一种以胶原蛋白为生物矿化模板制备Fe2O3纳米粒子的方法与流程

本发明涉及Fe₂O₃纳米粒子制备方法，具体涉及一种以胶原蛋白为生物矿化模板制备Fe₂O₃纳米粒子的方法，属于生物无机材料制备技术领域。

背景技术：

生物矿化是指生物体通过生物大分子的调控作用生成无机矿物质的过程，它是链接无机与生物之间的桥梁。与一般矿化最大的不同在于，它是生物在特定的部位，在一定的物理化学条件下，在生物有机物质的参与控制或影响下，将溶液中的离子转变为固相矿物的过程。像骨骼，鳞片，牙齿等的形成都是自然界中比较常见的生物矿化过程。与工业生产条件不同，生物矿化不需要苛刻的条件，它是一个条件温和、低耗能且无污染的物理化学过程。生物矿化采用了自然界中比较简单且常见的组分，并且可以实现对样品从成核到结晶过程的调控。因此，探索并模仿生物矿化中无机物在生物分子调控下的矿化机理，能为制备具有独特结构和性能的复合材料提供新的视角。

α型三氧化二铁(α-Fe₂O₃)是一种很重要的金属氧化物，由于其无毒，无环境污染，成本低廉等特点，在闪光涂料、塑料、电子材料以及生物医学工程等方面都有广泛的应用。现在已经建立了α-Fe₂O₃纳米材料的多种合成方法，包括：(1)使用三氯化铁和草酸为原料首先合成氧化铁的初级结构，然后再通过高温锻烧合成中空的梭形和球形结构α-Fe₂O₃；(2)使用三氯化铁和四丁基漠化钱在碱性条件下，经过后处理制备花状α-Fe2O3纳米结构。这些方法有的需要在合成过程中添加有毒有害的化学试剂，有的需要经过升温去除溶剂或摸板等后处理才能得到产物，都相对比较复杂，并且存在耗时耗能和成本较高的缺点。同时，由于目前对α-Fe₂O₃纳米颗粒形貌和尺寸可控性的基础研究仍不够系统和充分，因此为满足不同需求，采用简单、易控、绿色环保的方法来调控α-Fe₂O₃纳米颗粒的形貌和尺寸具有十分重要的意义。

胶原蛋白是细胞外基质的主要组成成分，几乎分布在所有的组织器官中，它在哺乳动物中含量高达总蛋白量的四分之一。胶原蛋白具有良好的生物相容性，生物降解性，吸收性以及促进细胞形成等诸多功能，因此，在生物医用材料、组织工程、化妆品、食品等领域具有广泛的应用。本发明采用重组胶原蛋白作为生物模板，六水合三氯化铁作为原料，通过水热方法，制备了大小和形貌可控的α-Fe₂O₃纳米材料。本发明在整个合成过程中无需添加任何其他化学试剂或进行后处理，简单方便，易于操作，具有相当的可行性和应用价值，可为规模化生产α-Fe₂O₃纳米材料提供基础。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种以胶原蛋白为生物矿化模板制备Fe₂O₃纳米粒子的方法，采用动物体内含量最多的蛋白质胶原蛋白作为生物模板，六水合三氯化铁作为原料，通过水热方法，制备了大小和形貌可控的α-Fe₂O₃纳米材料。

为实现上述目的，本发明公开了如下技术方案：

一种以胶原蛋白为生物矿化模板制备Fe₂O₃纳米粒子的方法，包括如下步骤：

(1)利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白

①、确定重组胶原蛋白的序列；

重组胶原蛋白的序列为：

GSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTGLAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRGEQGPQGLPGKDGEAGAQGRPGKRGKQGQKGEKGEPGTQGAKGDRGETGPVGPRGERGEAGPAGKDGERGFPGERGVEGQNGQDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQDGKDGLPGKDGKDGLPGKDGKDGQPGKPGKYGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP，该重组胶原蛋白具备良好的三重螺旋结构，热变温度接近37℃；具有整合素的结合位点GERGFPGERGVE，可以与细胞很好的粘附；具有肝素的结合位点GRPGKRGKQGQK，可以与肝素结合；

②、合成编码重组胶原蛋白的核酸；

合成编码步骤①重组胶原蛋白的核酸，构建导入上述核酸的质粒，并将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株；

③、重组胶原蛋白的制备与纯化；

将冰冻在-80℃的大肠杆菌感受态细胞置于冰浴中融化，将感受态细胞与3-5ul质粒混合，混合体在冰浴中30min后再放入42℃水浴中90s，然后再放入冰浴中2min；在上述混合体中加入1ml不含抗生素的LB培养基，再放置于37℃恒温摇床中1hrs，然后在4℃，4000rpm条件下离心20min，弃去上层清液；使细菌在剩余培养液中重新悬浮后，将培养液均匀涂布到37℃的AMP培养平板上，置于37℃恒温摇床中过夜培养；次日挑取长势较好的菌落放入100ml含抗生素的LB液体培养基中，恒温摇床过夜进行增菌培养；将100ml过夜培养的细菌倒入1L LB培养基中，在37℃恒温摇床中继续扩增培养；待OD值达到0.8-1范围，将摇床温度调为25℃，加入1mM IPTG诱导表达，恒温过夜培养；

将上述蛋白已表达的细菌在低温离心机中离心，使菌体与培养基分离，离心条件：12000rpm，4℃，离心1.0-3.0min；将离心后的菌体用A缓冲液溶解，A缓冲液为20mM咪唑，20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，pH为7.4；将细菌悬浊液放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，即可释放出蛋白并且蛋白会溶于A缓冲液中；超声时需将细菌悬浊液放于冰浴中，以防温度过高导致蛋白变性；将破碎完的悬浊液再次离心，使细胞碎片与蛋白溶液分离，离心条件：14000rpm,4℃，30-50min；收集上清液，此即为粗蛋白溶液；将粗蛋白过滤后，通过液相色谱进行进一步纯化；后经冻干，得到白色絮状固体；此固体放于-20℃冰箱保存，使用时通过称重法标定浓度。

(2)α-Fe₂O₃纳米材料的制备

①、重组胶原蛋白与六水合三氯化铁均匀混合溶液的配制；

在1ml水中加入1-50mg六水合三氯化铁和0-10mg胶原蛋白固体，混合均匀，缓慢搅拌5-90min后，得到淡黄色透明且均匀的液体；

②、利用水热反应釜制备纳米级α-Fe₂O₃；

将所得混合液倒入5ml水热反应釜中，放入马弗炉内以3-18℃/min的速度升温至120-200℃，并在该温度下反应1-15hrs；

③、纯化并干燥保存制备的纳米材料；

待水热反应釜冷却到室温后，将产物通过离心分离，离心条件为1200r，弃去上清液，留下固体；并用去离子水分散固体，再离心纯化3-5次，在50-80℃恒温干燥箱中干燥。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤③纯化后得到的重组胶原蛋白的纯度达到95％以上。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤(2)中所述的胶原蛋白固体加入量为0.1-5mg，胶原蛋白质量分数为0.01-0.5wt％。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤(2)中所述的六水合三氯化铁固体加入量为2.7-27mg，铁(III)的浓度分布从0.01到0.1mol/L。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤(2)中所述的六水合三氯化铁和胶原蛋白混合液缓慢搅拌时间为20-50min。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤(2)中所述的混合液在马弗炉内以3-10℃/min的速度升温至140-180℃，并在该温度下反应6-12hrs。

本发明公开的一种以胶原蛋白为生物矿化模板制备Fe₂O₃纳米粒子的方法，具有以下优点：在整个合成过程中无需添加任何其他化学试剂或进行后处理，简单方便，易于操作，具有相当的可行性和应用价值，可为规模化生产α-Fe₂O₃纳米材料提供基础。

附图说明

图1为制备的α-Fe₂O₃纳米材料的粉末X射线多晶衍射(XRD)图；

图2为制备的α-Fe₂O₃纳米材料的X射线光电子能谱(XPS)图；

图3为制备的α-Fe₂O₃纳米材料的热重分析(TGA)图；

图4为制备的α-Fe₂O₃纳米材料的扫描电镜，透射电镜，电子衍射以及能量散射X射线分析图；

图5为不同浓度的重组胶原蛋白对α-Fe₂O₃纳米颗粒结构的影响；

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

如图1-图5所示，一种以胶原蛋白为生物矿化模板制备Fe₂O₃纳米粒子的方法，包括如下步骤：

(1)利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白

①、确定重组胶原蛋白的序列；

重组胶原蛋白的序列为：

GSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTGLAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRGEQGPQGLPGKDGEAGAQGRPGKRGKQGQKGEKGEPGTQGAKGDRGETGPVGPRGERGEAGPAGKDGERGFPGERGVEGQNGQDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQDGKDGLPGKDGKDGLPGKDGKDGQPGKPGKYGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP，该重组胶原蛋白具备良好的三重螺旋结构，热变温度接近37℃；具有整合素的结合位点GERGFPGERGVE，可以与细胞很好的粘附；具有肝素的结合位点GRPGKRGKQGQK，可以与肝素结合；

②、合成编码重组胶原蛋白的核酸；

合成编码步骤①重组胶原蛋白的核酸，构建导入上述核酸的质粒，并将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株；

③、重组胶原蛋白的制备与纯化；

将冰冻在-80℃的大肠杆菌感受态细胞置于冰浴中融化，将感受态细胞与3-5ul质粒混合，混合体在冰浴中30min后再放入42℃水浴中90s，然后再放入冰浴中2min；在上述混合体中加入1ml不含抗生素的LB培养基，再放置于37℃恒温摇床中1hrs，然后在4℃，4000rpm条件下离心20min，弃去上层清液；使细菌在剩余培养液中重新悬浮后，将培养液均匀涂布到37℃的AMP培养平板上，置于37℃恒温摇床中过夜培养；次日挑取长势较好的菌落放入100ml含抗生素的LB液体培养基中，恒温摇床过夜进行增菌培养；将100ml过夜培养的细菌倒入1L LB培养基中，在37℃恒温摇床中继续扩增培养；待OD值达到0.8-1范围，将摇床温度调为25℃，加入1mM IPTG诱导表达，恒温过夜培养；

将上述蛋白已表达的细菌在低温离心机中离心，使菌体与培养基分离，离心条件：12000rpm，4℃，离心1.0-3.0min；将离心后的菌体用A缓冲液溶解，A缓冲液为20mM咪唑，20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，pH为7.4；将细菌悬浊液放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，即可释放出蛋白并且蛋白会溶于A缓冲液中；超声时需将细菌悬浊液放于冰浴中，以防温度过高导致蛋白变性；将破碎完的悬浊液再次离心，使细胞碎片与蛋白溶液分离，离心条件：14000rpm,4℃，30-50min；收集上清液，此即为粗蛋白溶液；将粗蛋白过滤后，通过液相色谱进行进一步纯化；后经冻干，得到白色絮状固体；此固体放于-20℃冰箱保存，使用时通过称重法标定浓度。

(3)α-Fe₂O₃纳米材料的制备

①、重组胶原蛋白与六水合三氯化铁均匀混合溶液的配制；

在1ml水中加入1-50mg六水合三氯化铁和0-10mg胶原蛋白固体，混合均匀，缓慢搅拌5-90min后，得到淡黄色透明且均匀的液体；

②、利用水热反应釜制备纳米级α-Fe₂O₃；

将所得混合液倒入5ml水热反应釜中，放入马弗炉内以3-18℃/min的速度升温至120-200℃，并在该温度下反应1-15hrs；

③、纯化并干燥保存制备的纳米材料；

待水热反应釜冷却到室温后，将产物通过离心分离，离心条件为1200r，弃去上清液，留下固体；并用去离子水分散固体，再离心纯化3-5次，在50-80℃恒温干燥箱中干燥。

其中，步骤③纯化后得到的重组胶原蛋白的纯度达到95％。

其中，步骤(2)中所述的胶原蛋白固体加入量为1mg，胶原蛋白质量分数为0.1wt％。

其中，步骤(2)中所述的六水合三氯化铁固体加入量为16mg，铁(III)的浓度分布从0.06mol/L。

其中，步骤(2)中所述的六水合三氯化铁和胶原蛋白混合液缓慢搅拌时间为30min。

其中，步骤(2)中所述的混合液在马弗炉内以5℃/min的速度升温至160℃，并在该温度下反应10hrs。

以上所述为本发明的一个示范性实施案例的细节。对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。