本发明涉及微生物菌肥，具体涉及防治棉花黄萎病的微生物菌肥及其使用方法。
背景技术：
微生物菌肥是一种新型肥料，具有低炭、纯天然、无毒、无害、无污染的特点。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的土传性维管束真菌病害，严重影响棉花产量和纤维品质。棉花黄萎病是一种土传真菌病害，初侵染源为存活在土壤中的微菌核，其能在土壤中存活长达15年之久。从棉花的内生真菌入手，分离筛选对黄萎病菌具有抑制活性的菌株，通过微生物菌肥的方式调控土壤的微生物群落结构，达到防控黄萎病的效果，是值得探讨的棉花黄萎病防治的新途径。
目前，将生防菌制作成微生物菌肥主要存在以下几个方面的技术困难：①生防菌需要在有机质中定殖率低。②生防菌在有机质物质中易失活。③难以保证生防菌的活体浓度，从而导致病害的防治效果较差。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种以棉花内生真菌cef08111为生防菌，通过与羊粪发酵，作为微生物菌肥，从而可以有效防治棉花黄萎病。
根据本发明的防治棉花黄萎病的微生物菌肥，所述微生物菌肥由棉花内生真菌cef08111与有机肥发酵而成，其制备方法包括以下步骤：
1)制备种子液：将所述的cef08111接种于液体培养基中，培养至其分生孢子浓度大于1×107个/ml，得到种子液；
2)制备微生物菌种：将10份玉米粉中加入2～3份开水混匀后浸泡，加入粒后混匀，灭菌，冷却后，接入10～15ml浓度为1×107个/ml的悬浮孢子液，混匀后置于25℃发酵，得微生物菌种；
3)制备微生物菌肥：将微生物菌种按0.5～0.8‰与有机肥混匀后置于阴凉处发酵，发酵堆厚度为30～40cm，控制发酵堆温度为25～30℃，得微生物菌肥。
根据本发明的具体实施方式的防治棉花黄萎病的微生物菌肥，由棉花内生真菌cef08111与羊粪发酵而成，其制备方法包括以下步骤：
1)制备种子液：将所述的cef08111接种于czapek液体培养基中，25℃，150r/min，培养5d，其分生孢子浓度大于1×107个/ml时，此时悬浮孢子液即为种子液；
2)制备微生物菌种：将10份玉米粉中加入2～3份开水混匀后浸泡30min，加入3～4份沙粒(v：v)后混匀，高压灭菌30min；冷至室温后，每袋接入浓度为1×107个/ml悬浮孢子液10～15ml，混匀后置于25℃培养室中发酵，发酵时间一周，得微生物菌种；
3)制备微生物菌肥：将微生物菌种按0.5～0.8‰与有机肥混匀后置于阴凉处发酵，该接种比例能够保证微生物菌肥在有机肥中快速繁殖，发酵堆厚度为30～40cm，可以避免生防菌失活，上面覆盖双层遮阳网，避免阳光直射，控制发酵堆温度在25～30℃，利用生防菌的生长，翻堆频率为1次/周；当有机肥中布满白色菌丝后，得微生物菌肥。
根据本发明的具体实施方式提供了一种防治棉花黄萎病的微生物菌肥的使用方法，所述方法包括以下步骤：整地前，将微生物菌肥均匀撒至地表，用量为3～4m3/亩，然后翻地，深度30cm为宜，一周后即可播种。
本发明的防治棉花黄萎病菌微生物菌肥能够显著减轻棉花黄萎病的发生。生防菌可以均匀的在有机质中定殖，有效浓度高，防治效果好，经温室苗期试验对棉花黄萎病的防治效果达74.1％，对棉花黄萎病的防治具有巨大的潜能，还可以可减少农田污染，且能改善土壤结构，减少化学肥料使用，生防菌菌株培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1为cef08111在玉米沙粒培养基上生长情况；
图2为cef08111菌种与羊粪发酵后的微生物菌肥。
图3为田间施用cef08111微生物菌肥后棉花生长情况，a：处理；b：空白对照。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1微生物菌种的制备
1)制备种子液：将保存于-80℃冰箱中的cef08111在pda平板中活化，1周后挑取少量菌丝块接种于czapek液体培养基中，25℃，150r/min，培养5d，其分生孢子浓度大于1×107个/ml时，此时悬浮孢子液即为种子液；
2)制备微生物菌种：
处理1：将1.0kg玉米粉中加入0.2kg开水混匀后浸泡30min，加入0.3kg沙粒后混匀，装入聚丙烯菌种袋(15×55cm)，每袋装0.5kg，用海绵双套环封口，高压灭菌30min；冷至室温后，每袋接入浓度为1×107个/ml悬浮孢子液10ml，混匀后置于25℃培养室中发酵。
处理2：将1.0kg玉米粉中加入0.25kg开水混匀后浸泡30min，加入0.3kg沙粒后混匀，装入聚丙烯菌种袋(15×55cm)，每袋装0.5kg，用海绵双套环封口，高压灭菌30min；冷至室温后，每袋接入浓度为1×107个/ml悬浮孢子液10ml，混匀后置于25℃培养室中发酵。
处理3：将1.0kg玉米粉中加入0.3kg开水混匀后浸泡30min，加入0.3kg沙粒后混匀，装入聚丙烯菌种袋(15×55cm)，每袋装0.5kg，用海绵双套环封口，高压灭菌30min；冷至室温后，每袋接入浓度为1×107个/ml悬浮孢子液10ml，混匀后置于25℃培养室中发酵。
处理4：将1.0kg玉米粉中加入0.25kg开水混匀后浸泡30min，加入0.35kg沙粒后混匀，装入聚丙烯菌种袋(15×55cm)，每袋装0.5kg，用海绵双套环封口，高压灭菌30min；冷至室温后，每袋接入浓度为1×107个/ml悬浮孢子液10ml，混匀后置于25℃培养室中发酵。
处理5：将1.0kg玉米粉中加入0.25kg开水混匀后浸泡30min，加入0.4kg沙粒后混匀，装入聚丙烯菌种袋(15×55cm)，每袋装0.5kg，用海绵双套环封口，高压灭菌30min；冷至室温后，每袋接入浓度为1×107个/ml悬浮孢子液10ml，混匀后置于25℃培养室中发酵。
处理6：将1.0kg玉米粉中加入0.25kg开水混匀后浸泡30min，加入0.35kg沙粒后混匀，装入聚丙烯菌种袋(15×55cm)，每袋装0.5kg，用海绵双套环封口，高压灭菌30min；冷至室温后，每袋接入浓度为1×107个/ml悬浮孢子液15ml，混匀后置于25℃培养室中发酵。
处理7：将1.0kg玉米粉中加入0.25kg开水混匀后浸泡30min，加入0.35kg沙粒后混匀，装入聚丙烯菌种袋(15×55cm)，每袋装0.5kg，用海绵双套环封口，高压灭菌30min；冷至室温后，每袋接入浓度为1×107个/ml悬浮孢子液20ml，混匀后置于25℃培养室中发酵。
上述各处理分别在发酵后的第5d、7d和9d检测发酵产物中cef08111的分生孢子数量，结果如下表：
表1不同处理分生孢子产量
a、b、c、d表示数据间的差异显著性
从上表的结果中可以看出，本发明中的cef08111适合在玉米沙粒培养基中生长；1kg玉米粉中，加入0.25kg开水混匀后浸泡30min，加入0.35kg沙粒后混匀，装入聚丙烯菌种袋(15×55cm)，每袋装0.5kg，用海绵双套环封口，高压灭菌30min；冷至室温后，每袋接入浓度为1×107个/ml悬浮孢子液15ml，混匀后置于25℃培养室中发酵，分生孢子产量最高，发酵7天时达15.3×107个/g，发酵第9天时的分生孢子量与第7天相当。
实施例2微生物菌肥的制备及在黄萎病防治中的应用
1)微生物菌肥的制备：
处理1：将微生物菌种按0.4‰与羊粪混匀后置于阴凉处发酵，发酵堆厚度为30～40cm，上面覆盖双层遮阳网，避免阳光直射，控制发酵堆温度在25～30℃，翻堆频率为1次/周；当有机肥中布满白色菌丝后，得微生物菌肥a；
处理2：将微生物菌种按0.6‰与羊粪混匀后置于阴凉处发酵，发酵堆厚度为30～40cm，上面覆盖双层遮阳网，避免阳光直射，控制发酵堆温度在25～30℃，翻堆频率为1次/周；当有机肥中布满白色菌丝后，得微生物菌肥b；
处理3：将微生物菌种按0.8‰与羊粪混匀后置于阴凉处发酵，发酵堆厚度为30～40cm，上面覆盖双层遮阳网，避免阳光直射，控制发酵堆温度在25～30℃，翻堆频率为1次/周；当有机肥中布满白色菌丝后，得微生物菌肥c；
处理4：将微生物菌种按0.4‰与牛粪混匀后置于阴凉处发酵，发酵堆厚度为30～40cm，上面覆盖双层遮阳网，避免阳光直射，控制发酵堆温度在25～30℃，翻堆频率为1次/周；当有机肥中布满白色菌丝后，得微生物菌肥d；
处理5：将微生物菌种按0.6‰与牛粪混匀后置于阴凉处发酵，发酵堆厚度为30～40cm，上面覆盖双层遮阳网，避免阳光直射，控制发酵堆温度在25～30℃，翻堆频率为1次/周；当有机肥中布满白色菌丝后，得微生物菌肥e；
处理6：将微生物菌种按0.8‰与牛粪混匀后置于阴凉处发酵，发酵堆厚度为30～40cm，上面覆盖双层遮阳网，避免阳光直射，控制发酵堆温度在25～30℃，翻堆频率为1次/周；当有机肥中布满白色菌丝后，得微生物菌肥f；
处理7：将微生物菌种按0.4‰与猪粪混匀后置于阴凉处发酵，发酵堆厚度为30～40cm，上面覆盖双层遮阳网，避免阳光直射，控制发酵堆温度在25～30℃，翻堆频率为1次/周；当有机肥中布满白色菌丝后，得微生物菌肥g；
处理8：将微生物菌种按0.6‰与猪粪混匀后置于阴凉处发酵，发酵堆厚度为30～40cm，上面覆盖双层遮阳网，避免阳光直射，控制发酵堆温度在25～30℃，翻堆频率为1次/周；当有机肥中布满白色菌丝后，得微生物菌肥h；
处理9：将微生物菌种按0.8‰与猪粪混匀后置于阴凉处发酵，发酵堆厚度为30～40cm，上面覆盖双层遮阳网，避免阳光直射，控制发酵堆温度在25～30℃，翻堆频率为1次/周；当有机肥中布满白色菌丝后，得微生物菌肥i；
2)微生物菌肥在黄萎病防治中的应用
选取一块棉花黄萎病偏重发生地块，进行微生物菌肥防治黄萎病试验，试验设置以下12个处理：上述9种微生物菌肥的处理，羊粪、猪粪和牛粪不经发酵的对照处理，防治黄萎病常用微生物药剂(枯草芽孢杆菌)处理，空白对照处理，每个处理3次重复。播种前微生物菌肥以底肥的方式一次性施用，用量为4m3/亩，施肥后，及时翻地，深度30～40cm，一周后播种棉花。设置药剂对照和菌株对照，药剂对照枯草芽孢杆菌用法按照说明书要求进行(播种前，种子包衣，药种比1:10，出苗后，按每亩1kg)；菌株对照为cef08111菌种以种沟的方式进行接种，接种量为30g/米行长。出苗后，按照当地种植方式正常管理棉花。当棉花黄萎病发生高峰期时，及时调查病害的发生情况，棉花吐絮后实收测产。
表2不同处理方法对棉花黄萎病的防治效果和产量
从表2的结果中可以看出，本发明中的cef08111玉米沙粒菌种与有机肥羊粪、牛粪和猪粪发酵后的微生物菌肥均能够对棉花黄萎病起到较好的防治效果，提高棉花的籽棉产量。其中cef08111玉米沙粒菌种与羊粪发酵后得到的微生物菌肥b与c对黄萎病的防治效果最好，其籽棉产量最高。