专利名称：检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的基因芯片及使用方法、试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种生物技术领域的基因芯片，更具体的，本发明涉及一种检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的基因芯片及使用方法、试剂盒。
背景技术：
遗传性代谢病(inborn errors of metabolim, IEM)是因维持机体正常代谢所必需的由多肽和/或蛋白組成的酶、受体、载体及膜泵生物合成发生遗传性缺陷及编码这类多肽(蛋白)的基因发生突变而导致的一組疾病。大多为单基因病，属常染色体隐性遗传， 总的发病率约0. 5% 1%。随着人们对此类疾病认识的加深及实验分析技术的发展，该病的诊断率明显上升，目前已达四五千种。此类疾病种类繁多，涉及到糖类、氨基酸、脂类等的代谢紊乱，临床症状多种多祥，目前临床诊断主要依靠于生化检查及氨基酸、有机酸分析等，只有少数医院和研究机构可以对其中的某些疾病进行基因诊断。而患者出现临床改变时往往已经严重影响了其生存质量，所以常规的检查方法无法对遗传代谢病进行早期诊断和产前诊断。高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia，ΗΡΑ)是最常见的常染色体隐性遗传的氨基酸代谢紊乱疾病，主要由四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin deficiency, BH4)缺乏所致。四氢生物蝶呤缺乏症是由于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸羟化酶的辅助因子BH4合成或代谢障碍所致，不但影响苯丙氨酸羟化酶的活性，引起苯丙氨酸代谢障碍而在体内蓄积，同时影响脑内单胺神经递质，如多巴胺、5-羟色胺的合成，患儿出现严重的精神系统损害症状和体征，如运动障碍、肌张カ异常、顽固性抽痉、肢体震颤、智能障碍等。如果仅给予低/无苯丙氨酸饮食治疗，血苯丙氨酸浓度虽然能降至正常，但神经系统症状日趋严重，预后极差。所以将四氢生物蝶呤缺乏症与经典型PKU进行区分具有重要的临沐思义。BH4是由三磷酸鸟苷在三磷酸鸟苷环化水解酶(GTPCH)、6_丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶(PTPS)和墨蝶呤还原酶(SR)的作用下合成，參与芳香族氨基酸羟化酶的催化反应后，BH4被氧化为蝶呤-4a-ニ甲醇胺，再由蝶呤-4a-ニ甲醇胺脱水酶(P⑶)和ニ氢蝶呤还原酶(DHPR)还原为具有活性的BH4。上述任一种酶的缺乏均可导致BH4缺乏症，而6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶(PTPS)缺乏是BH4缺乏中最常见的类型。编码6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶(PTPS)的基因是PTS基因，定位于llq22. 3-23. 3，mRNA长921bp，包含6个外显子，具有功能的PTPS是由两个三聚体构成的环状结构，有6个活性中心，其催化BH4的合成需要镁离子和锌离子的共同作用。目前已报道44种PTS基因突变类型，包括40种错义/ 无义突变，5种剪切突变，7种插入/缺失。目前对HPA进行分型的方法一般是BH4负荷试验、尿蝶呤谱分析、DHPR活性測定等。随着编码6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶和ニ氢蝶呤还原酶基因分别于1992年和1987年克隆定位，使用6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶基因诊断HPA的报道也越来越多。然而，现在尚无ー种快速、低成本、大通量和自动化检测PTS基因突变的方法。因此，需要一种新的技术方案来克服现有技术的上述缺陷和不足。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的基因芯片及使用方法、试剂盒。本发明的基因芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，时间短，成本低，适用于临床患者基因突变检测和正常人杂合子携帯者检測。本发明的目的通过以下技术方案实现，第一方面，本发明涉及一种检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述探针为SEQ ID NO. 1づ4所示的核苷酸序列。优选地，所述固相载体选自载玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯中的ー种。第二方面，本发明还涉及应用前述基因芯片检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的方法，包括多重PCR扩增，所述的多重PCR扩增特异性引物为SEQ ID NO. 59-60 所示的核苷酸，SEQ ID NO. 61-62 所示的核苷酸，SEQ ID NO. 63-64 所示的核苷酸，SEQ ID NO. 65-66 所示的核苷酸，SEQ ID N0. 67-68 所示的核苷酸，SEQ ID N0. 69-70 所示的核苷酸。第三方面，本发明还涉及ー种用于检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的试剂盒，所述试剂盒包括前述基因芯片，所述基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述探针为SEQ ID N0. 1づ4所示的核苷酸序列。本发明具有如下的有益效果本发明的基因芯片操作步骤简単，只需要进行一次多重PCR反应和连接酶反应，杂交扫描即可；检测特异性高，稳定性好，该芯片可正确区分各个位点的纯合子和杂合子，多次试验重复性高；时间短，从样本抽提到得到扫描结果可在一天内完成；采用通用芯片技木，固相载体也可通用于其他芯片，有效降低了成本，适用于临床患者基因突变检测、产前诊断和正常人杂合子携帯者检测。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解为这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册见New York Cold Spring Harbor Laboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、基因芯片及其制造方法本实施例的基因芯片，所述基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述探针为SEQ ID N0. 1づ4所示的核苷酸序列，其中固相载体为载玻片。
所述基因芯片的制备方法，包括如下步骤(1)将玻片用双蒸水洗浄，在碱液中浸泡过夜，取出后用双蒸水清晰3遍，再于体积分数为的HCl中浸泡30分钟，清洗后置于玻片缸中待用。将清洁后的玻片经过4-氨丁基三乙氧基硅烷溶液氨基化处理，再经苯异硫氰酸酯溶液进行异硫氰基化处理，用氮气吹干后，放于4°C避光保存；(2)芯片Zip探针(SEQ ID NO. 1-54所示的核苷酸序列)是随机組合的长度为 24bp的寡核苷酸片段，将这些寡核苷酸序列利用NCBI网站上的BLAST功能与目的基因组序列进行同源性比较，选择其中同源性程度最低的一组作为Zip探针序列。位点特异性探针长度不等，需保证其Tm值基本保持一致，以确保后续反应的均一性；(3)将合成好的Zip探针溶解于点样液中，将探针溶液转移到对应的96孔板内，使用GMS417点样仪，运行相应程序将探针点到活化好的固相载体上，置于37°C，90%湿度的恒温恒湿箱中过夜，使探针与玻片充分交联。固定好的固相载体在氨水中封闭反应的活性基团，可以储存于4°C以备下步杂交实验用。2、基因芯片的使用方法使用前述的基因芯片进行6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的检测，包括如下步骤(1)突变检测位点的选择，需要进行检测的18个突变位点及探针核心序列如表1。表 权利要求
1.一种检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其特征在干，所述探针为SEQ ID NO. 1づ4所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的基因芯片，其特征在于，所述固相载体选自载玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯中的ー种。
3.ー种应用权利要求1所述基因芯片检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的方法，包括多重PCR扩增，其特征在干，所述的多重PCR扩增特异性引物为SEQ ID NO. 59-60所示的核苷酸， SEQ ID NO. 61-62所示的核苷酸， SEQ ID NO. 63-64所示的核苷酸， SEQ ID NO. 65-66所示的核苷酸， SEQ ID NO. 67-68所示的核苷酸， SEQ ID NO. 69-70所示的核苷酸。
4.ー种用于检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的试剂盒，其特征在干，所述试剂盒包括权利要求1所述的基因芯片，所述基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述探针为SEQ ID NO. 1づ4所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种生物领域的检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的基因芯片及其检测方法和试剂盒，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中探针为SEQ ID NO.1-54所示的核苷酸序列，检测方法中包括多重PCR扩增，其中特异性引物为SEQ ID NO.59-70所示的核苷酸序列。本发明的基因芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，从样本抽提到得到扫描结果可在一天内完成，成本低，适用于临床患者基因突变检测、产前诊断和正常人杂合子携带者检测。
文档编号C40B40/06GK102533988SQ20111044064
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者沈陆, 秦胜营, 许姗姗, 贺林, 顾学范 申请人:上海交通大学