头孢菌素类化合物的制作方法

专利名称：头孢菌素类化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖的3-头孢菌素类(ceph-3-em)化合物以及生产上述化合物的生物方法。
根据本发明的3-头孢菌素类化合物特征如结构式(I)所示 还包括其盐或酯，其中R选自如下基团构成的组a)HOOC-X-CO-其中X被定义为(CH2)4；或者，其中X被定义为(CH2)p-A-(CH2)q，其中p和q每个都独立地表示0、1、2、3或4，并且A是CH＝CH、C≡C、CHB、C＝O、O、S、NH，氮可选是被取代的，或者，硫可选是被氧化的，B是氢、卤素、C1-3的烷氧基、羟基或者可选地被取代的甲基，附带条件是当A是CH＝CH或C≡C时，p+q应为2或3，当A是CHB、C＝O、O、S或NH时，p+q应为3或4；或者，其中X是(CH2)m-CH＝A-(CH2)n或(CH2)m-C≡C-(CH2)n，其中，m和n每个都独立地表示0、1、2或3，并且，m+n＝2或3，A是CH或N；或者，其中X是(CH2)p-CH＝CH-CH＝C-(CH2)q，其中，p和q每个都独立地表示0或1，并且p+q＝0或1；或者
b)(羧基甲硫基)丙酰基c)(羧基乙硫基)丙酰基并且，其中R’选自由如下基团构成的组d)OHe)O-(1-6C的烷基)，其中烷基可以是直链的或带有支链的f)O-C(1-6C的烷基)-O-(1-6C的烷基)，其中烷基可以是直链的或带有支链的。
该3-头孢菌素类化合物(I)在商业化3-头孢菌素类抗生素生产过程中能被用作为中间产物。或者，该3-头孢菌素类化合物(I)可转化为另一种中间产物，即7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸或其盐或酯。
该3-头孢菌素类化合物(I)的一个特别的优点在于较之头孢菌素C，在对化合物进行纯化条件下或进一步合成更有商业吸引力的3-头孢菌素类抗生素的条件下，其稳定性更好。凭借此优点，该优选的化合物能比头孢菌素C更容易地被分离出来。
商业上的3-头孢菌素类抗生素例子是头孢乙氰(cefacetril)、头孢克洛(cefaclor)、cefaloglycin、头孢洛宁(cefalonium)、头孢噻啶(cefaloridin)、头孢噻吩(cefalotin)、头孢孟多(cefamandole)、头孢匹林(cefapirin)、cefapyrin、头孢曲嗪(cefatrizine)、头孢西酮(cefazedone)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢拉宗(cefbuperazone)、头孢卡品酯(cefcapene pivoxil)、头孢地尼(cefdinir)、头孢妥仑匹酯(cefditoren pivoxil)、头孢吡肟(cefepime)、头孢克肟(cefixime)、头孢甲肟(cefmenoxime)、头孢美他唑(cefmetazole)、头孢米诺(cefminox)、头孢地嗪(cefodizime)、头孢尼西(cefonicid)、头孢氧哌唑(cefoperazone)、ceforanid、头孢氨噻肟(cefotaxime)、头孢替安(cefotiam)、头孢替安酯(cefotiam hexetil)、头孢匹胺(cefpiramide)、头孢匹罗(cefpirome)、头孢泊肟酯(cefpodoximeproxetil)、头孢丙烯(cefprozil)、cefroxadin、头孢磺啶(cefsulodin)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢特伦酯(cefteram pivoxil)、(ceftezole)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢噻呋(ceftiofur)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢呋辛酯(cefuroxime axetil)、头孢唑喃(cefuzonam)。
头孢呋辛、头孢西丁(cefoxitin)和头孢卡品酯是头孢菌素抗生素的例子，其都具有3-氨基甲酰氧甲基，不容易从目前可获得的3-头孢菌素类中间产物(例如7-ACA)制得。根据本发明的3-头孢菌素类化合物具有3-氨基甲酰氧甲基，因此用公知技术可以容易地将其转化为上述头孢菌素抗生素，以及其它的3-头孢菌素类抗生素。
头孢唑啉、头孢他啶和头孢曲松是进一步最优选的头孢菌素抗生素，采用公知技术可以从结构式(I)所示的化合物对其进行制备。
此外，如结构式(I)所示的化合物自身也可被用作为抗生素。
根据本发明的最为优选的化合物是如结构式(II)所示的化合物(己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸)。
可通过本领域已知的方法对根据本发明的3-头孢菌素类化合物进行化学制备，或者通过发酵，或通过一个或多个生物转化步骤和一个或多个发酵步骤和/或一个或多个化学转化步骤的组合来制备。
本发明还包括用于生产3-头孢菌素类化合物(I)的发酵方法，所述化合物作为经过适当遗传改造的微生物的次级代谢产物存在。
为对根据本发明的3-头孢菌素类化合物进行发酵生产，优选使用遗传上拥有至少部分用于生产β-内酰胺的代谢途径的微生物。例如，拥有至少部分用于生产青霉烷(penam)或3-头孢菌素β-内酰胺化合物的代谢途径的微生物可以使用。对此目的而言，合适的微生物是Penicillium属的真菌，例如P.chrysogenum，或Acremonium属的，例如A.chrysogenum，或Aspergillus属的，例如A.nidulans，或Streptomyces属的细菌，例如S.clavuligeris，或Nocardia属的，例如N.lactamdurans，或Lysobacter属的，例如，L.lactamgenus。
在微生物中对O-甲氨酰化的3-头孢菌素类化合物头霉素C(cephamycin C)进行的生物合成被相信可以按照图1所示的流程来进行。头孢菌素C的合成如图2的流程图所示。
优选地，上述经过遗传改造的生物在如下条件下被培养其中，得到的3-头孢菌素类化合物中，天然3-头孢菌素类化合物中处于7位的α-氨基-己二酰侧链被根据本发明的目标侧链所取代。为达到此目的，能运送该侧链的组合物被提供给体内酶转化过程。
合适地，体内酶转化过程可被选自如下物质构成的组的侧链前体来提供i)3’-羧基甲硫丙酸或其盐或酯，ii)3，3’-硫二丙酸或其盐或酯，iii)化合物p Y-CH2-COOH或其盐或酯，其中Y是苯基、苯氧基或四唑基(tetrazolyl)，iv)符合通式HOOC-X-COOH的化合物或其盐或酯，其中X被定义为(CH2)4；或者，其中X被定义为(CH2)p-A-(CH2)q，其中p和q每个都独立地表示0、1、2、3或4，并且A是CH＝CH、C≡C、CHB、C＝O、O、S、NH，氮可选是被取代的，或者，硫可选是被氧化的，B是氢、卤素、C1-3的烷氧基、羟基或者可选地被取代的甲基，附带条件是当A是CH＝CH或C≡C时，p+q应为2或3，当A是CHB、C＝O、O、S或NH时，p+q应为3或4；或者，其中X是(CH2)m-CH＝A-(CH2)n或(CH2)m-C≡C-(CH2)n，其中，m和n每个都独立地表示0、1、2或3，并且，m+n＝2或3，A是CH或N；
或者，其中X是(CH2)p-CH＝CH-CH＝C-(CH2)q，其中，p和q每个都独立地表示0或1，并且p+q＝0或1。
如果用A.chrysogenum作为经过遗传改造的生产生物，编码异青霉素N酰基转移酶的penDE(Alvarez，E.，B.Meesschaert，E.Montenegro，S.Gutiérrez，B.Diez，J.L.Barredo，and J.F.martin.1993.Eur.J.Biochem.215323-332)和编码氨基甲酰转移酶的cmcH(Coque，J.J.R.，F.J.Perez-Llarena，F.J.Enguita，J.L.Fuente，J.F.Martin，and P.Liras.1995.Gene16221-27)应被引入。此外，为避免不想要的副产物，至少编码DAC乙酰基转移酶的cefG基因(Felix，H.R.，J.Neusch，and W.Wehrli.1980.FEMS Microbiol.Lett.855-58；Fujisawa，Y.，and T.Kanzaki.1975.Agric.Biol.Chem.392043-2048)以及优选地，还有共同编码IPN差向异构酶的cefD1和cefD2基因(Ullan RV，Casqueiro J.Banuelos O，Fernandez FJ，Gutierrez S，Martin JF.2002.J Biol Chem 277(48)46216-25)应被失活。
如果选用N.lactamdurans或S.clavuligerus作为经过遗传改造的生产生物，penDE的引入和表达是必须的，优选地，为避免不想要的副产物，cefD基因(Jayatilake，S.，J.A.Huddleston，and E.P.Abraham.1981.Biochem.J.195645-647；Konomi，T.，s.Herchen，J.E.Baldwin，M.Yoshida，N.A.Hunt，and A.L.Demain.1979.Biochem.J.184427-430)和编码OCDAC羟化酶的cmcl基因(Xiao，X.，G.Hintermann，A.Hausler，P.J.Barker，F.Foor，A.L.Demain，and J.Piret.1993.Agents Chemother.3784-88)以及可选地，还有编码甲基转移酶或头霉素C合成酶的cmcJ基因(Coque，J.J.R.，F.J.Perez-Llarena，F.J.Enguita，J.L.Fuente，J.F.Martin，and P.Liras.1995.Gene16221-27)可被失活，其中，后两者是头霉素生物合成的晚期酶(例如WO95/29253中所述的)。
如果L.lactamgenus被选作为宿主，至少penDE和cmcH应被引入，优选地，cefD应被失活。
为生产根据本发明的化合物提供遗传改造所需，在生物中进行的基因插入和失活可以通过本领域内已知的方法来进行。就插入而言，可以使用基因组DNA序列，或者如果需要的话，使用cDNA。
优选用于对本发明的化合物进行发酵生产的微生物是P.chrysogenum和A.chrysogenum，经过遗传改造后，已向它们提供了编码适于生产本发明化合物的酶的DNA片段，其中，在A.chrysogenum的情况下，还已经失活了适当的基因。
更优选地，对根据本发明的化合物的发酵生产进行于以适当方法遗传改造过的P.chrysogenum中。
就此目的而言，向能生产异青霉素N的P.chrysogenum菌株提供如下DNA片段1)编码扩展酶(expandase)的DNA2)编码羟化酶的DNA3)编码O-氨基甲酰转移酶的DNA或者，编码扩展酶/羟化酶双功能酶的DNA可被引入，以代替单独编码扩展酶和羟化酶的DNA。
在一种优选的实施方式中，本发明涉及对如结构式(I)所示的化合物或其盐或酯进行发酵生产的方法 其中R选自如下基团构成的组a)HOOC-X-CO-其中X被定义为(CH2)4；或者，其中X被定义为(CH2)p-A-(CH2)q，其中p和q每个都独立地表示0、1、2、3或4，并且A是CH＝CH、C≡C、CHB、C＝O、O、S、NH，氮可选是被取代的，或者，硫可选是被氧化的，B是氢、卤素、C1-3的烷氧基、羟基或者可选地被取代的甲基，
附带条件是当A是CH＝CH或C≡C时，p+q应为2或3，当A是CHB、C＝O、O、S或NH时，p+q应为3或4；或者，其中X是(CH2)m-CH＝A-(CH2)n或(CH2)m-C≡C-(CH2)n，其中，m和n每个都独立地表示0、1、2或3，并且，m+n＝2或3，A是CH或N；或者，其中X是(CH2)p-CH＝CH-CH＝C-(CH2)q，其中，p和q每个都独立地表示0或1，并且p+q＝0或1；或者b)(羧基甲硫基)丙酰基c)(羧基乙硫基)丙酰基d)Y-CH2-CO-Y是苯基、苯氧基或四唑基并且，其中R’选自由如下基团构成的组e)OHf)O-(1-6C的烷基)，其中烷基可以是直链的或带有支链的g)O-C(1-6C的烷基)-O-(1-6C的烷基)，其中烷基可以是直链的或带有支链的。
所述方法包括如下步骤A)在能维持其生长的培养基中培养能生产异青霉素N的P.chrysogenum的菌株，向所述培养基中加入包含一种或多种选自由如下物质构成的组的侧链前体的给料i)3’-羧基甲硫丙酸或其盐或酯，ii)3，3’-硫二丙酸或其盐或酯，iii)化合物pY-CH2-COOH或其盐或酯，其中Y是苯基、苯氧基或四唑基，iv)符合通式HOOC-X-COOH的化合物或其盐或酯，其中X被定义为(CH2)4；或者，其中X被定义为(CH2)p-A-(CH2)q，其中p和q每个都独立地表示0、1、2、3或4，并且A是CH＝CH、C≡C、CHB、C＝O、O、S、NH，氮可选是被取代的，或者，硫可选是被氧化的，B是氢、卤素、C1-3的烷氧基、羟基或者可选地被取代的甲基，附带条件是当A是CH＝CH或C≡C时，p+q应为2或3，当A是CHB、C＝O、O、S或NH时，p+q应为3或4；或者，其中X是(CH2)m-CH＝A-(CH2)n或(CH2)m-C≡C-(CH2)n，其中，m和n每个都独立地表示0、1、2或3，并且，m+n＝2或3，A是CH或N；或者，其中X是(CH2)p-CH＝CH-CH＝C-(CH2)q，其中，p和q每个都独立地表示0或1，并且p+q＝0或1或能被所述P.chrysogenum菌株吸收利用以生产合适的酰基-6-氨基青霉烷酸(酰基-6-APA)的其盐或酯，由此生产出所述酰基-6-APA。
B)通过相应基因的原位表达来进行下述酶转化过程i)通过扩展酶对酰基-6-APA进行原位环扩展，形成相应的酰基-7-氨基-去乙酰氧基头孢烷酸(酰基-7-ADCA)，其中所述P.chrysogenum菌株已经经过了编码扩展酶的DNA的转化，所述扩展酶能接受所述酰基-6-APA作为底物，其表达由此使得所述菌株生产的所述酰基-6-APA随后原位环扩展形成相应的酰基-7-ADCA；ii)所述酰基-7-ADCA的3-甲基侧链被羟化酶原位羟基化，形成相应的酰基-7-ADAC，其中所述P.chrysogenum菌株已经经过了编码羟化酶的DNA的转化，所述羟化酶能接受所述酰基-7-ADCA作为底物，其表达由此使得所述菌株生产的所述酰基-7-ADCA随后原位羟化形成相应的酰基-7-ADAC；iii)所述酰基-7-ADAC的3-羟甲基侧链被O-氨基甲酰转移酶原位O-甲酰氨化，形成如结构式(I)所示的化合物，其中所述P.chrysogenum菌株已经经过了编码O-氨基甲酰转移酶的DNA的转化，所述O-氨基甲酰转移酶能接受所述酰基-7-ADAC作为底物，其表达由此使得所述菌株生产的所述酰基-7-ADAC随后原位甲酰氨化形成根据本发明的化合物。
用于本发明的编码扩展酶、羟化酶或O-氨基甲酰转移酶的DNA可从被报道含有该DNA并可从培养物库中得到的微生物中获得，或者其可以从分离自合适的天然来源的微生物中获得。
被报道含有扩展酶的微生物的例子是A.chrysogenum(cefEF)、S.clavuligerus(cefE)、N.lactamdurans(cefE)、L.lactamgenus(cefE)。
被报道含有羟化酶的微生物的例子是A.chrysogenum(cefEF)、S.clavuligerus(cefF)、N.lactamdurans(cefF)、L.lactamgenus(cefF)。
被报道含有O-氨基甲酰转移酶的微生物的例子来自放线菌目的种，特别是来自Streptomyces属的。在US Patent No.4,075,061公开的基础上，可用于提供编码目标O-氨基甲酰转移酶活性的特别合适的种包括S.clavuligerus，例如British Patent No.1,315,177中所述的菌株NRRL 3585；S.wadayamensis，例如Dutch Patent Application No.7308948中所述的菌株ATCC 21948；S.albogriseolus，例如U.S.Patent No.3,914,158中所述的菌株NRRL 5735；S.lactamdurans，例如British Patent No.1,321,412中所述的菌株NRRL 3802；以及S.jumonjinensis，例如British Patent No.1,387,965中所述的菌株NRRL 5741。
根据专利公开文件WO 95/29253公开的内容，编码DNA的目标O-氨基甲酰转移酶的其它合适的来源可以是N.lactamdurans、S.lipmanii、S.panayensis、S.cattleya、S.griseus、S.todorominensis、S.filipinensiscephamicini和S.heteromorphus。
对宿主细胞，例如P.chrysogenum或其它真菌的转化通常可以通过不同的DNA转入手段来获得，例如PEG-Ca介导的原生质吸收，电穿孔或颗粒枪技术，以及对转化子的选择。例如见Van den Hondel and Punt，“Gene and Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi”，inApplied Molecular Genetics of Fungi(Peberdy，Laten，Ogden，Bennett，eds.)，Cambridge University Press(1991)。显性和非显性选择标记的应用已有描述(Van den Hondel et al.，如前所述)。同源(来自P.chrysogenum的)和异源(非P.chrysogenum来源的)的选择标记也已被描述过(Gouka et al.，J.Biotechnol.20(1991)189-200)。
在对转化子的选择中，存在或不存在载体序列的情况下，与无选择性的DNA物理性地相连或不相连的若干种同源或异源转化子选择标记的应用是公知的。
编码扩展酶活性、羟化酶活性和O-氨基甲酰转移酶活性的DNA序列以上述方式被转入P.chrysogenum，并在其中表达，例如在菌株Wisconsin54-1255(保藏于ATCC，保藏号为28089)。具有提高的beta-内酰胺产量的其它P.chrysogenum菌株，包括菌株Wisconsin 54-1255的突变体也是合适的。此类高产菌株的例子是菌株CBS 455.95、Panlabs P2和ASP-78(Barredo JL，Alvarez E，Cantoral JM，Diez B，Martin JF.1988.AntimicrobAgents Chemother 32(7)1061-7)。
此外，cmcH基因和cefE和cefF或cefEF基因处于异源或同源控制元件的转录和翻译控制下，优选处于真菌基因控制元件的控制下。上述元件可以从克隆得到的真菌基因(例如P.chrysogenum IPNS或pcbC基因，β-微管蛋白基因、A.nidulans gpdA基因或A.niger glaA基因)中获得。
作为完全发酵生产的替代，根据本发明的化合物还可以通过一个或多个发酵步骤和一个或多个生物转化步骤和/或一个或多个化学转化步骤的组合来制备。
例如，在第一个步骤中，可以发酵生产出合适的青霉素衍生物，例如青霉素G或青霉素V，或头孢菌素的衍生物，例如己二酰-7-ADCA或己二酰-7-ADAC。
可选地，合适的青霉素衍生物在转化为相应的7-酰基-3-甲基-3-头孢菌素类化合物之前可交换6-酰基。7-酰基-3-甲基-3-头孢菌素类化合物接着可以转化为相应的7-酰基-3-羟甲基-3-头孢菌素，最终变为如结构式(I)所示的化合物。
就上述转化而言，必要的酶(分别由penDE、cefE、cefF和cmcH基因或penDE、cefEF和cmcH基因编码的酰基转移酶、扩展酶、羟化酶和氨基甲酰转移酶或者酰基转移酶、扩展酶-羟化酶和氨基甲酰转移酶)可在任何合适的宿主中独立地产生。优选地，这是用本领域内已知的方法在Escherichia coli中进行的。酶可被纯化，并且如果需要的话，可被固定，或在全细胞生物转化物或粗制的无细胞提取物中，在单一或连续的反应容器中，或在一锅式的(one-pot)反应中，用于形成如结构式(I)所示的化合物。
上述多步骤途径中的单独步骤(例如，青霉素G→酰基-6-APA→酰基-7-ADCA→酰基-7-ADAC→化合物(I))可被替换为发酵或化学转化步骤。例如，如果使用了经cefE转化过的P.chrysogenum生产的己二酰-7-ADCA的情况下(例如，按照EP0523341所述的方法)，第一个步骤可以省略，或者，如果从经cefE和cefF转化过的P.chrysogenum生产的酰基-7-ADAC开始(例如，根据EP0540210所述的方法)，可以省略前两个步骤。或者，可以使用本领域已知的用于每个单独步骤的化学转化方法。


图1在S.clavuligerus中对头霉素C进行发酵生产的示意图。
图2在A.chrysogenum中对头孢菌素C进行发酵生产的示意图。
图3用于克隆基因cefE和用于转化Wisconsin 54-1225的质粒。
图4用于克隆基因cefF和用于转化Wisconsin 54-1225的质粒。
图5用于克隆基因cefEF和用于转化Wisconsin 54-1225的质粒。
图6用于克隆基因cmcH和用于转化Wisconsin 54-1225的质粒。
图7用于克隆基因amdS和用于转化Wisconsin 54-1225的质粒。
图8根据本发明的发酵过程的示意图。
图9己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸的NMR谱。
图10根据实施例3制备的己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸的NMR谱。
图11质粒pGK105。
图12对生产己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸的氨基甲酰转移酶的生物转化产物的HPLC/MS分析。
图13己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸和其它β-内酰胺在根据实施例2转化的P.chrysogenum中的胞内和胞外分布(以mmol表示)。
图14己二酰-7-ADCA、己二酰-ACCA和头孢呋辛对B.subtilis的生长抑制。
图15己二酰-7-ADCA、己二酰-ACCA和头孢呋辛对E.coli的生长抑制。
图16己二酰-7-ADCA、己二酰-ACCA和头孢呋辛对M.luteus的生长抑制。
实施例1用编码扩展酶、羟化酶和3-羟甲基头孢菌素O-氨基甲酰转移酶活性的基因对P.chrysogenum菌株进行的转化本申请中使用用于基因克隆过程的普通技术。上述技术包括聚合酶链式反应(PCR)、合成寡核苷酸的合成、DNA的核苷酸序列分析、对DNA进行的酶连接和限制性切割、E.coli载体亚克隆、转化以及对转化子的选择、DNA分离和纯化、通过Southernblot分析进行的DNA鉴定。上述技术全部都是本领域公知的，在很多参考文献中都有充分的描述。
用P.chrysogenum菌株Wisconsin 54-1255(ATCC 28089)进行转化。P.chrysogenum中的所有构建体都处于P.chrysogenum IPNS启动子和AT终止子的控制下。具有提高的β-内酰胺产量的其它P.chrysogenum菌株，包括菌株Wisconsin 54-1255的突变体，也是合适的。此类菌株的例子是CBS 455.95。
在YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中进行对P.chrysogenum的培养，用于产生用于转化的原生质。本领域内公知，原生质化和再生步骤可有少许不同，这取决于所用的特定P.chrysogenum菌株以及所用的转化子选择方法。
在胰蛋白酶大豆培养液(Difco)培养S.clavuligerus ATCC 27064。该菌株的染色体DNA被用于通过PCR分离cefE基因。用公开的S.clavuligerus CefE序列(Kovacevic S，Weigel BJ，Tobin MB，Ingolia TD，Miller JR.J Bacteriol(1989)171(2)754-60；Ingolia et al.US.Pat.No.5,070,020)，设计出5’正向引物43635’-GAT CAG TGA CAG TTG CATATG GAC ACG ACG GTG CCC ACC TTC AGC CTG-3’(SEQ ID NO.1)和3’反向引物43645’-CCC GGG TCT AGA TCT AGA CTA TGC CTTGGA TGT GCG GCG GAT GTT-3’(SEQ ID NO.2).
用NdeI和XbaI对获得的PCR产物进行切割，将0.9kb的片段与也用NdeI和XbaI切割过的pMcTNdel(片段3.9kb)相连，得到pMcTSE。pMcTNdel衍生自pMC-5(Stanssens et al.，NAR(1989)174441)，其是通过将编码tac启动子的片段以及随后的核糖体结合序列(RBS)和NdeI克隆位点插入来构建的(还见E.P.Pat.No.0,351,029)。
首先，将AT启动子克隆到扩展酶基因的前面。AT启动子是通过对P.chrysogenum的染色体DNA进行PCR获得的，其中使用引物44885’-AGA ACG GAT TAG TTA GTC TGA ATT CAA CAA GAA CGG CCAGAC-3’(SEQ ID NO.3)和44895’-GAC AGA GGA TGT GAA GCATAT GTG CTG CGG GTC GGA AGA TGG-3’(SEQ ID NO.4)。寡核苷酸基于Barredo et al.，(1989)Gene 83572-576和Diez et al.，Mol.Gen.Genet.(1989)218572-276公开的P.chrysogenum的penDE基因序列。用EcoRI和Ndel对产物进行消化，得到1.5kb片段。该片段与pBluescript(Stratagene)的EcoRI-XbaI片段(3.0kb)和pMcTSE的NdeI-XbaI片段(0.9kb，含有S.clavuligerus扩展酶基因)连接。这会得到在AT启动子之后含有扩展酶基因的质粒pASE。
在pASE质粒中，penDE(编码AT)终止子被克隆于扩展酶基因之后。因此，P.chrysogenum的染色体DNA被用作对AT终止子进行PCR的模板，其中使用5’正向引物45795’-TTC GAT GTC AGC CTG GAC GGCGAG ACC GCC ACG TTC CAG GAT TGG ATC GGG GGC AAC TAC GTGAAC ATC CGC CGC ACA TCC AAG GCA TGA AGG CTC TTC ATG ACG-3’(SEQ ID NO.6)和3’反向引物45075’-GGA CTA GTG TCG ACCCTG TCC ATC CTG AAA GAG TTG(SEQ ID NO.5)。用BglI-SpeI对该片段进行消化，将0.6kb的产物连接到经过SpeI和BglI消化过的质粒pASE上，得到pASEWA。
最后，扩展酶基因被置于P.chrysogenum IPNS启动子之后(IPNS启动子代替了AT启动子)。IPNA可用P.chrysogenum染色体DNA作为模板来扩增出来，其中使用5’oligo 49235’-CGA GGG GAA TTC CTT ATACTG GGC TG CTG CAT TGG TCT G(SEQ ID NO.7)(使用Diez，B.，Gutierrez，S.，Barredo，J.L.，van Solingen，P.，van der Voort，L.H.and Martin，J.F.(1990)J.Biol.Chem.265(27)，16358-16365中公开的序列)和3’oligo49245’-CCC GGG CAT ATG CAT ATG GGT GTC TAG AAA AAT AATGGT GAA AAC(SEQ ID NO.8)(使用Carr LG，Skatrud PL，Scheetz ME2nd，Queener SW，Ingolia TD.(1986)Gene 48(2-3)257-66公开的序列)。用EcoRI和NdeI对pASEWA进行消化，得到4.6kb的带有扩展酶基因和AT终止子的片段，将其与经过EcoRI-NdeI消化的0.9kb的IPNS启动子PCR产物连接起来。这产生了pISEWA。通过NotI消化，从pISEWAn中获得了带有IPNS启动子和AT终止子的cefE基因。
羟化酶基因(cefF)分离自S.clavuligerus(ATCC 27064)。该菌株的染色体DNA被用于通过PCR来分离cefF基因，其中引入基因上游的NdeI位点和下游的NsiI位点。该构建体被连接于IPNS启动子之后，AT终止子之前，得到pISFWA。为转化P.chrysogenum，用NotI切割之后，从pISFWA(图4)中分离包括cefF基因和IPNS启动子和AT终止子的构建体。
通过PCR从染色体DNA中获得A.chrysogenum(＝Cephalosporiumacremonium)的扩展酶/羟化酶基因(cefEF)。设计的正向寡核苷酸引物引入了Ndel位点，反向寡核苷酸引物引入了NsiI位点。用NdeI和NsiI消化之后，可将基因放置于Penicillium表达载体中，得到pICEFWA(图5)。为转化Penicillium，通过NotI消化，从带有IPNS启动子和AT终止子的pICEFWA中分离出来自A.chrysogenum的cefEF基因。
通过对染色体DNA的PCR从S.clavuligerus中获得cmcH基因，其中使用正向引物AB12586(5’-ACA GAC CAT ATG CTC GTC GTT GCATTC AAG-3’(SEQ ID NO.9))和反向引物5’-AB12587(GAC GGC ATGCAT TCA GGA ACC GGC TAT TCG C-3’(SEQ ID NO.10))，用NdeI、NsiI进行切割，与pISEWAN的NdeI、NsiI片段连接起来(将扩展酶基因替换为cmcH基因)，得到pIScCTWA(图6)。通过NotI消化从pIScCTWA中分离出包括IPNS启动子和AT终止子的cmcH基因。
通过用HindIII进行消化，从pHELY-A1中分离出具有侧翼HelY的AmdS片段(图7)。
用amdS选择标记，通过共转化将cmcH连同cefEF或cefE和cefF构建体引入到P.chrysogenum ATCC 28089中。AmdS标记的整合使得P.chrysogenum转化子能在含有乙酰胺作为唯一氮源的选择培养基上生长。
将DNA转化到P.chrysogenum原生质体所涉及的技术是本领域公知的，在很多参考文献中都有描述，包括Finkelstein and Ball(eds.)，Biotechnology of filamentous fungi，technology and products，Butterworth-Heinemann(1992)；Bennett and Lasure(eds.)More Gene Manipulations infungi，Academic Press(1991)；Turner，inPühler(ed)，biotechnology，sedondcompletely revised edition，VHC(1992)。按照EP635574所述来进行Ca-PEG介导的原生质体转化。
实施例2对己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸的发酵生产将根据实施例1获得的P.chrysogenum转化子以2×106孢子/ml的浓度接种到US20020039758中所述用于青霉素V生产试验的培养基中，不同的是，其补充有0.5-10mg/ml的己二酸钠作为侧链前体，代替苯氧基乙酸钾(灭菌前pH为5.5至6.0)。培养在25℃进行144-169小时，每分钟280次旋转。
通过HPLC和NMR对良好生长的培养物的滤液进行关于己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸的生产分析。NMR谱显示了目标化合物的特征峰(见图9)。
实施例3对己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸的化学合成制备苯乙酰-7-氨基-3-羟甲基-3-头孢菌素-4-羧酸-二苯甲基酯(IV)
将8.5ml 20％NaOH溶液逐滴加入到被搅拌的7-氨基-头孢烷酸(5g，18.3mmol)水(20ml)溶液中(0℃下)。搅拌5分钟后，用乙酸将pH调为8.5，用丙酮(20ml)对该溶液进行稀释。然后将处于丙酮(3ml)中的苯乙酰氯(2.9ml，22mmol)逐滴加入，其间通过加入NaOH水溶液将pH保持在7.5至8.5之间。然后在0℃对溶液进行1小时的搅拌。然后真空移除丙酮，再加入乙酸乙酯(70ml)，用稀释的HCl将水相酸化至pH为3。将有机相分离出来，用另一部分乙酸乙酯对水相进行再次萃取。有机相被合并，用盐水，(MgSO4)洗，并过滤。然后在搅拌下向该溶液中加入处于乙酸乙酯(5ml)中的联苯重氮甲烷(5g，25.8mmol)。该溶液在真空下被浓缩至约40ml，4℃放置过夜。通过过滤收集得到的沉淀，用乙酸乙酯洗，得到白色粉末状产物(3.83g，40％)。δH((CD3)2SO，300MHz)3.54 & 3.63(2H，ABq，J 13.9，PhCH2)，3.65(2H，s，SCH2)，4.25(2H，s，CH2OH)，5.15(1H，d，J 4.7，CHCHS)，5.76(1H，dd，J 4.7，8.2，NHCH)，6.94(1H，s，CHPh2)7.2-7.6(15H，m，Ph2CH，PhCH2)，9.17(1H，d，J 8.2，NHCH).M/z(ES+)537(M+Na，100％)。
制备三氯乙酰-苯乙酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸-二苯甲基酯(V) 将异氰酸三氯乙酰酯(0.23ml，1.9mmol)加入到被搅拌的(IV)(600mg，1.2mmol)的丙酮(20ml)溶液中。搅拌两小时后，通过过滤收集白色沉淀，用丙酮洗，对其进行干燥(811mg，99％)。δH((CD3)2SO，300MHz)3.54 & 3.62(2H，ABq，J 13.9，PhCH2)，3.66 & 3.76(2H，ABq，J 18.5，SCH2)，4.90 & 5.02(2H，ABq，J 12.8，CH2O)，5.20(1H，d，J4.8，CHCHS)，5.82(1H，dd，J 4.8，8.1，NHCHCH)，6.96(1H，s，CHPh2)7.2-7.6(15H，m，CHPh2，PhCH2)，9.17(1H，d，J 8.1，NHCH)，12.0(1H，s，CONHCO).M/z(ES-)702(M-1，100％)。
制备三氯乙酰-苯乙酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸RCO(VI) 将(V)(5.15g，7.33mmol)溶于冰冷的(0℃)三氟乙酸(35ml)和茴香醚(4ml)的混合物中。搅拌两小时后，在真空下将溶液浓缩为油状，将其与石油醚(40-60℃的馏出物)一起研磨，然后溶于乙酸乙酯(30ml)中，用木炭脱色。过滤之后，在真空下将溶液浓缩成黄色的油，其不经纯化即用于下一步骤。δH((CD3)2SO，300MHz)3.50-3.75(4H，m，PhCH2，SCH2)，4.94(1H，part ABq，J 12.5，CH2O)，5.14(2H，m，part ABqCH2O，CHCHS)，5.72(1H，m，NHCHCH)7.0-7.4(5H，m，PhCH2)，9.12(1H，d，J 8.2，NHCH)，11.95(1H，s，CONHCO).M/z(ES-)536(M-1，67％)。
制备苯乙酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸(VII) 通过加入10％NaHCO3，将来自前一步的黄色的油小心地溶解，直到pH达到约9。然后对溶液搅拌过夜。用稀释的HCl将pH降低至2，此时会出现沉淀。通过过滤移出沉淀，用乙醚洗，得到浅黄色固体(1.81g，两个步骤中63.3％)。δH((CD3)2SO，300MHz)3.4-3.65(被H2O的峰挡住的峰)，4.63 & 4.91(2H，ABq，J 12.8，CH2O)，5.10(1H，d，J 4.5，CHCHS)，5.68(1H，dd，J 4.5，8.2，NHCHCH)，7.28(5H，m，PhCH2)，9.11(1H，d，J 8.2，NHCH).δH((CD3)2SO+D2O，300MHz)3.52(4H，m，PhCH2，SCH2)，4.63 &4.88(2H，ABq，J 12.9，CH2O)，5.05(1H，d，J 4.8，CHCHS)，5.65(1H，dd，J 4.7，8.2，NHCHCH)，7.28(5H，m，PhCH2).M/z(ES-)390(M-1，20％)。
制备7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸(VIII) 在磷酸钾缓冲液(20ml，0.5M，pH7)中搅拌(VII)(760mg，1.95mmol)，通过加入NaOH水溶液将pH升高至7.8。加入处于丙烯酸酯珠子上的青霉素酰胺酶(洗过以移去葡萄糖稳定试剂之后，约375mg)，对得到的悬浮液进行2.5小时的搅拌。然后通过过滤移去珠子，通过加入稀释的HCl，将溶液的pH降至3。然后在4℃对溶液进行过夜冷却，过滤，获得浅黄色粉末状的产物(334mg，63％)。δH((CD3)2SO+D2O，300MHz)3.36 & 3.53(2H，ABq，J 18.1，SCH2)，4.60 & 4.82(2H，ABq，J12.8，CH2O)，4.74(1H，d，J 4.9，CHCHS)，4.94(1H，d，J 4.9，H2NCHCH)。
制备环化己二酸酐(IX) 对己二酸(5g，34mmol)和乙酸酐(15ml)的混合物进行4小时的回流加热。然后在真空下将溶液浓缩，得到的残余物在真空下蒸馏至获得无色的油(在潮湿空气中暴露会导致聚合)。δH(CDCl3，300MHz)2.0(4H，m，CH2CH2CH2CH2)，2.76(4H，t，J 6.6，OCH2CH2CH2CH2O)。
制备己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸(X) 通过小心加入NaOH水溶液，将处于丙酮水溶液(10ml，1∶1v/v)中的(VIII)(100mg 0.37mmol)溶液pH调为8.5。在0℃下向该溶液中逐滴加入(IX)(80mg，0.625mmol)的丙酮(2ml)溶液，通过加入NaOH溶液将pH保持在7.5至8.5之间。在0℃下对得到的溶液进行2小时的搅拌，真空下移去丙酮，加入HCl溶液将pH调至2。用环己酮(2×20ml)对溶液进行萃取，合并有机相，浓缩至数ml。将经过浓缩的环己酮溶液倾倒入环己烷(200ml)中，获得沉淀，通过过滤收集(61mg，41％)。δH((CD3)2SO，300MHz)1.50(4H，m，CH2CH2CH2CH2)，2.22(4H，m，CH2CH2CH2CH2)，3.45 & 3.59(2H，ABq，J 18.1，SCH2)，4.62 & 4.90(2H，ABq，J 12.9，CH2O)，5.10(1H，d，J 4.8，CHCHS)，5.67(1H，dd，J 4.8，8.2，NHCHCH)，8.82(1H，d，J 8.2，NHCH).M/z(ES-)801(2M-1，17％)，400(M-1，35％)(图10)。
实施例4用生物转化方法对己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸进行体外生产制备无细胞提取物用质粒pGK105，使得Streptomyces clavuligerus的cmcH基因在lac启动子控制下于E.coli XL1-Blue中表达(图11)。为表达cmcH基因，用XL1-BluepGK105的单个菌落去接种5ml含有氯霉素的LB培养基，于37℃在250rpm摇动下下培养16小时。该培养物被用作为1％的接种物，向含有100ml补充有氯霉素的灭菌LB培养基的瓶中接种，然后在27℃，250rpm的摇动和良好通气下培养，直到OD600达到0.4至0.6。然后向培养物中加入IPTG，直至终浓度为0.3mM，再进行16小时的培养。通过离心(4000g，20分钟，4℃)收获细胞，将细胞沉淀物重新悬浮于5ml缓冲液(20mM Tris.HCl，200mM NaCl，1mM EDTA，pH7)中，在-80℃冷冻1小时，或在-20℃过夜。在冰水浴中解冻之后，用超声波对细胞悬浮液进行处理(MSE Soniprep 150)。10秒的超声波处理之后接着10秒的冷却，这样循环15-20次，足以完全裂解，其间用Bradford试验对可溶蛋白质的释放进行监测。通过离心(4000g，60分钟，4℃)使细胞残骸、不可溶蛋白质和未裂解的细胞沉淀。用棒酸钾(5mg ml-1)在27℃对上清液进行1小时的处理，以使所有染色体编码的β-内酰胺酶失活。用PD-10脱盐柱在Sephadex G-25上通过凝胶过滤除去过量棒酸盐，得到的酶溶液可立即使用，或者贮藏于-20℃，需要时使用。
氨基甲酰转移酶试验试验物(100μl)在28℃被处理4小时，其中含有己二酰-去乙酰基头孢烷酸(1-5mM)、MgSO4(0.8mM)、MnCl2(1mM)、咪唑(100mM)、ATP(5.4mM)、氨基甲酰磷酸酯(9.8mM)，pH6.75-7。所用的蛋白质的量在10μg至250μg之间。酶溶液在冰上解冻，然后加入到已在加热器中加热至28℃的反应混合物中。加入冰冷的甲醇(100μl)来终止反应，混合，然后离心(10000g，5分钟，4℃)，获得沉淀蛋白质。已通过在100℃加热5分钟变性的可溶蛋白质被用于对照反应，其一直和正常试验一起进行。
HPLC/MS分析室温下，使用Gilson HPLC系统(具有由作为缓冲液A的0.1M磷酸二氢钠和作为缓冲液B的0.05M磷酸二氢钠/50％乙腈组成的移动相，流速为1ml/min-1，在254nm处监测)，在Spherisorb分析C18柱(250×4.6mm)上，进行反应组分的分离。采用上述条件，头孢菌素起始物质和产物的可信标准分别具有19分钟和22.5分钟的保留时间。合并数轮分析得到的产物峰，将其酸化至pH为1.8，用环己酮萃取。然后再用水对有机相进行反萃取，周期性摇动中，两相萃取混合物的pH被调至7。冻干水相，将其重新溶于水中，通过电喷雾(阴离子模式)电离化MS对其进行分析，经过甲氨酰化的头孢菌素产物从其特征性[M-H]-中被鉴定出来(图12)。
结论从本实验可以推断出，使用生物转化方法可以生产出己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸。
实施例5己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸的细胞外输出通过将滤液与生物物质分离，对根据实施例2获得的样品进行更为详细的分析。在25摄氏度，每分钟280次旋转下，进行168小时的培养后，通过过滤将生长良好的培养物的滤液与生物物质分离，然后对滤液用NMR进行分析。用冰冷的生理盐水(0.9mM NaCl)对生物物质洗两次，在液氮中冷冻，冻干，重新悬浮于水中，也用NMR进行分析。
除己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氢甲基-3-头孢菌素-4-羧酸之外，所述菌株还生产中间产物，分别是IPN、6APA、ad6APA、ad7ADCA和adAHCA(＝adADAC)。但是，己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸是唯一向外分泌的β-内酰胺。
上述实验的结果被总结于图13(A和B)中。
实施例6对苯氧乙酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸的发酵生产将根据实施例1获得的P.chrysogenum转化子接种到实施例2所述的生产试验培养基(过滤之前pH6.0)中，不同之处在于其中补充有5mg/ml的苯氧乙酸钾，作为用于生产试验的侧链前体，代替乙酸钠。培养时间为168小时，培养在在25摄氏度，每分钟280次旋转下进行。
通过过滤将生长良好的培养物的滤液与生物物质分离，然后对滤液用NMR进行分析。用冰冷的生理盐水(0.9mM NaCl)对生物物质洗两次，在液氮中冷冻，冻干，重新悬浮于水中，也用NMR进行分析。在菌丝体部分观察到了苯氧乙酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸。
实施例7对转氢粘糠酰(transhydromuconoyl)-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸的发酵生产将根据实施例1获得的P.chrysogenum转化子接种到实施例2所述的生产试验培养基(过滤之前pH6.0)中，不同之处在于其中补充有4mg/ml的转氢粘糠酸(transhydromuconic acid)，作为用于生产试验的侧链前体，代替乙酸钠。培养时间为168小时，培养在在25摄氏度，每分钟280次旋转下进行。
通过过滤将生长良好的培养物的滤液与生物物质分离，然后对滤液用NMR进行分析。用冰冷的生理盐水(0.9mM NaCl)对生物物质洗两次，在液氮中冷冻，冻干，重新悬浮于水中，也用NMR进行分析。在菌丝体部分观察到了转氢粘糠酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸。
实施例8对氨基己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸的发酵生产将根据实施例1获得的P.chrysogenum转化子接种到实施例2所述的生产试验培养基(过滤之前pH6.0)中，但不加任何额外的侧链前体。培养时间为168小时，培养在在25摄氏度，每分钟280次旋转下进行。
通过过滤将生长良好的培养物的滤液与生物物质分离，然后对滤液用NMR进行分析。用冰冷的生理盐水(0.9mM NaCl)对生物物质洗两次，在液氮中冷冻，冻干，重新悬浮于水中，也用NMR进行分析。在两部分中都观察到了氨基己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸。
实施例9己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸的生物活性对根据实施例3制备的己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸对不同细菌的活性进行判断。所用的细菌是Escherichia coli ESS[xxxref komt nogxx]，Micrococcus luteus DSM 348[andrade，A.C.，VanNistelrooy，J.G.M.，Peery，R.B.，Skatrud，P.L.，De Waard，M.A.，2000，The roleof ABC transporters from Aspergillus nidulans in protection against cytotoxicagents and in antibiotic production]和Bacillus subtilis ATCC 6633[xxxrefkomt nogxx]。细菌在液体2xTY[xxxref komt nogxx]中，于37摄氏度，每分钟280次旋转下被培养过夜，随后用新鲜的培养基进行1000倍的稀释。用1ml被稀释的细菌培养液去接种2ml深孔微滴定板，向不同的孔中加入不同浓度的己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸(己二酰-ACCA或Ad-ACCA)。作为对照，使用其它数种活性或较少活性的b-内酰胺6-APA、己二酰-6-APA、7-ADCA、己二酰-7-ADCA、7-ACA、头孢菌素C和头孢呋辛。微滴定板在25摄氏度和每分钟550次旋转下被培养2天。
己二酰-7-ADCA、己二酰-ACCA和头孢呋辛对生长抑制的结果被总结于图14(B.subtilis)、图15(E.coli)和图16(M.luteus)中。
己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸对于B.subtiilsATCC 6633、E.coli ESS和M.luteus DSM 348的最小抑制浓度分别为4、7和7μM。
序列表<110>DSM股份公司<120>头孢菌素类化合物<130>21046EP/P0引物<140>
<141>
<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述合成引物<400>1gatcagtgac agttgcatat ggacacgacg gtgcccacct tcagcctg 48<210>2<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述合成引物<400>2cccgggtcta gatctagact atgccttgga tgtgcggcgg atgtt 45<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述合成引物<400>3agaacggatt agttagtctg aattcaacaa gaacggccag ac42<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述合成引物
primers<400>4gacagaggat gtgaagcata tgtgctgcgg gtcggaagat gg42<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述合成引物<400>5ggactagtgt cgaccctgtc catcctgaaa gagttg 36<210>6<211>105<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述合成引物<400>6ttcgatgtca gcctggacgg cgagaccgcc acgttccagg attggatcgg gggcaactac 60gtgaacatcc gccgcacatc caaggcatga aggctcttca tgacg 105<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述合成引物<400>7cgaggggaat tccttatact gggcctgctg cattggtctg 40<210>8<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述合成引物<400>8cccgggcata tgcatatggg tgtctagaaa aataatggtg aaaac 45<210>9<211>30
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述合成引物<400>9acagaccata tgctcgtcgt tgcattcaag 30<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述合成引物<400>10gacggcatgc attcaggaac cggctattcg c3权利要求
1.如结构式(I)所示的3-头孢菌素类化合物或其盐或酯 其中R选自如下基团构成的组a)HOOC-X-CO-其中X被定义为(CH2)4；或者，其中X被定义为(CH2)p-A-(CH2)q，其中p和q每个都独立地表示O、1、2、3或4，并且A是CH＝CH、C≡C、CHB、C＝O、O、S、NH，氮可选是被取代的，或者，硫可选是被氧化的，B是氢、卤素、C1-3的烷氧基、羟基或者可选地被取代的甲基，附带条件是当A是CH＝CH或C≡C时，p+q应为2或3，当A是CHB、C＝O、O、S或NH时，p+q应为3或4；或者，其中X是(CH2)m-CH＝A-(CH2)n或(CH2)m-C≡C-(CH2)n，其中，m和n每个都独立地表示0、1、2或3，并且，m+n＝2或3，A是CH或N或者，其中X是(CH2)p-CH＝CH-CH＝C-(CH2)q，其中，p和q每个都独立地表示0或1，并且p+q＝0或1；或者b)(羧基甲硫基)丙酰基c)(羧基乙硫基)丙酰基并且，其中R’选自由如下基团构成的组d)OHe)O-(1-6C的烷基)，其中烷基可以是直链的或带有支链的f)O-C(1-6C的烷基)-O-(1-6C的烷基)，其中烷基可以是直链的或带有支链的。
2.如权利要求1所述的化合物或其盐或酯，其中所述R’基团是OH，所述R基团选自己二酰基、苯氧乙酰基和四唑乙酰基。
3.己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸或其盐或酯。
4.用于发酵生产如结构式(I)所示的3-头孢菌素类化合物或其盐或酯的生物方法 其中R选自如下基团构成的组a)HOOC-X-CO-其中X被定义为(CH2)4；或者，其中X被定义为(CH2)p-A-(CH2)q，其中p和q每个都独立地表示0、1、2、3或4，并且A是CH＝CH、C≡C、CHB、C＝O、O、S、NH，氮可选是被取代的，或者，硫可选是被氧化的，B是氢、卤素、C1-3的烷氧基、羟基或者可选地被取代的甲基，附带条件是当A是CH＝CH或C≡C时，p+q应为2或3，当A是CHB、C＝O、O、S或NH时，p+q应为3或4；或者，其中X是(CH2)m-CH＝A-(CH2)n或(CH2)m-C≡C-(CH2)n，其中，m和n每个都独立地表示0、1、2或3，并且，m+n＝2或3，A是CH或N或者，其中X是(CH2)p-CH＝CH-CH＝C-(CH2)q，其中，p和q每个都独立地表示0或1，并且p+q＝0或1；或者b)(羧基甲硫基)丙酰基c)(羧基乙硫基)丙酰基d)Y-CH2-CO-Y是苯基、苯氧基或四唑基并且，其中R’选自由如下基团构成的组e)OHf)O-(1-6C的烷基)，其中烷基可以是直链的或带有支链的g)O-C(1-6C的烷基)-O-(1-6C的烷基)，其中烷基可以是直链的或带有支链的；所述方法包括如下步骤A)在能维持其生长的培养基中培养能生产异青霉素N的P.chrysogenum的菌株，向所述培养基中加入包含一种或多种选自由如下物质构成的组的侧链前体的给料●3’-羧基甲硫丙酸或其盐或酯；●3，3’-硫二丙酸或其盐或酯；●化合物Y-CH2-COOH或其盐或酯，其中Y是苯基、苯氧基或四唑基；●符合通式HOOC-X-COOH的化合物或其盐或酯，其中X被定义为(CH2)4；或者，其中X被定义为(CH2)p-A-(CH2)q，其中p和q每个都独立地表示0、1、2、3或4，并且A是CH＝CH、C≡C、CHB、C＝O、O、S、NH，氮可选是被取代的，或者，硫可选是被氧化的，B是氢、卤素、C1-3的烷氧基、羟基或者可选地被取代的甲基，附带条件是当A是CH＝CH或C≡C时，P+q应为2或3，当A是CHB、C＝O、O、S或NH时，p+q应为3或4；或者，其中X是(CH2)m-CH＝A-(CH2)n或(CH2)m-C≡C-(CH2)n，其中，m和n每个都独立地表示0、1、2或3，并且，m+n＝2或3，A是CH或N或者，其中X是(CH2)p-CH＝CH-CH＝C-(CH2)q，其中，p和q每个都独立地表示0或1，并且p+q＝0或1其能被所述P.chrysogenum菌株吸收利用以生产合适的酰基-6-氨基青霉烷酸(酰基-6-APA)的其盐或酯，由此生产出所述酰基-6-APA；B)通过相应基因的原位表达来进行下述酶转化过程i)通过扩展酶对酰基-6-APA进行原位环扩展，形成相应的酰基-7-氨基-去乙酰氧基头孢烷酸(酰基-7-ADCA)，其中所述P.chrysogenum菌株已经经过了编码扩展酶的DNA的转化，所述扩展酶能接受所述酰基-6-APA作为底物，其表达由此使得所述菌株生产的所述酰基-6-APA随后原位环扩展形成相应的酰基-7-ADCA；ii)所述酰基-7-ADCA的3-甲基侧链被羟化酶原位羟基化，形成相应的酰基-7-氨基-去乙酰氧基头孢烷酸(酰基-7-ADAC)，其中所述P.chrysogenum菌株已经经过了编码羟化酶的DNA的转化，所述羟化酶能接受所述酰基-7-ADCA作为底物，其表达由此使得所述菌株生产的所述酰基-7-ADCA随后原位羟化形成相应的酰基-7-ADAC；iii)所述酰基-7-ADAC的3-羟甲基侧链被O-氨基甲酰转移酶原位O-甲酰氨化，形成如结构式(I)所示的化合物，其中所述P.chrysogenum菌株已经经过了编码O-氨基甲酰转移酶的DNA的转化，所述O-氨基甲酰转移酶能接受所述酰基-7-ADAC作为底物，其表达由此使得所述菌株生产的所述酰基-7-ADAC随后原位甲酰氨化形成根据本发明的化合物。
5.如权利要求1所述的化合物在生产3-头孢菌素类抗生素中的用途。
6.如权利要求1所述的化合物在生产3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素类抗生素中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素类抗生素选自由如下物质所构成的组a.头孢呋辛b.头孢西丁c.头孢卡品酯。
8.如权利要求1所述的化合物在生产7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢菌素-4-羧酸或其盐或酯中的用途。
9.P.chrysogenum种的微生物，其能生产异青霉素N，并被提供了编码如下物质的DNA片段a.扩展酶b.羟化酶c.O-氨基甲酰转移酶。
10.P.chrysogenum种的微生物，其能生产异青霉素N，并被提供了编码如下物质的DNA片段a.扩展酶/羟化酶的组合酶b.O-氨基甲酰转移酶。
11.含有如权利要求1-3所述的化合物的药物制剂。
全文摘要
本发明涉及新颖的头孢菌素类化合物以及生产该化合物的方法，所述方法可以包括发酵步骤、化学步骤和/或生物转化步骤，或者所述方法由上述步骤组成。本发明的如结构式(I)所示的头孢菌素类化合物或其盐或酯，可通过本发明的发酵技术来制备，具体而言，使用适当的微生物，所述微生物具有或已被转入能将适当的酰基－6－氨基青霉烷酸转化为目标化合物的基因；结构式(Ⅰ)中，R选自由如下基团构成的组(羧基甲硫基)丙酰基、(羧基乙硫基)丙酰基、Y－CH
文档编号C07D501/00GK1795197SQ200480014637
公开日2006年6月28日 申请日期2004年5月24日 优先权日2003年5月28日
发明者马尔科·亚历山大·范德勃戈, 鲁洛夫·阿利·兰斯·伯韦比格, 罗拉纳·麦德勒尼·罗涅·拉姆斯多克, 约翰·大卫·萨瑟兰蒂, 埃里克·德弗鲁姆, 洛兰德·克里斯琴·罗埃尔·沃林格 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司