焦的图像。例如，如果载片130的一个区域稍微比其它区域更厚并且十个位置成像于该区域内，则在获取第一图像之后可能发现厚度的改变，并且可以在略微受调整的焦距处获取该区域内的其它位置处所拍摄的附加图像，以使用在此所描述的方法来补偿厚度的改变。
[0030]在一些示例中，可以通过1X物镜、0.5X光学耦合器以及2兆像素C⑶相机来获取低放大率图像。在一些示例中，可以通过50X物镜、IX光学耦合器和0.3兆像素、每秒200帧相机来获取高放大率图像。
[0031]在一些示例中，在成像位置处获取载片的黑白图像集合(在此称为图像的“堆叠”)。使用单个光波长(例如使用光源110的蓝色、绿色、黄色和红色LED中的每一个)获取集合中的每个图像。如果期望，可以从黑白图像集合创建彩色图像(例如彩色JPEG图像)，以用于显示的目的。在一些示例中，关于油浸或关于盖片的存在，并不校正物镜。集合中的每个图像受背景校正并且与集合中的图像彼此对准。如果在特定位置处通过特定色彩拍摄多于一个的图像，则选择这些图像之一(例如具有最佳焦点的图像)。可以在图像获取期间更新载片的焦平面的飞行(on-the-fly)估计。一个或多个成像模块处理图像集合，以产生可以用于确定生物标本的血液计数、白血细胞(WBC)差异和其它特性的测量。
[0032]以不同色彩的光来照射标本可以导致从所获取的图像提取不同信息。例如，在对包含血细胞的标本进行成像的情况下，细胞在不同色彩照射下可以显现得不同，由此方便更容易的标识、分类或区分。例如，归因于血红素的存在，红血细胞吸收显著量的蓝色光，用标准Romanowsky染剂染色的细胞核吸收黄色光。
[0033]参照图2，图像获取和处理受控于控制系统200。在所描述的示例中，控制系统200由单个计算机201实现。在一些示例中，可以通过多个计算机实现控制系统200。例如，控制系统200的一些模块可以由第一计算机实现，而控制系统200的其它模块可以由第二计算机实现。
[0034]硬件模块202将命令发送到成像硬件(其例如受控于成像模块216)，其进而将脉冲发送到相机160，以触发图像获取。所获取的图像传送到计算机(例如计算机201)。相机模块204将所获取的图像封装到堆叠中。
[0035]在载片成像的同时，聚焦模块206检查图像的每个堆叠，并且例如基于堆叠的图像的相对焦点得分来估计很可能已经在什么高度获取堆叠。聚焦模块206将这些高度估计报告给平面配合模块208。在对每个位置进行成像之前，硬件模块202向平面配合模块208询问该位置处的焦平面估计。这种通过图像获取更新焦平面估计的机制可以由成像系统100或成像模块216或二者用于适配载片的表面的不规则性。在一些实例中，例如归因于焦平面估计的流水线操作，载片不规则性的自适应响应中可能存在延时。
[0036]配准模块210和拾取配准帧模块212可用于匹配低放大率图像与高放大率图像之间的坐标系统。因此，例如，在低放大率成像期间所发现的任何对象可以得以精准地定位，并且在高放大率成像期间得以成像。
[0037]对准模块214提供用于对准堆叠的图像的能力。在一些实例中，例如，归因于载片移动、略微偏心LED管芯、透镜的光学效应或其它因素，堆叠的原始图像并未彼此对准。此夕卜，在低放大率之下，如果透镜并未完美地色彩校正，则不同照射色彩下获取的图像可能均具有略微不同的放大率。在高放大率下，四个色彩的标度可能是相同的，但图像可能仍然是失准的。在一个示例中，为了对准低放大率图像，可以使用这样的算法:在目标图像中选择高对比度结合(tie)点(例如细胞)集合，在第二图像中定位相同结合点(例如细胞)，并且变换第二图像以将第二图像与目标图像对准。在一个示例中，为了对准高放大率图像，算法可以尝试像素的有限范围内的所有偏移，并且针对每个色彩选择使得与目标色彩的图像(例如与绿色图像)的R2相关性最大化的偏移。
[0038]图像、图像的分析结果或二者可以显示在用户接口(例如图形用户接口(GUI) 218)上。图像、图像的分析结果或二者可以由记录模块220记录，并且存储在文件、数据库222或其它存储位置中。
[0039]在一些示例中，当例如没有载片就位的情况下对成像系统100进行初始化时，可以执行校准。校准可以包括空白图像获取和初始快门调整。在一些示例中，对于每个载片，例如使用仅耗费一秒的小部分的快速调整算法，可以执行焦点搜索以确定载片的倾斜。
[0040]图像处理
[0041]可以对使用成像系统100所获取的图像的堆叠执行各种类型的图像处理。例如，处理低放大率图像可以包括:对红血细胞(RBC)进行计数；对血液成分(例如白血细胞(WBC)和有核红血细胞(nRBC))进行定位并且计数；对血小板进行计数；其它类型的处理。例如，高放大率图像的处理可以包括:表征RBC的特征；计算WBC差异JtWBC进行分类；其它类型的处理。
[0042]再次参照图2，在一些示例中，用实现控制系统200的计算机201所实现的图像处理模块250运行图像处理。在一些示例中，用不实现控制系统200的任何模块的不同计算机实现图像处理模块250。
[0043]低放大率图像的处理
[0044]在一个示例中，可以处理低放大率图像，以对RBC进行计数。RBC可以具有各种大小(例如，RBC可以是大的、小的、或片段的)。RBC也可以具有各种外观(例如，RBC可以具有大的或小的苍白的或异常的形状)。为了考量这些变化，应用滤波器(在此称为“斑点滤波器”)，其将每个RBC变换为更小的暗斑点，而无论其大小或苍白。变换后的斑点可以比初始的变化的RBC的图像更易于计数。在一些实例中，斑点滤波器可以仅应用于图像的堆叠中的蓝色图像，这是因为白细胞在蓝色图像中几乎是不可见的。滤波后的图像可以受处理，以对RBC进行计数，包括:掩蔽粉尘、碎肩和其它污染物；对图像进行平滑；确定RBC的平均面积，对图像中的斑点进行计数；拒绝赝像(例如染色碎肩)；基于“粉尘面积”来调整计数。
[0045]在一个示例中，低放大率图像可以受处理，以定位WBC和nRBC。WBC可以在低放大率成像期间得以定位，并且在一些示例中，可以在高放大率成像期间得以重新访问。参照图3，通过定位近似为核或核片段的适宜的大小的蓝色斑点来处理低放大率图像(300)。定位对于细胞质适宜的色彩的图像的区域(302)。对约束到细胞质边界内的核图像执行距离变换(304)。执行具有大小限制的分水岭(watershed)变换(306)，以划分触摸细胞质。然后可以例如使用标识五个正常WBC类型——血小板、nRBC、双WBC、受损的WBC和赝像(例如染色碎肩)一一的十部分分类器来分配细胞类型(308)。一旦已经执行分类，就执行细胞计数(310)，并且可以选择用于高放大率的兴趣位置(312)。
[0046]在一个示例中，可以处理低放大率图像，以对血小板进行计数。可以通过以下操作来对血小板进行定位并且计数:对于RBC使用上述滤波器计数方法，但将斑点滤波器应用于黄色和蓝色图像并且跳过已经标识为WBC的对象之下的面积。分类器可以用于区分血小板与赝像，以确定血小板的最终计数。
[0047]高放大率图像的处理
[0048]高放大率成像提供用于比低放大率成像中更接近地检查细胞的能力。在一些示例中，WBC的高放大率可以用于对WBC进行分类。在一些示例中，RBC或血小板的高放大率图像可以用于表征RBC或血小板。
[0049]在一个示例中，高放大率图像可以受处理，以表征RBC的特征，例如均值细胞体积(MCV)、血红素含量(MCH)、网织红血球百分比或其它特征(例如全血液计数(CBC)的其它元素)。对于这些表征，可以在高放大率之下对大量RBC进行成像(例如至少大约10，000RBC)。在RBC聚合是随机的假设之下，可以选择单个非重叠RBC的高放大率图像，以用于测量。
[0050]可以根据九个特征的加权和来计算MCV和MCH:RBC的面积、关于四个成像色彩中的每一个的RBC的整体光学密度以及关于四个成像色彩中的每一个的RBC的体积测量。可以通过分析所成像的RBC中的每一个内的蓝色含量的等级来确定网织红血球百分比。可以根据(依据例如如上所述的低放大率成像所确定的)RBC计数、样本的MCH和MCV来确定CBC的其它元素。
[0051]RBC的高放大率图像的附加特征可以用于确定RBC中的包括的潜在存在性，以评估RBC形状或执行RBC的其它表征。可以对具有潜在包括、异常形状或二者的特定RBC进行标记，以用于呈现给用户。例如，具有潜在包括的RBC可以显示在RBC图库中。例如，具有异常形状的RBC可以被分配对应于它们的形状的值，允许图库中的RBC按形状受挑选。
[0052]在一个示例中，可以处理高放大率图像，以确定WBC差异。可以基于用于WBC核和细胞质的分段来确定精确WBC差异。WBC核通常染上相同色彩或相似色彩，并且因此可以相对容易地得以识别。细胞质可以染上很多不同色彩，并且在一些情况下可以几乎是透明的。此外，WBC —般聚合；以获得精确WBC差异，可以单独地对聚合中的WBC进行计数。
[0053]参照图4，为了处理高放大率图像以确定WBC差异，定位细胞质材料(400)。所聚合的WBC受分离(402)。对WBC的核进行分段(404)。为了考量