专利名称：单唾液酸四己糖神经节苷脂的高纯度制备工艺的制作方法
神经节苷脂是一族异构的含唾液酸残基的结构复杂的膜糖脂，其分子皆由一个疏水的神经酰胺部分和一个亲水的唾液酸寡糖基团组成。神经酰胺由鞘氨醇的氨基与脂肪酸酸化而成。神经节苷脂分子既有水溶性，又有脂溶性。Sevennerholm按唾液酸残基的位置和寡糖核心区的长度，将神经节苷脂分为不同的种类，其中GM1为单唾液酸四已糖神经节苷脂。
哺乳动物中枢神经系统中神经节苷脂含量丰富，其中以神经系统灰质含量最高。据估计，以水解后的唾液酸计算大脑中每克新鲜灰质和白质含量分别为3000-3500nM和1000-1250nM，明显高于其他组织。中枢神经系统的神经节苷脂主要为神经节系列，大脑灰质多为GM1，GD1a，GD1b，(GD为二唾液酸神经节苷脂)GT1b(GT为三唾液酸神经节苷脂)，GQ1b(GQ为四唾液酸神经节苷脂)，其次是GM2和GD3；白质以GM1和GM4为主。神经节苷脂在神经元胞体中含量略低于平均水平，而在突触小体中含量高于平均水平。对于单个神经节苷脂而言，GT1，GD1b及GM1集中于突触前后膜。神经节苷脂位于神经元细胞膜双层结构外层，神经酰胺一端嵌入细胞膜内，而寡糖链一端伸出细胞膜外突入外环境。神经节苷脂的这种非对称性分布以及它们的化学性质差异使其特别易与各种细胞外信息发生相互反应，从而在细胞膜活动上充当重要角色。实验证明外源性神经节苷脂尤其是GM1能嵌入神经细胞膜，模仿内源性神经节苷脂的某些功能，调节膜介导的细胞功能，并能刺激中枢神经系统损伤后潜在的代替机制阻止损害的发展，保护未受损的神经组织，同时还能影响体外培养的神经元的生长及其活性，促进其存活及生长。神经节苷脂GM1在神经系统中的主要生理作用为1，促进神经细胞的生长，分化发育和神经再生2，参与突触传递，维持脑的正常机能，参与各种学习记忆活动3，在细胞与细胞，细胞与微生物以及细胞与基质间的相互作用过程中起介导作用4，调节细胞膜中各种蛋白质功能，如离子通道，表皮生长因子受体等。由意大利Fidia公司从牛脑组织中提取的GM1注射液(商品名Sygen)已于90年代正式在我国销售。由于GM1能通过血脑屏障，注射后快速在大脑和脊髓组织中分散，因此临床上GM1的治疗效果十分显著。主要用于治疗人血管性或创伤性中枢神经系统损伤。如脑卒中、急性脊髓损伤和脑外伤。
CM1的研究已有数十年，目前已证明其结构组成和理化性质，主要归结为1.GM1分子由一个唾液酸，一个葡萄糖，二个半乳糖，一个氨基半乳糖及一个神经酰胺残基组成。分子式为 2，分子量1551，钠盐为15743，性状为乳白色粉末，无味，有吸湿性，溶于水，甲醇-水及甲醇-氯仿溶液。不溶于甲醇，丙酮，氯仿，乙醚。熔点207-230摄氏度。
4，紫外吸收最大波长位于205nm有特殊的红外吸收光谱，可通过氨基正相柱高效液相色和薄层色谱(TLC)进行纯度鉴定。气相色谱可鉴定GM1分子中糖基和神经酰胺残基。
神经节苷脂及GM1提取和分离纯化已有文献和专利报道。其主要提取方法是猪脑或牛脑经绞粹，用丙酮脱水制成丙酮粉。再用氯仿、甲醇、水混合有机溶剂提取[Svennerholm.et al Biochemical et Biophsica Acta，617-109(1980)]。提取物神经节苷脂转入水相[J.Folch，The Journal of Biological Chemistry，226，497-509(1957)].用DEAE-Sephadex-A25纯化[R.w.Ledeen，et al.Journal ofNeurochemistry，21，829(1973)].硅胶层析，GM1得率达到14％。神经节苷脂的分离有用a环糊精技术(EP00469352A1)，也用大孔径树脂吸附技术(CN85102590)。神经节苷脂脱唾液酸方法有用唾液酸酶处理法(Richard Kuhn，etal.，ChemischeBerichte，1963.96.866).有用加热处理法(US4868292)以及微生物处理方法(FukanoY，et al.，Appl Environ Microbiol，1997.63.1861)。GM1纯化方法Momoi TaKashi建立了阴离子交换层析技术(Biochim Biophys Acta，1976，411，488)。亲和层析技术(Krishna Kant，et al J.Chromato，1989.494289)等。
总神经节苷脂的提取主要依据其本身的两个性质脂溶性和水溶性。根据其脂溶性，可用传统的提取脂肪的方法把神经节苷脂与其它脂类一起从脑组织中提取出来，比如用20倍体积的氯仿-甲醇(2∶1)提取，几乎所有脂类都释放到溶液中，但神经节苷脂仅70％左右释放。这主要是大多脂类都是非极性，而神经节苷脂具有一定极性。本发明改变了提取有机溶剂的极性，用氯仿-甲醇-水(1∶2∶0.75)这一个体系来提取神经节苷脂，结果神经节苷脂几乎全部释放到溶液中，而其他脂类释放不彻底。
用本发明改良的氯仿-甲醇-水(1∶2∶0.75)这一个体系来提取神经节苷脂，除了神经节苷脂释放彻底之外，其他的极性脂类如磷脂，硫脂等也大量释放。为了减少它们的污染，根据其极性差异，调节氯仿-甲醇-水比例为1∶2∶1.4，此时有机溶剂开始分层，经测定神经节苷脂全部进入上层水相，而色素及大部分磷脂、硫脂分配到下层有机相。经过两步提取分层操作，神经节苷脂含量从脑组织中的15％左右提高到上层水相的70％左右。脑组织中神经节苷脂主要以GM1，GD1a，GD1b(二唾液酸神经节苷脂)，GT1b(三唾液酸神经节苷脂b)，GQ1b(四唾液酸神经节苷脂b)。其中GD1和GT1b在结构上与GM1仅仅是多一个和两个唾液酸残基，如能将其多余的唾液酸残基去除转变成CM1，就能提高整个CM1制备工艺中的产率。本发明使用弱酸条件下(PH3.0-5.0)加热到80℃以上的处理方法，GD1a，GD1b和GT1b的末端唾液酸链会逐一水解掉剩下最后一个唾液酸残基。本发明对牛脑组织中的总神经节苷脂在不同酸溶液中加热水解后的结果表明，其中GM1含量倍增2-3倍。
总神经节苷脂酸水解产物中主要为GM1和其它神经节苷脂、磷脂、硫脂、其中GM1和其它神经节苷脂占80％以上。根据神经节苷脂在唾液酸和酰氨基团数目的差异，本发明选用阴离子交换层析将其分离。采用Q-Sepharose强阴离子介质和DEAE型弱阴离子介质的结果表明，总神经节苷脂在介质转为乙酸型后，在低电导条件下能吸附在介质上。然后用较低的盐浓度有效地将GM1洗脱下来，同时除去部分磷脂和硫脂。经过此步分离纯化的GM1经薄层色谱分析其纯度在90％左右。
对于残留的少量其他脂类物质，本发明根据其与GM1疏水性差异，用Sourse RPC 30反相介质进行分离纯化的结果表明，此步所得GM1纯度大于98％。由于GM1不溶于丙酮，分离纯化所得高纯度GM1溶液中加入10倍或更多的冷丙酮，沉淀结晶的GM1经离心、真空干燥后得白色干粉。实例1总神经节苷脂的提取20千克洗干净的新鲜牛脑组织，用组织匀浆机匀浆，加入50升冷丙酮(-10℃)搅拌，-10℃放置过夜，离心取沉淀，上清减压蒸发回收。沉淀置80℃烘烤过夜，得丙酮粉，约1千克。
1千克丙酮粉加入3升甲醇，1.5升氯仿，1.125升水。具体加入方法是先加入甲醇，搅拌2小时，再加入丙酮和水，室温搅拌过夜。然后离心收集上清，所得上清应是清澈的有机溶剂混合液，加入0.975升水，溶液变为乳状液，小心倒置两次后静止分层，取上清。此上清即为总神经节苷脂粗提液。此粗提液加入1/10体积正辛醇减压浓缩至干，加入500毫升水即溶解，可得总神经节苷脂约25克，其中38％神经节苷脂GD1a，20％神经节苷脂GM1，21％神经节苷脂GT1b，18％神经节苷脂GD1b。实例2总神经节苷脂的水解及脱盐约含5克粗神经节苷脂的水溶液100毫升，加入0.1N乙酸20毫升，溶液最终pH为4.0。该溶液放置于100℃水浴2小时，其pH变为4.56，经TLC分析神经节苷脂GD1a和GT1b部分水解为GM1，GM1含量增高2.6倍。
酸水解后含GM1水溶液用Sephadex G-25柱脱盐，检测波长为214nm，收集洗脱峰，所得收集峰溶液约500毫升，电导约2000us.cm-1，得率约85％。实例3Q-Sepharose F.F.柱层析分离GM1脱盐溶液500毫升含GM1约3.5克，减压浓缩至1/20体积后，加入氯仿和甲醇。稀释调节氯仿∶甲醇∶水比例为30∶60∶8，佳电导小于100单位，用NaOH调节pH为8.0。
Q Sepharose F.F乙酸化处理5倍体积氯仿-甲醇-1M乙酸钠(30∶60∶8)悬浮填料，静止后去上清，如此操作3次，然后用此溶液浸泡填料过夜。又用5倍体积氯仿-甲醇-水(30∶60∶8)悬浮填料，静止后去上清，如此操作3次后装柱，柱规格为20cm×50mm，填料柱体积300ml，装柱后再用氯仿-甲醇-水(30∶60∶8)洗脱5倍柱体积，检测波长为214mn。
上样溶液体积有约1.5升，以8毫升/分钟速度上样，上样结束后用5倍柱体积氯仿-甲醇-水(30∶60∶8)平衡柱子，流速为20毫升/分钟。再用氯仿-甲醇-水(30∶60∶8，0.015M乙酸钠)洗脱GM1，约600毫升。接着用氯仿-甲醇-水(30∶60∶8，0.2M乙酸钠)洗脱其它神经节苷脂。所得GM1洗脱峰减压浓缩至干，用原体积1/4体积水溶解，即为0.8M乙酸钠水溶液。此层析所得GM1约2.8克，纯度约90％，得率为80％。实例4Source RPC 30反相柱层析实例3所得GM1水溶液中乙酸钠浓度为0.8M，体积150毫升中含GM1约2.8克，用NaOH调至pH9.0，37℃中保温1小时后上样Source RPC 30反相柱。柱规格为20cm×36mm，柱体积300毫升，以10毫升/分钟流速上样。经5倍柱体积水溶液平衡柱子后用甲醇-水(2∶1)洗脱GM1。检测波长为214nm，收集洗脱峰200毫升。此步所得GM1约2.4克，得率大于85％，经lichrospher NH4柱HPLC和TLC分析纯度大于98％。实例5GM1干粉制备反相层析所得GM1溶液减压浓缩成85ml后，加入1升冷丙酮(-10℃)，放置于-10℃中过夜后，GM1沉淀结晶析出。离心收集沉淀，用80℃水溶解，即得GM1水溶液或经真空冷冻干燥后成乳白色干粉，约重2.2克。实例6GM1对体外鸡胚背根神经节原代神经元树突生长的作用取实例5GM1加入DMEM/N1培养基，使终浓度为5×10-6M及1×10-5M。将8日龄鸡胚背根神经节原代神经元以相同的培养基混合，每次取100ul细胞悬液加入96孔板(1500个细胞/孔)，培养4小时后，每孔加入含GM1 0.5×10-6M、1×10-5M的培养基100ul，继续培养24小时。结果表明GM1培养孔的树突性神经元比例较对照孔显著增加(P＜0.05)。
权利要求
1.本专利中单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的高纯度制备工艺特征在于用有机溶剂混合物从哺乳动物脑组织中提取总神经节苷脂，然后对总神经节苷脂提取液浓缩后进行酸水解以提高GM1含量，浓缩水解产物经脱盐后溶解于有机溶剂混合物中进行阴离子交换柱层析，收集含GM1的洗脱峰，浓缩后再进行反相柱层析。所得GM1于冷丙酮中沉淀，得纯度大于98％的GM1干粉。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于提取总神经苷脂所用有机溶剂混合物是氯仿-甲醇-水。提取总脂时其体积比例是氯仿-甲醇-水，1∶2∶0.75，分离总神经节苷脂时其体积比例调节到氯仿-甲醇-水，1∶2∶1 4，脑组织与有机溶剂比例为1∶20(v/v)。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于酸水解的条件是用无机酸将总神经节苷脂水溶液pH调节到3.0-5.0，加热温度至80-100℃、水解时间2h。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于所用离子交换介质为Q-Sepharose或DEAE-Sepharose型。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于所用离子交换介质Q-SepharoseF.F.层析条件为(1).上样条件a柱子用氯仿-甲醇-水，30∶60∶8，(v/v/v)，平衡到电导率小于50us.cm-1；b.样品溶解于氯仿-甲醇-水，30∶60∶8，(v/v/v)，电导率小于100us cm-1，pH为8.0；(2)洗脱条件a.氯仿-甲醇-水，30∶60∶8，(v/v/v)，(0.015M乙酸钠)，洗脱GM1；b.氯仿-甲醇-水，30∶60∶8，(v/v/v)，(0.2M乙酸钠)，洗脱非GM1神经节苷脂。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于所用反相介质为Sourse RPC 30。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于减压浓缩后GM1溶于含30％正丙醇的水溶液中，加入乙酸钠定终浓度0.8M，再用NaOH调PH9.0，37℃中1小时后上样SourcRPC30反相柱，经水相洗脱后，用甲醇-水缓冲液(2∶1)洗脱下GM1。
全文摘要
本发明涉及从动物脑组织中分离纯化高纯度的单唾液酸四己糖神经节苷脂(Monosialotetrahexosylganglioside,GM1)的工艺方法。该方法主要包括用有机溶剂混合物提取总神经节苷脂,酸水解总神经节苷脂,离子交换柱层析,反相柱层析等四步,所得GM1纯度大于98%。由于GM1已用于临床治疗中枢神经损伤疾病。故本发明所述GM1的制备方法适合于规模化生产。
文档编号C07H15/10GK1353112SQ0013307
公开日2002年6月12日 申请日期2000年11月9日 优先权日2000年11月9日
发明者范开, 王建, 马素永, 张益 , 田峰, 聂李亚, 黄洪涛 申请人:重庆富进生物医药有限公司