专利名称：一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法
技术领域：
本发明涉及一种显微成像技术，特别涉及一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法。
背景技术：
共焦显微成像采用点光源照明，并用探测器之前的与光源成共轭关系的孔径来滤去焦外信号——“共焦”也就源于此。共焦成像的概念，是日本的Marvin Minsky教授于 1957年首次提出，他发明并建成了世界上第一个共焦扫描显微镜，共焦成像克服了传统荧光显微镜的空间和时间分辨率低、信噪比低、扫描速度慢等局限性。此后，各种共焦显微镜相继出现，如1970年的第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜，1990年的双光子激光扫描显微镜等。后又出现使用光子晶体光纤产生的超白光作激励光源的彩色共焦显微镜、三维数字共焦拉曼显微镜以及光纤耦合多路复用共焦显微镜等新型共焦显微镜。这些显微镜在继承和发展共焦显微成像技术的同时，提高了共焦显微成像的性能，如横向和纵向分辨率，扫描探测速度等。继波分复用荧光共焦成像概念被提出以后，频分复用荧光共焦显微成像的概念也被美国宾州州立大学的YIN教授小组研究并提出，但是所提出的实验基本系统是基于绿光波段激发的双通道系统，与多通道并行探测尚有距离。对于激光共焦扫描显微成像技术，虽然可以显著提高其纵向和横向分辨率，但是由于扫描系统的存在，大大降低了探测样品成像速度。虽然研究人员提出了各种各样的方案提高探测速度，例如采用微透镜阵列(DMD)系统，转盘系统等，也包括频分复用方法等实现多路并行探测的方案，可是现在的方案都具有各自局限性。例如降低了分辨率，或者增加了系统的体积，不利于集成等，因而阻止了系统的实际应用进程。但是，在生物探测领域，还是需要新方法和新技术实现集成式，快速地，并行地多点探测。
发明内容
本发明是针对现有传统的共焦显微镜的存在的问题，提出了一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，此多路频分复用荧光共焦显微成像系统具有高的空间分辨率和时间分辨率，并且能够实现多点荧光信号的并行的实时的高速探测。本发明的技术方案为一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，具体包括如下步骤
1)搭建四通道多频调制激光光路将准直半导体激光器发出的光束耦合进扩束镜，扩束镜出射的光束到达2X2式H-PDLC透镜阵列上进行分光和四个不同频率的斩波调制输出，并调节后端透镜阵列，使得透过透镜阵列的一级衍射光束聚焦，确定透镜阵列的焦平面位置F;
2)搭建四路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发部分光路将从透镜阵列出射的聚焦的四束光调整为平行光束射出，经过镜面耦合进入二向色镜组中，经二向色镜组激发的激光将耦合垂直入射无限远油浸显微物镜，将生物样品摆放于三维调整架之上，调整三维调整架的旋钮以改变生物样品与显微物镜间的距离，使样品恰好处于显微物镜焦平面上，光束将在物镜的作用下在生物样品上聚焦为四个光点，激发出荧光；
3)搭建四路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像由生物样品表面激发的荧光在样品与显微物镜相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线，反向通过显微物镜，成为平行光束， 达到二向色镜组，荧光全部从二向色镜透射出去，将这束荧光入射分光棱镜BS进行第二次分光，得到特性相同的两部分，其中一部分由消色差透镜会聚，并将CCD摄像机放置于透镜的焦平面上，探测荧光光束信号，在电脑显示屏上显示观察生物样品的显微成像；同时使从分光棱镜BS的另一个表面出射的荧光经光纤耦合器组耦合进入光纤阵列相当于共焦小孔的作用后，通过光纤输送到光电倍增管PMT中；
4)信号采集与处理部分的实现光电倍增管PMT将根据生物样品中激发得到的四个荧光点处的荧光强度的大小，将荧光点处的图像信号，通过光电转换，以电信号的形式输出，将光电倍增管PMT的输出端接电压放大电路，将PMT采集到的微弱信号进行电压放大， 再将电压放大电路的输出接入数据采集卡，最后由USB接口将信号数据送入计算机，通过 Matlab软件，编写程序，将调制荧光信号通过滤波器滤去高次谐波和部分噪音，并将经过调制的荧光信号相分离，按各自的调制频率进行解调后获取原始荧光信号，得到所需的样品 fn息ο所述H-PDLC透镜阵列是通过驱动电路驱动全息聚合物分散液晶(H-PDLC)光栅， 来实现斩波，调节驱动电路将连续强度的光信号调制为方波信号，正弦波信号，三角波信号或其他形状波形信号，经过调制的激发光能从生物样品的荧光标签激发出经过同样载波频率调制的荧光，从而使荧光信号具有了一定的频率特征，四个斩波通道分别设定不同的载波频率值，每个频率值均应满足奈奎斯特抽样定理，不得高于采样频率的一半，同时，任意两个信号的载波频率及它们的差必须要大于或等于最高信号频率的两倍以确保解调的两路信号能够解调开。所述步骤3)中荧光经光纤耦合器组耦合进入光纤阵列相当于共焦小孔的作用后，通过光纤输送到光电倍增管PMT中，得到的信号属于共焦扫描
显微信号，该共焦显微镜的横向分辨率八r和轴向分辨率Δ 分别表示为
权利要求
1.一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，其特征在于，具体包括如下步骤1)搭建四通道多频调制激光光路将准直半导体激光器(1)发出的光束耦合进扩束镜 (2)，扩束镜(2)出射的光束到达2X2式H-PDLC透镜阵列(3)上进行分光和四个不同频率的斩波调制输出，并调节后端透镜阵列(4)，使得透过透镜阵列的一级衍射光束聚焦，确定透镜阵列(4)的焦平面位置F;2)搭建四路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发部分光路将从透镜阵列出射的聚焦的四束光调整为平行光束射出，经过镜面(5)耦合进入二向色镜组(6)中，经二向色镜组 (6)激发的激光将耦合垂直入射无限远油浸显微物镜(7)，将生物样品(8)摆放于三维调整架之上，调整三维调整架的旋钮以改变生物样品(8)与显微物镜(7)间的距离，使样品(8) 恰好处于显微物镜(7)焦平面上，光束将在物镜的作用下在生物样品(8)上聚焦为四个光点，激发出荧光；3)搭建四路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像由生物样品(8)表面激发的荧光在样品与显微物镜相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线，反向通过显微物镜(7)，成为平行光束，达到二向色镜组(6)，荧光全部从二向色镜(6)透射出去，将这束荧光入射分光棱镜BS (9)进行第二次分光，得到特性相同的两部分，其中一部分由消色差透镜(10)会聚， 并将CXD摄像机(11)放置于透镜(10)的焦平面上，探测荧光光束信号，在电脑显示屏上显示观察生物样品的显微成像；同时使从分光棱镜BS (9)的另一个表面出射的荧光经光纤耦合器组耦合进入光纤阵列(14)相当于共焦小孔的作用后，通过光纤(15)输送到光电倍增管 PMT (16)中；4)信号采集与处理部分的实现光电倍增管PMT(16)将根据生物样品中激发得到的四个荧光点处的荧光强度的大小，将荧光点处的图像信号，通过光电转换，以电信号的形式输出，将光电倍增管PMT (16)的输出端接电压放大电路(17) JfPMT (16)采集到的微弱信号进行电压放大，再将电压放大电路的输出接入数据采集卡，最后由USB接口将信号数据送入计算机(18)，通过Matlab软件，编写程序，将调制荧光信号通过滤波器滤去高次谐波和部分噪音，并将经过调制的荧光信号相分离，按各自的调制频率进行解调后获取原始荧光信号，得到所需的样品信息。
2.根据权利要求1所述多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，其特征在于， 所述H-PDLC透镜阵列(3)是通过驱动电路驱动全息聚合物分散液晶(H-PDLC)光栅，来实现斩波，调节驱动电路将连续强度的光信号调制为方波信号，正弦波信号，三角波信号或其他形状波形信号，经过调制的激发光能从生物样品的荧光标签激发出经过同样载波频率调制的荧光，从而使荧光信号具有了一定的频率特征，四个斩波通道分别设定不同的载波频率值，每个频率值均应满足奈奎斯特抽样定理，不得高于采样频率的一半，同时，任意两个信号的载波频率及它们的差必须要大于或等于最高信号频率的两倍以确保解调的两路信号能够解调开。
3.根据权利要求1所述多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，其特征在于，所述步骤3)中荧光经光纤耦合器组耦合进入光纤阵列(14)相当于共焦小孔的作用后，通过光纤(15)输送到光电倍增管PMT (16)中，得到的信号属于共焦扫描显微信号，该共焦显微镜的横向分辨率A 和轴向分辨率A，分别表示为其中，Λ为所激发出的荧光的波长，J^i!表示显微物镜的数值孔径，？7为所探测样品的有效折射率。
4.根据权利要求1所述多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，其特征在于， 所述步骤4)中的解调具体过程为，先将调制信号与具有相同载波频率的余弦信号相乘，再通过低通滤波器滤去多余的频谱，即可得到原始信号。
全文摘要
本发明涉及一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，由多路频分复用荧光共焦显微镜和信号采集处理两大部分构成，采用关键部件--集成式电控液晶全息透镜阵列实现多路共焦调频，通过多路频分复用荧光共焦显微镜采集的信号先经由采集信号处理部分中的光纤及光纤耦合器组，经功率放大电路，再通过数据采集卡进行模数转换，经过对信号的傅里叶变换频谱信息，滤波，解调过程还原每个荧光点处发出的荧光信号随时间的强度变化，从而实现多点并行高分辨探测。具有横向分辨率、纵向分辨率、时间分辨率高的特点，并且实现了多点并行实时探测，具有便捷和实用的应用特点。
文档编号G02B27/09GK102354046SQ20111018513
公开日2012年2月15日 申请日期2011年7月4日 优先权日2011年7月4日
发明者周增军, 唐平玉, 庄松林, 蒋妍梦, 郑继红, 黄爱琴 申请人:上海理工大学