本发明属于生物无机材料制备技术领域，具体涉及一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔caco3纳米粒子的方法。
背景技术：
碳酸钙是自然界中发现的最丰富的无机材料之一。由于纳米级碳酸钙材料具有生物相容性，生物降解性和无毒性等巨大性能，因此已经在工业和生物技术领域中被合成用于各种应用。例如，基因和药物输送，骨修复和组织工程。碳酸钙纳米粒子的高孔隙率，表面积和低质量传输限制使其对于设计许多可靠且成本低廉的生物传感器具有吸引力。
生物矿化，是生物在特定的部位和一定的物理化学条件下，在生物有机物质的调控下，将溶液中的离子转变为固相矿物的过程。不同于一般的矿化作用，生物矿化通过生物大分子从分子水平上控制无机矿物相的结晶、生长，从而使生物矿物具有特殊的分级结构和组装方式。近年来研究表明，生物体对生物矿化过程的控制是一个复杂的多层次过程，受到生物有机质、晶体自身生长机制、以及外界环境等各方面的综合调控作用。胶原蛋白具有良好的生物相容性、生物降解性、吸收性以及促进细胞形成等诸多功能，因此在生物医用材料、组织工程、化妆品、食品等领域广泛应用。以胶原蛋白为生物模板合成的骨骼、牙齿代表了自然界一种最经典的生物矿化现象。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔caco3纳米粒子的方法，采用重组胶原蛋白作为生物模板，碳酸钠、氯化钙作为原料，在温和条件下制备大小和形貌可控的微孔caco3纳米材料。
为实现上述目的，本发明公开了如下技术方案：
一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔caco3纳米粒子的方法，包括如下步骤：
(1)利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白
①确定重组胶原蛋白的序列：
重组胶原蛋白的序列为：
gspglpgprgeqgptgptgpagprglqglqglqgergeqgptgpagprglqgergeqgptglagkageagakgetgpagpqgprgeqgpqglpgkdgeagaqgrpgkrgkqgqkgekgepgtqgakgdrgetgpvgprgergeagpagkdgergfpgergvegqngqdglpgkdgkdgqngkdglpgkdgkdgqngkdglpgkdgkdgqdgkdglpgkdgkdglpgkdgkdgqpgkpgkygppgppgppgppgppgppgppgppgppgpp，该重组胶原蛋白具备良好的三重螺旋结构，热变温度接近37℃；
②合成编码重组胶原蛋白的核酸：合成编码步骤①重组胶原蛋白的核酸，构建导入上述核酸的质粒，并将质粒转化大肠杆菌bl21-de3菌株；
③重组胶原蛋白的制备与纯化。
(2)微孔caco3纳米材料的制备
①重组胶原蛋白与碳酸钠和氯化钙均匀混合溶液的配制：在naco3的水溶液中加入0-120mg重组胶原蛋白粉末，混合均匀，再向该溶液中缓慢滴加氯化钙溶液溶液；剧烈搅拌5-120min后，得到白色的絮状物；
②温和的生物矿化条件下制备纳米级微孔caco3：将所得絮状混合物放在20-37℃的恒温箱中，放置1-10天，得到白色沉淀；
③纯化并干燥保存制备的纳米材料：将产物通过离心分离，离心条件为12000rpm，弃去上清液，留下固体；并用去离子水分散固体，再离心纯化3-5次，在20-37℃恒温干燥箱中干燥即得。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(2)中所述的胶原蛋白粉末加入量为0.1-120mg，胶原蛋白质量分数为0.01-6wt％。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(2)中所述的碳酸钠固体加入量为10-80mm，。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(2)中第②步中所述的絮状混合物在25℃的恒温箱中放置2天。
本发明的有益效果在于：
①本研究采用重组胶原蛋白作为生物模板，氯化钙作为原料，在温和条件下制备大小和形貌可控的微孔caco3纳米材料。
②本发明在整个合成过程中无需进行后处理，简单方便，易于操作，具有很大的应用前景，可为规模化生产微孔caco3纳米材料提供基础。
③由重组胶原蛋白作为生物模板调控caco3纳米晶型，得到特定形貌的caco3纳米粒子，有较高的负载效率和可持续的药物释放性能。
附图说明
图1为实施例1制备的微孔caco3纳米材料的粉末x射线多晶衍射(xrd)图(a)和x射线光电子能谱(xps)图(b)；
图2为实施例1制备的微孔caco3纳米材料的热重分析(tga)图；
图3为实施例1制备的微孔caco3纳米材料的红外分析(ft-ir)图；
图4为实施例1制备的微孔caco3纳米材料的分析图；
图5为不同放置时间的实施例1制备的caco3纳米颗粒形貌透射电子显微镜图(tem)和扫描电子显微镜图(sem)；
具体实施方式
下面将结合说明书附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分，而不是发明的全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备得到微孔caco3纳米粒子及其表征
一种以胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔caco3纳米粒子的方法，包括如下步骤：
(1)利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白
①确定重组胶原蛋白的序列：
重组胶原蛋白的序列为：
gspglpgprgeqgptgptgpagprglqglqglqgergeqgptgpagprglqgergeqgptglagkageagakgetgpagpqgprgeqgpqglpgkdgeagaqgrpgkrgkqgqkgekgepgtqgakgdrgetgpvgprgergeagpagkdgergfpgergvegqngqdglpgkdgkdgqngkdglpgkdgkdgqngkdglpgkdgkdgqdgkdglpgkdgkdglpgkdgkdgqpgkpgkygppgppgppgppgppgppgppgppgppgpp，该重组胶原蛋白具备良好的三重螺旋结构，热变温度接近37℃；
②合成编码重组胶原蛋白的核酸：
合成编码步骤①重组胶原蛋白的核酸，构建导入上述核酸的质粒，并将质粒转化大肠杆菌bl21-de3菌株；
③重组胶原蛋白的制备与纯化：
取50μl菌液加到100ml含抗生素的lb液体培养基中，恒温摇床过夜进行增菌培养后，转移到1l含抗生素的lb培养基中，在37℃恒温摇床中继续扩增培养；待od600值达到0.8-1范围，将摇床温度调为25℃，加入1mmiptg诱导表达，恒温过夜培养；将菌液在低温离心机中离心，收集菌体；将菌体用a缓冲液溶解，a缓冲液为20mm咪唑，20mm磷酸钠，0.5m氯化钠，ph为7.4；利用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎，超声时细菌悬浊液放于冰浴中，以防温度过高导致蛋白变性；将破碎完的悬浊液再次离心，使细胞碎片与蛋白溶液分离，离心条件：14000rpm,4℃，30-50min；收集上清液，即粗蛋白溶液，通过液相色谱进行进一步纯化；后经冻干，得到白色絮状固体；此固体放于-20℃冰箱保存，使用时通过称重法标定浓度；
(2)caco3纳米材料的制备
①重组胶原蛋白与碳酸钠和氯化钙均匀混合溶液的配制：
在naco3浓度为0.05mol/ml的水溶液中加入6mg重组胶原蛋白粉末，使得胶原蛋白的质量分数为6wt％，混合均匀，再向该溶液中缓慢滴加氯化钙溶液；快速搅拌5-120min后，得到白色的絮状物；
②温和的生物矿化条件下制备纳米级微孔caco3：
将所得絮状混合物放在25℃的恒温箱中，放置2天(即48h)，得到白色沉淀；
③纯化并干燥保存制备的纳米材料：
将产物通过离心分离，离心条件为12000rpm，弃去上清液，留下固体；并用去离子水分散固体，再离心纯化3-5次，在20-37℃恒温干燥箱中干燥即得。
如图1a制备的微孔caco3纳米材料的粉末x射线多晶衍射(xrd)图所示,该图谱中衍射峰与标准碳酸钙红钛矿和方解石的峰相对应，说明我们所制备的碳酸钙纳米材料是碳酸钙红钛矿和方解石的混合物。图1b为制备的caco3纳米材料的x射线光电子能谱(xps)图,该图谱中衍射峰与caco3的衍射数据对应。
如图2制备的caco3纳米材料的热重分析(tga)图所示，可以清楚的表明在200-600℃之间，胶原蛋白碳酸钠材料中质量的损失约为7.5wt％。
如图3制备的微孔caco3纳米材料的红外分析(ft-ir)图所示,在3416cm-1,2925cm-1和1658cm-1出现的峰值分别归因于o-h/n-h，c-h和c＝o/-nh的振动键，这证实了cl/caco3中胶原的存在。位于1440cm-1的振动峰归属于co2的不对称伸缩，峰值为876cm-1和712cm-1是方解石的特征峰，745,1088归属于辉石。ft-ir分析显示在合成材料中存在方解石和黄铁矿，这与xrd结果一致。这些数据表明，我们以胶原蛋白为模板，成功制备caco3纳米材料。
如图4制备的caco3纳米材料的扫描电镜、透射电镜、电子衍射以及能量散射x射线的分析图所示，从图中我们可以看出，碳酸钙纳米粒子形貌均一，胶原蛋白和caco3在微孔球内均匀分布。
图5显示了不同时间对形成caco3纳米颗粒形貌的影响。图a-c为放置1小时，有tem图像可知获得实心的碳酸钙纳米球；图d-f为放置24小时，sem图像可以看出，碳酸钙表面出现毛刺，tem图像可以看出，不是实心；图g-i为放置72小时，从tem和sem图像可以明显看出表面疏松。从这些结果可知，放置时间对微孔碳酸钙纳米粒子的形成起重要的作用。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的内容和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>兰州大学
<120>一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔caco3纳米粒子的方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>282
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<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum
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