长状态良好，分别加入受试物20iiL/孔，继续培养48h。于结束前4h加入MTT30iiL/孑L4h后弃上清液，再加入DMSO150iiL/孔，振荡10min左右，用酶联免疫检测仪测定475nm波长处的吸光度。测试结果为三种活性物对黑色素细胞的增殖几乎均无抑制作用，对细胞增殖的抑制率均低于10%，即三种活性物基本无细胞毒性。[OOSO]3、细胞内酪氨酸酶活力测定取B16黑色素细胞接种于25cr^的培养瓶，接种量为2Xl()S个/瓶，培养48h后更换成加有受试物的培养基，继续培养48h，以不加活性物作为对照。0.25%胰酶消化后，用pH6.8的PBS(磷酸缓冲液)吹打成细胞悬液，低温离心后弃上清液，收获细胞团块。加入lmL0.5X的脱氧胆酸钠，冰浴15min，裂解细胞制备含酪氨酸酶提取液。取该6提取液0.5mL，于37t:预温后加入0.3X多巴溶液0.5mL，37"水浴反应5min，用紫外分光光度计在475nm处测定吸光度。测试结果为高山松针提取物的对酪氨酸酶的抑制率与Vc乙基醚、熊果苷相当。通过以上体外活性检测，发现本发明提取的高山松针提取物的美白、抗衰老活性，与Vc乙基醚、熊果苷相当，并且该活性物具有良好的热稳定性和光稳定性。四、人体美白实验按照本发明技术方案制得的高山松针提取物，可以作为美白和抗衰老化妆品的功效性原料，其使用形式没有特殊要求，它可以用于水剂、霜剂、油剂、洗液、乳状液等各种不同剂型的化妆品中。作为本发明应用的典型基质，涉及的已知物质有动植物油、矿物油、蜡、高级醇、脂肪醇、硅油、表面活性剂、磷脂、醇类、多元醇类、水溶性聚合物、油溶性聚合物类、矿物质、去离子水等，另外，根据需要可适当加入PH调节剂、抗氧化剂、螯合剂、颜料、防腐剂和香精等。此外，也可以与具有美白作用、抗衰老作用或者护肤功效性作用的其它活性成分结合使用，如防晒剂、血液循环促进剂、消毒剂、消炎剂、细胞活化剂、维生素类、氨基酸类、润湿剂、角质层分离剂。表5是应用本发明获得的高山松针提取物配制"膏霜"化妆品的具体配料组成。配制时，将表中组分A加热至83t:，溶化搅拌均匀，作为油相，将组分B放入容器加热至83t:，搅拌溶解成水相原料，油相原料加入水相原料中搅拌，乳化均质lmin后，继续搅拌冷却至45t:时，加入香精、防腐剂等，搅拌均匀，陈化24小时后即可灌装、包装、检验，制得本发明之实例产品。表5:"膏霜"配料<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>采用"双盲法"测试评价本发明的美白效果按照上述实例制备含有高山松针提取物的美白抗衰老产品、含熊果苷的产品以及不含高山松针提取物的基质，添加高山松针提取物的作为待测样品、添加熊果苷的作为对比样品、不添加活性物的作为空白样品，随机选择皮肤健康的成人前臂内侧3cmX3cm区域作为受试部位，共10人，检测空白膏体、添加不同浓度高山松针提取物的膏体、添加熊果苷的膏体的美白功效，受试者每天涂抹各样品早晚各一次，连续涂抹28天，每周用皮肤测试仪测定皮肤亮度变化、皮肤黑色素含量变化。结果表明随着松针提取物添加量的增加，皮肤美白效果先增强后减弱，这可能是因为松针提取物本身具有颜色，随着添加量的增加，化妆品膏体颜色逐渐加深，所以添加量与皮肤美白效果并不呈正相关。总体而言，添加量0.5%的松针提取物美白活性最强，完全可与2%熊果苷的美白活性相抗衡。本发明的有益效果是通过对自由基清除作用、酪氨酸酶抑制作用、黑色素细胞黑色素产生的抑制作用达成的，测试数据以及人体实验验证结果表明，采用本发明制备方法获得的高山松针活性提取物具有皮肤美白抗衰老功效。权利要求高山松针活性提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤I、将高山松针制成粉末；II、按以下质量体积比将高山松针粉末加入到盛有乙醇水溶液的提取器中，每1g高山松针粉末使用15ml～30ml乙醇水溶液，乙醇水溶液当中乙醇的质量浓度介于45％～55％，然后在60℃～85℃条件下浸泡提取1.5h～2h，得到提取液；III、将步骤II制得的提取液冷却后过滤，并将滤液减压浓缩；IV、分别用石油醚和乙酸乙酯依次萃取步骤III制得的浓缩液，再将乙酸乙酯萃取液经减压浓缩、真空干燥成浸膏。2.根据权利要求1所述的高山松针活性提取物的制备方法，其特征在于步骤II中所述浸泡提取的次数为两次，且步骤III中减压浓縮的原料为两次提取液合并后的过滤液。3.根据权利要求1所述的高山松针活性提取物的制备方法，其特征在于步骤II中，按lg高山松针粉末与30ml乙醇水溶液的用量加入提取器，在75°C85t:条件下浸泡提取1.5h2h。4.根据权利要求1所述的高山松针活性提取物的制备方法，其特征在于步骤II中，按lg高山松针粉末与15ml乙醇水溶液的用量加入提取器，在60°C75t:条件下浸泡提取1.5h2h。5.—种美白抗衰老活性化妆品，其特征在于该化妆品包含采用权利要求l所述制备方法获得的高山松针活性提取物，具有抑制酪氨酸酶活性和抗氧化活性的功效。6.根据权利要求5所述的美白抗衰老活性化妆品，其特征在于所述化妆品是水剂、霜剂、油剂、洗液或乳状液。全文摘要本发明涉及高山松针活性提取物的制备方法及美白抗衰老活性化妆品。高山松针经粉碎、提取、过滤、萃取分离、浓缩等步骤，获得美白和抗衰老活性提取物，然后将该提取物添加到化妆品中配制成具有美白抗衰老功能的化妆品。该高山松针提取物具有抑制酪氨酸酶、抗自由基等特性，具有美白和抗衰老的特殊功效。本发明所用原料天然，为可再生资源；制备工艺绿色安全、步骤简单独到，所得提取物稳定性好、使用方便、功效持久，可在化妆品制备过程中高、低温阶段均可添加。文档编号A61Q19/02GK101690705SQ200910034310公开日2010年4月7日申请日期2009年8月21日优先权日2009年8月21日发明者姚志蕊,张婷婷,肖韦,许至安,赵毅,陈婷婷,马立伟申请人:珈侬生化科技(中国)有限公司