专利名称：封闭效率提高的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及根据氨基酸序列信息筛选有封闭能力的新型封闭用蛋白质或新型部分序列的候选蛋白质的方法，本发明还涉及通过改变蛋白质的氨基酸序列从而提高了封闭效率的蛋白质。此外，还涉及含有该蛋白质的封闭试剂、稳定剂、赋形剂、折叠辅助剂、重折叠辅助剂、医用敷料。本发明能够增进可以在大肠杆菌中大量表达的蛋白质的封闭效率，对于通过重组方法大量生产封闭效率优越的蛋白质是有用的。
背景技术：
以往在免疫测定等技术中使用的封闭剂，大多一直采用从生物体成分中直接提取的蛋白质。特别是长期广泛使用来自牛的清蛋白和酪蛋白等。但是，由于近年来疯牛病等问题，这些蛋白的使用受到了诸多限制。另一方面，利用重组体制备该类物质的方法，其优点是可以排除病原体(物质)，但由于大量生产性方面等存在问题而很少达到实用技术水平。
因此，试探采用来自大肠杆菌等的蛋白质作为替代蛋白质使用，从大量生产性方面来看可以认为是合适的。然而，可以大量表达的蛋白质不一定就有很好的封闭效果，所以必须找到能够用重组体生产的封闭效果好的蛋白质。
近年来，尽管已经查明了各种生物的基因序列，但根据预测的氨基酸序列找到封闭效果好的蛋白质的规律尚未掌握，看来要找到该类蛋白质需要付出大量的工作。
根据这样的理由，需要有能够用重组体大量生产的封闭效果好的替代蛋白质。
附图简要说明
图1表示封闭效率测定概念的图。
图2表示蛋白质的两分法的图。
图3表示具有封闭能力的蛋白质的封闭机制的图。
图4表示DnaK384-607的立体结构的图。β片部分相当于N末端，α螺旋部分相当于C末端。
图5表示各种DnaK变异体显示的封闭效率的图。图5中，空白无封闭效果384-638DnaK384-638384-607DnaK384-607384-578DnaK384-578；除去了α螺旋的一部分结构的变异体384-561DnaK384-561；除去了α螺旋的大约一半结构的变异体508-607DnaK508-607；除去了β片部分的结构变异体(由α螺旋构成)525-607DnaK525-607；除去了β片部分和α螺旋的一部分结构的变异体(由α螺旋构成)BSABSA级分V图6表示大肠杆菌DnaK蛋白质的结构、以及制备成的变异体的结构的图。
图7表示DnaK 381-553的立体结构的图。
图8表示疏水域发生改变的蛋白质的封闭机制的图。
图9表示各种DnaK变异体显示的封闭效率的图。
384-607DnaK384-607384-607(VAV)DnaK384-607(D479V，D481V)419-607DnaK 419-607
BSABSA级分V空白无封闭效果图10表示DnaK变异体浓度和封闭效率相关性的图。
图11表示DnaK变异体的封闭速度的图。
图12表示DnaK变异体在酶联免疫检测(ELISA)的封闭中的应用的图。
图13表示频繁封闭用蛋白质和疏水性高的蛋白质的亲水性与疏水性氨基酸的含有率。
图14表示BSA、α酪蛋白、脂肪酶、DnaK384-607的N末端侧与C末端侧含有的氨基酸的特征。 表示N末端侧与C末端侧的亲水疏水率的差的绝对值。
图15表示没有组氨酸标记(天然)的DnaK片段的封闭效果的比较。调整BSA(级分V)的浓度为10mg/ml，天然的DnaK419-607片段的浓度为0.5mg/ml，与其在高浓度下进行比较。另外，调整BSA(级分V)浓度为2mg/ml，天然的DnaK419-607片段的浓度为0.1mg/ml，与其在低浓度下进行比较。
图16图示图15中高浓度的数据。
图17图示图15中低浓度的数据。
发明的公开本发明的目的是提供根据氨基酸序列简便地找到有封闭能力的蛋白质的方法，同时提供借助大肠杆菌等细菌能大量表达，而且由于改变了氨基酸序列而封闭效率提高的蛋白质。
在上述背景下，通过精心研究，发现了与有封闭能力的蛋白质的特征氨基酸序列相关的性质，同时还发现改变这样发现的蛋白质的氨基酸序列能够显著增进其封闭效率，从而完成了本发明。
本发明由以下诸部分组成。
(1)根据氨基酸序列信息筛选有封闭能力的新型封闭用蛋白质或部分序列的候选蛋白质的方法，筛选满足以下条件的蛋白质或部分序列蛋白质A.将蛋白质的氨基酸序列一分为二，根据各自的亲水性氨基酸(D、E、K、H、R、Y)和疏水性氨基酸(G、A、V、L、I、M、F、W、P)的含有率用下式计算出的一分为二的各部分中亲水/疏水率之差的绝对值为0.1以上；(亲水/疏水率)＝(亲水性氨基酸含有率)/(疏水性氨基酸含有率)B.亲水性部分(亲水/疏水率高的一方的值)为0.5以上；C.由超过100个氨基酸残基组成。
(2)用(1)所述方法筛选到的有封闭能力的新型封闭用蛋白质或部分序列的候选蛋白质，其可以通过下述D的解析工序获得，并满足下述E的条件D.1.聚苯乙烯制免疫滴定板上的各孔中分别加入满足上述1的条件的候选蛋白质(0.5～1mg/ml用20mM Tris-HCl(pH7.0)稀释)以及同样制备的牛血清蛋白(级分V)，在2℃～10℃封闭4～5小时，将液体丢弃的工序；2.加入用PBS(-)稀释25～100倍的正常人血清，在37℃放置1小时后，用PBS(-)(0.05％Tween 20)清洗板的工序；3.使用经酶标记的抗人IgG抗体，通过使用显色法的比色法比较非特异吸附在板上的IgG量的工序；E.候选蛋白质的显色是牛血清蛋白显色的2.5倍以下。
(3)用(1)所述方法筛选到的有封闭能力的新型封闭用蛋白质或部分序列的候选蛋白质，其可以通过下述F的解析工序获得，并满足下述G的条件D.1.将来自西洋辣根的标记用过氧化物酶溶解到候选蛋白质溶液(0.5～1mg/ml用PBS(-)稀释)以及同样制备的牛血清蛋白(级分V)中，使其浓度为0.05mg/ml的工序；2.将上述稀释液分配到聚苯乙烯制96孔微型板中的工序；3.在25℃放置1小时后，除去溶液，用含0.02％Tween 20的PBS(-)清洗的工序；4.加入四甲基联苯胺溶液，37℃保温后，加入1N硫酸停止反应并使其显色的工序；5.通过微型板读数器测定显色的工序；G候选蛋白质的测定值为牛血清蛋白显色的2.5倍以下。
(4)用(1)所述方法筛选到的有封闭能力的新型封闭用蛋白质或部分序列蛋白质，其可以通过下述H的解析工序获得，并满足下述I的条件H.1.在聚苯乙烯制免疫滴定板上的各孔中分别加入满足上述1的条件的候选蛋白质(0.5～1mg/ml用PBS(-)稀释)以及同样制备的牛血清蛋白(级分V)，在2℃～10℃封闭4～5小时，将液体丢弃的工序；2.加入配制成浓度为0.05mg/ml的过氧化物酶溶液，37℃放置1小时后，用PBS(-)(0.05％Tween 20)清洗板的工序；3.25℃放置1小时后，除去溶液，用含0.02％Tween 20的PBS(-)清洗的工序；4.加入四甲基联苯胺溶液，37℃保温后，加入1N硫酸停止反应并使其显色的工序；5.通过微型板读数器测定显色的工序；I.候选蛋白质的测定值为牛血清蛋白显色的2.5倍以下。
(5)通过满足(1)所述条件A、B、C的蛋白质或部分序列蛋白质的氨基酸序列的改变而获得的封闭效率提高的新型蛋白质。
(6)上述(5)所述的封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，借助氨基酸置换、减除、插入改变了氨基酸序列。
(7)上述(5)所述的封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，来自原核生物或真核生物。
(8)封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，来自“HSP70家族蛋白质”。
(9)上述(8)所述的封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，来自DnaK蛋白质。
(10)上述(8)所述的封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，是除去了DnaK蛋白质的一部分氨基酸序列而得到的蛋白质。
(11)上述(8)所述的封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，是除去了DnaK蛋白质的一部分氨基酸序列而得到的蛋白质，并且从N末端至少到第387个，至多到第472个氨基酸序列被除去了。
(12)上述(8)所述的封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，是除去了DnaK蛋白质的一部分氨基酸序列而得到的蛋白质，并且从N末端至少到第387个，至多到第418个氨基酸序列被除去了。
(13)上述(8)所述的蛋白质，由DnaK蛋白质的第419～607个氨基酸序列组成。
(14)上述(8)所述的封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，ATPase域或其一部分被除去的DnaK蛋白质的一部分亲水性氨基酸被置换成疏水性氨基酸。
(15)上述(8)所述的封闭效率提高的蛋白质，其为ATPase域或其一部分被除去的DnaK蛋白质的一部分氨基酸序列被除去的蛋白质，其中氨基酸序列中第479和第481的天冬氨酸被置换成了缬氨酸。
(16)上述(8)所述的封闭效率提高的蛋白质，其由DnaK蛋白质的第384～607氨基酸序列组成，并且氨基酸序列中第479和第481的天冬氨酸被置换成了缬氨酸。
(17)具有一个以上亲水域和一个以上疏水域的封闭用蛋白质，其中疏水域可以吸附在器壁上，亲水域可以覆盖吸附在器壁上的疏水域。
(18)被改变了的蛋白质，其特征在于，封闭速度比BSA提高。
(19)上述(18)所述的被改变了的蛋白质，其特征在于，在3小时封闭中，在调整蛋白质量使得显示与BSA同等的封闭效率的条件下，小于10分钟的封闭能力比BSA优良。
(20)上述(2)～(19)任一项所述的蛋白质，其特征在于，具有标记序列。
(21)上述(20)所述的蛋白质，其特征在于，标记序列从组氨酸标记、麦芽糖结合蛋白(MBP)标记、谷胱甘肽S转移酶(GST)标记、Flag标记、Myc标记、串连型亲和纯化标记中选择。
(22)蛋白质的生产方法，其特征在于，用原核生物生产上述(2)～(21)任一项所述的蛋白质。
(23)蛋白质的生产方法，其特征在于，用大肠杆菌生产上述(2)～(21)任一项所述的蛋白质。
(24)蛋白质的生产方法，其特征在于，用无细胞蛋白质合成法生产上述(2)～(21)任一项所述的蛋白质。
(25)上述(2)～(21)任一项所述的蛋白质的提纯方法，其特征在于，经过加热工序。
(26)将上述(2)～(21)任一项所述的蛋白质在封闭、稳定、赋形、折叠辅助、重折叠辅助、包膜、医疗应用中使用的方法。
(27)封闭试剂、稳定剂、赋形剂、折叠辅助剂、重折叠辅助剂、包膜剂或医疗用包膜剂，含有上述(2)～(21)任一项所述的蛋白质。
实施本发明的最佳方式本文所述的封闭过程，是指阻碍成分非特异地吸附到容器或载体上，特别是阻碍蛋白质非特异地吸附到塑料等树脂上。在各种测定中，由于测定的对照成分非特异地吸附到容器壁上，作为背景而阻碍测定，因而造成问题。特别是在免疫学测定中，抗体在聚苯乙烯板上的吸附显著，通常广泛采用预先加入容易吸附在树脂上的蛋白质以阻碍抗体非特异吸附的操作，即封闭操作。在免疫测定中，由于必须使蛋白质物理吸附到器壁上，所以广泛采用容易吸附蛋白质的聚苯乙烯等树脂制成的板，但由于附加成分的吸附显著，因而现实中常常需要有更好的封闭剂。此外，临床上使用的诊断药物中，也多发生诊断用酶非特异吸附在自动分析仪的小池上的问题。
本发明主要考虑到免疫学测定，通过测定已知作为最显著的非特异吸附的例子的人血清中的IgG在聚苯乙烯板上的非特异吸附，测定封闭效果。即测定由以下工序组成。
(1)在聚苯乙烯制96孔板上加入要研究其封闭能力的蛋白质溶液，静置一定时间，封闭板。
(2)除去(1)中的液体，加入稀释了的人血清，保温。
(3)清洗板后，加入标记的抗人IgG抗体，保温。
(4)清洗板后，用比色法比较非特异结合的IgG量。
详细方法见下述，在进行本发明时该方法非常有效。本方法的概述如图1所示。
以往广泛使用牛血清蛋白(BSA)或牛乳中的酪蛋白等作为封闭试剂。但是，这种高封闭能力来自蛋白质的何种性质，还没有从理论上作出解释，一般认为是由于其疏水性。
为此，首先以研究疏水性高的蛋白质是否具备封闭能力为目的，采用了来自已知疏水性氨基酸含量高的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的脂肪酶作为封闭剂，考查其封闭能力。脂肪酶在临床检验中广泛使用，但已知它们在聚苯乙烯表面吸附能力高而在测定时因吸附在小池上而会带来问题。不过，实验结果表明，几乎看不出有封闭效果。图13表示了各种蛋白质中亲水性氨基酸和疏水性氨基酸的比率等，将它们加以比较，可知BSA和酪蛋白的疏水性比脂肪酶的疏水性要低。从这个事实可以研究的事项是，蛋白质因其疏水性而发生吸附的现象与封闭能力有关系，然而并非完全如此。推测脂肪酶没有表现封闭能力的原因，是由于吸附在器壁上的脂肪酶上蛋白质非特异地吸附而造成的。
此处所谓亲水性氨基酸、疏水性氨基酸，不同教科书有不同的定义，本发明中的定义是，亲水性氨基酸指天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸。疏水性氨基酸则为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸。
本发明中将天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸定义为亲水性氨基酸。另外，将甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸定义为疏水性氨基酸，亲水性氨基酸中，组氨酸和酪氨酸，特别是酪氨酸的亲水性低；疏水性氨基酸中，甘氨酸和丙氨酸，特别是丙氨酸的疏水性低，为了更严密地进行预测，将酪氨酸和甘氨酸排除进行计算，更理想的是，将组氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丙氨酸都排除，可以得到较好的计算结果。另外，在后述的封闭能力的改变中，想法中优选用亲水性、疏水性的强弱进行改变。
然后，由各种片段计算各氨基酸的含有率。结果，证明了在通过将显示封闭能力的BSA(没有信号肽)和来源于牛的α酪蛋白(没有信号肽)等的氨基酸序列一分为二而得到的各部分，例如N末端侧和C末端侧，亲水性氨基酸含有率和疏水性氨基酸含有率的趋势是不同的(14)。在本发明中，亲水性氨基酸和疏水性氨基酸含有率的比值，方便地定义为“亲水/疏水率”。已知BSA的N末端侧的亲水/疏水率是1.00，而C末端侧为0.83，有0.17的差异。α酪蛋白N末端侧亲水/疏水率是0.88，而C末端侧0.64，有0.24的差异。另一方面，不表现封闭能力的来自假单胞菌(Pseudomonas)的脂肪酶中N末端侧是0.39，而C末端侧为0.44，差异是0.05，也小于0.1。根据这些考查结果，推测为了表现封闭能力，在蛋白质分子中除比较疏水的区域之外，亲水性领域也是必要的。
在本发明的蛋白质中，亲水性部分、疏水性部分和全长的亲水/疏水率优选以下范围。
亲水性部分的亲水/疏水率是0.5～2.0，更优选为0.7～1.7，进一步优选为0.8～1.5。
疏水性部分的亲水/疏水率是0.2～1.1，更优选为0.3～1.0，进一步优选为0.4～0.9。
整个蛋白质分子的亲水/疏水率是0.4～2.0，更优选为0.5～1.5，进一步优选为0.6～1.0。
亲水性部分和疏水性部分的亲水/疏水率之差(绝对值)优选是0.1～0.6，更优选为0.15～0.5，进一步优选为0.15～0.4。
亲水性部分和疏水性部分也可以均是一分为二的各部分，例如C末端侧(或C末端侧)。
在本发明中，假定亲水性部分和疏水性部分存在于被一分为二的各部分，例如C末端侧或N末端侧，但是，在N末端侧或C末端侧添加既非亲水性又非疏水性的序列后的蛋白质，只要有亲水性部分和疏水性部分，就包含在本发明中。
此外，本发明还包含图2所示的亲水性部分-疏水性部分-亲水性部分、疏水性部分-亲水性部分-疏水性部分、以及亲水性部分-疏水性部分-亲水性部分-疏水性部分等各种顺序的部分。
根据以上事实，估计是一种疏水部分(疏水域)吸附在器壁上，而亲水部分(亲水域)覆盖在它上面的形态，整体来看，则是通过用亲水部分(亲水域)覆盖器壁，从而进行了封闭。其模式如图3所示。脂肪酶不表现封闭能力的原因考虑是，虽然被吸附，但因为吸附的蛋白质过于疏水，所以进一步发生向该蛋白质的非特异吸附。
吸附在器壁上的疏水性部分和覆盖疏水性部分的亲水性部分的比率，基于疏水性部分为1，则亲水部分是0.3～10，优选是0.5～5，更优选是0.7～2。如果疏水性部分过大，则不能被亲水性部分覆盖，吸附在器壁上的疏水性部分上会进一步吸附其它蛋白质。而如果亲水性部分过大，吸附在器壁上的疏水性部分面积过小，不能牢固吸附，从而使封闭效率降低。
此外，在本发明中，所谓“一分为二”，并不意味着全部序列被分为50％和50％，而是指分为疏水性部分和亲水性部分两部分。亲水性部分和疏水性部分二者之一或二者都有多个的情况下，则多个存在的亲水性部分/疏水性部分的亲水/疏水率便取平均值计算。再者，亲水性部分和疏水性部分各自具有成群的部分，优选有域结构，各部分占全部序列的20％以上，优选30％以上，更优选40％以上。不过在不知道蛋白质结构或者预测困难的情况下，优选把氨基酸序列区分为N末端侧和C末端侧两部分进行解析，这样是有效的。
就图14所见，亲水域和疏水域之间亲水/疏水率的差异在不同蛋白质间有所波动，看来仅仅靠这个差异值的大小可能并不详细地反映封闭能力。可认为其中因子之一是分子量。在本发明中，所谓“由多于100个残基的氨基酸构成”，意指整个氨基酸序列的氨基酸总数为100个以上的残基。优选由多于150个残基的氨基酸构成，更优选由多于200个残基的氨基酸构成。同时，其上限优选是2000个氨基酸残基，优选上限是1500个氨基酸残基，进一步优选上限是1000个氨基酸残基。亲水性部分或亲水域的氨基酸数目，优选为30个以上氨基酸残基，更优选50个以上氨基酸残基，进一步优选60个以上氨基酸残基，特别优选80个以上氨基酸残基，另外，优选1000个以下氨基酸残基，更优选500个以下氨基酸残基。
疏水性部分或疏水域的氨基酸数目，优选是30个以上氨基酸残基，更优选是50个以上氨基酸残基，进一步优选是60个以上氨基酸残基，特别优选是80个以上氨基酸残基，另外，优选1000个以下氨基酸残基，更优选500个以下氨基酸残基。
本文所谓的域，是指具有分子结构上或功能上一个集中的区域，在本发明中，主要指具有结构上集中的单位。
然后，我们采用单纯的蛋白质来验证这种假设是否正确。该实验中，采用了作为一种大肠杆菌热激蛋白的HSP70(DnaK)的底物结合域。该蛋白质(DnaK384-607)已经NMR解析查明了它的结构(图4)，已知它由两个结构区域(域)，即N末端侧的β片区域(域)和C末端侧的α螺旋区域(域)组成。还通过计算知道序列的N末端侧的亲水/疏水率为0.5，C末端侧为0.89，二者之差高达0.39。
为此，首先确认了该蛋白质(DnaK384-607)表现了封闭能力，然后确认了虽然还没有达到BSA那样的程度，但它有封闭能力(图5)，从而说明了本发明的方法是有效的。
其次，制备了DnaK384-607的各种缺失突变体，研究DnaK的何种结构对封闭起重要作用。本次研究的变异体如图6所示。所研究的蛋白质，有DnaK384-638、DnaK508-607、DnaK384-578、DnaK384-561、DnaK508-607和DnaK525-607等5种变异体。这些蛋白质都可以以大肠杆菌为宿主大量表达，可以在各蛋白质的N末端连接组氨酸标记进行表达，用镍螯合柱简单纯化，即能用于实验。本实验采用增加了组氨酸标记的蛋白质进行研究，但由于标记很小，其影响可以忽略。当然，已确认没有标记时也能得到同样的效果(实施例7)。
实验结果表明，被认为是除去了α螺旋结构的一部分而得到的DnaK384-578、DnaK384-561和除去了β片部分而只有α螺旋结构的DnaK508-607和DnaK525-607的封闭效率明显降低(图5)。关于DnaK384-561，已通过NMR解析查明了与其接近的DnaK381-553的立体结构(图7)，据此类推，可预测α螺旋结构已被破坏。根据这些结果，可以得出以下启示。即(1)有封闭能力的蛋白质的亲水部分的缩小或结构破坏就会损害封闭能力。(2)仅仅亲水性部分并不表现封闭能力。这看来是因为，要发挥封闭能力，除疏水性部分以外，亲水性部分也是重要的，如图3所示，表现封闭能力的蛋白质以疏水性部分吸附在板上，以亲水性部分覆盖在板表面，从而表现出封闭效果。预测该DnaK正好对应于图3的左图。
已知变性或突变等一般会造成二级结构破坏，蛋白质的亲水性会丧失，根据上述DnaK的实例也可以预料通过破坏亲水域，不适合制备部分序列蛋白质。与此相反，如图8所示，看起来通过破坏疏水域，可以提高疏水性。
同时，在本发明中，看来域是重要的，必须有至少多于一个的结构域。构成一个结构域所需的100个氨基酸是一个粗略的标准。因此，本发明需要具有由至少多于100个氨基酸残基组成，即多于一个结构域的结构。
根据这些事实，本发明提供一种根据氨基酸序列信息筛选有封闭能力的新型封闭用蛋白质或部分序列蛋白质的方法。更具体而言，即满足以下条件的蛋白质或部分序列蛋白质的筛选方法。
A将蛋白质的氨基酸序列一分为二，根据各自的亲水性氨基酸(D、E、K、H、R、Y)和疏水性氨基酸(G、A、V、L、I、M、F、W、P)含有率使用下式计算出的一分为二的各部分中亲水/疏水率之差的绝对值为0.1以上；(亲水/疏水率)＝(亲水性氨基酸含有率)/(疏水性氨基酸含有率)B亲水性部分(亲水/疏水率高的一方的值)为0.5以上；C由超过100个氨基酸残基组成。
上述条件中，D表示天冬氨酸、E表示谷氨酸、K表示赖氨酸、H表示组氨酸、R表示精氨酸、Y表示酪氨酸、G表示甘氨酸、A表示丙氨酸、V表示缬氨酸、L表示亮氨酸、I表示异亮氨酸、M表示蛋氨酸、F表示苯丙氨酸、W表示色氨酸、P表示表示脯氨酸。教科书上关于亲水性氨基酸和疏水性氨基酸的定义有各家之说，在本发明中，将天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸定义为亲水性氨基酸。同时将甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸定义为疏水性氨基酸。
本发明中所谓部分序列蛋白质，表示由野生型蛋白质的一部分氨基酸序列构成的蛋白质，优选具有多于一个结构域的蛋白质。
例如，将氨基酸序列分成N末端侧和C末端侧两部分时，并不必须精确地二分，但优选将两方氨基酸的数目分割得大体相等。当从氨基酸序列预测信号肽时，最好将该部分排除后再计算。实际上在本发明中，在BSA、α酪蛋白、脂肪酶中，都是使用除去了信号肽的成熟型的氨基酸序列来计算的。
此外，如图2所示，也优选使用分成N末端侧和C末端侧的二分法以外的分割方法。此时，该方法可以优选应用于立体结构不清楚的蛋白质和预测立体结构的蛋白质。
要根据氨基酸一级序列计算各种氨基酸含量，采用基因氨基酸序列解析软件是有效的。对解析软件并没有特别指定，但本发明采用的是GENETYX(软件开发公司)。
再者，利用软件的疏水性计算功能，将蛋白质的疏水性和亲水性加以图形化，对于提高筛选作业的效率也是有效的。优选采用hopp&woods的计算式。
另外，本发明是用上述方法根据氨基酸序列筛选到的有封闭能力的蛋白质或部分序列蛋白质，通过下述D的所述解析工序得到，并满足E所述条件。
D1.聚苯乙烯制免疫滴定板上的各孔中分别加入满足上述1的条件的候选蛋白质(0.5～1mg/ml，用20mM Tris-HCl稀释，pH7.0)以及同样制备的牛血清蛋白(级分V)，在2℃～10℃封闭4～5小时，将液体丢弃的工序；2.加入用PBS(-)稀释25～50倍的正常人血清，在37℃放置1小时后，用0.05％Tween 20清洗板的工序；3.使用经酶标记的抗人IgG抗体，通过使用显色法的比色法比较非特异吸附在板上的IgG量的工序；E候选蛋白质的显色是牛血清蛋白显色的2.5倍以下，优选2倍以下，更优选1.5倍以下，进一步优选1.2倍以下，特别是1倍以下。
在此，以已知在塑料板上的非特异吸附显著的人血清中的IgG的非特异吸附作为大致标准测定封闭能力。这里所说的聚苯乙烯免疫滴定板(96孔型)是免疫测定中通常使用的聚苯乙烯制96孔型的免疫滴定板。采用经适当方法纯化的候选蛋白质，将其最终浓度用20m M Tris-HCl(pH 7.0)稀释为50～100mg/ml。同时也同样制备牛血清蛋白(BSA)。BSA可以用SIGMA公司等出品的级分V。另外只要性能相同，不特别采用级分V也可以。2℃～8℃封闭4～5小时后，完全弃去液体，清洗并进入下一步操作。
此处采用的人血清只要是由正常人分离的血清，则没有特别限制，原液是高浓度的，因此最好用PBS(-)稀释25～50倍后使用。血清中的IgG含量存在个体差异，因此稀释率可以稍作变更。对板的非特异吸附在37℃进行30分钟。为了准确测定此时加入的血清量，优选最初加入量少于封闭的液量。例如，用100μl封闭时，加入50μl稀释血清溶液。最后，精确进行1小时反应后，弃去液体，用充分量的0.05％Tween/PBS(-)清洗。清洗操作优选进行3次以上，更优选进行4次。清洗操作可以使用专用的洗板机。
然后，用适当的溶液将酶标记的抗人IgG抗体稀释到合适浓度，加入上述孔中。反应时间以37℃1小时为宜。抗体的稀释优选是通常免疫学检测所采用的程度，并且优选使用含有对抗体的稀释适合的封闭剂(BSA或酪蛋白)溶液，因为没有变动，更优选用0.01M磷酸缓冲液(pH7.4)、0.15M NaCl、0.5％酪蛋白。标记用的酶，优选用过氧化物酶和碱性磷酸酯酶，特别优选使用过氧化物酶。过氧化物酶用的显色试剂，优选采用四甲基联苯胺(TMBZ，即3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine)。碱性磷酸酯酶的显色底物可以采用WT-1。显色时间希望是目标孔的吸光度没有失去定量性的程度(0.5～1.5)。要注意，超过定量范围时，得不到正确的数据。全部操作中如果板不干燥，则不能取得正确数据。
如上操作获得的数值越低表示封闭效率越高，在本发明中，显示BSA的数值的2.5倍以下的值时，判定为有封闭能力。所以，本发明的有封闭能力的新型封闭用蛋白质或部分序列蛋白质满足权利请求1所述条件，而且本次测定得到显示BSA的数值的2.5倍以下的值，即有封闭能力的蛋白质。
实施例7所示方法可以作为本测定的替代方法。这种方法是将逐次稀释的过氧化物酶溶解在候选蛋白质溶液中，供给固相中，令其吸附一定时间后，测定过氧化物酶的非特异吸附。
确定被吸附的过氧化物酶的方法同上，优选使用四甲基联苯胺(TMBZ，即3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine)的显色法。本次测定中，也以显示BSA的值的2.5倍以下的值作为为有封闭能力的指标。另外，同样地，优选在预先封闭的固相上加入稀释了的过氧化物酶溶液，测定非特异吸附。此时也以显示BSA的值的2.5倍以下的值作为有封闭能力的指标。所用过氧化物酶溶液的浓度，优选使用0.05mg/ml，但应作适当调整后使用，以便可以在常规范围内测定，由此可以获得更正确的评价。过氧化物酶的稀释优选用PBS(-)进行，但并不特别限定。
因此，本发明优选具有多于一个域结构的结构，而象该例一样，特别是疏水侧的域中在两个域中缺少一个域结构的一部分也可以。本发明的蛋白质或部分序列蛋白质的氨基酸数目为100个以上，优选150个以上，更优选180个以上。
另外，本发明是新型蛋白质，它是通过改变符合上述1的条件的蛋白质的氨基酸序列，进一步提高了蛋白质或部分序列蛋白质的封闭效率的蛋白质。所谓新型，是在氨基酸的改变水平上称为新型，也可以是已知蛋白质。而对于部分序列蛋白质，新型应视为具有迄今未知的部分序列的蛋白质。
本发明中，氨基酸序列的改变是通过氨基酸置换、消除或插入的任一种进行，或者也可以其组合进行。作为变异的方向性，无论是进一步增加疏水区域的疏水性的变异或进一步增加亲水区域的亲水性的变异都是有效的，可以适合使用。另外，为了使蛋白质的立体结构发生变化，氨基酸序列的插入或消除等也是有效的，还可考虑采用使埋藏在亲水区域的疏水区域暴露于蛋白质分子表面等方法。另一方面，如上述实例所示，破坏亲水域的结构而改变氨基酸是不优选的。
被改变的蛋白质可来源于原核生物，也可来源于真核生物，考虑到用大肠杆菌等大量制备，优选使用来源于原核生物的蛋白质。更优选采用来源于大肠杆菌的蛋白质。采用的蛋白质也可以是域等的部分结构体，宁愿优选采用它。
特别是封闭剂经常与酶等混合后用作稳定剂或赋形剂，没有特别酶活性功能的蛋白质适合本发明。另外，除去了具有酶活性的域的蛋白质等也优选采用。
本发明优选采用来源于HSP70家族蛋白质的蛋白质，更优选来自大肠杆菌DnaK蛋白质的蛋白质。另外，优选地，优选使用除去了ATPase域的HSP70家族的蛋白质的底物结合域，更优选采用除去了大肠杆菌的ATPase域的DnaK蛋白质的底物结合域。DnaK蛋白质的底物结合域，已经作为例子在上面介绍过。
本发明采用的属于HSP70家族的蛋白质，并无特别指定，从大肠杆菌的DnaK、存在于酵母菌细胞质中的Ssa1p、存在于酵母菌线粒体中的Ssc1p、存在于酵母菌内质网中的Kar2p、存在于哺乳动物细胞质中的HSP70、存在于哺乳动物内质网中的Bip、存在于哺乳动物线粒体中的mHsp70、以及与热激的有关无关而正常表达的HSP70的同源物HSC70等中选择。已知HSP70家族中有多种同源物，上述几种只是其中一部分。当然，可以容易地预计上述列举的以外的同源物也可以有同样的效果。
由于对大肠杆菌DnaK的研究进行得特别好，所以比较容易预测氨基酸改变等的效果。这种蛋白质由638个氨基酸构成，由从第1个到第385个氨基酸构成的“ATPase(ATPase结合)域”和从第386到第638个氨基酸构成的“底物结合域”组成(图6)。序列编号1中示出了DnaK蛋白质的序列；序列编号2中示出了基因序列。已知HSP70与新生多肽或部分折叠的蛋白质结合，促进不能自发折叠的蛋白质的重折叠，而且已知它们在蛋白质合成的较前期起作用，所以可识别丰富的底物。
另外，已知DnaK的底物结合的区域本身具有促进变性后的蛋白质重折叠的作用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)99，15398-15403)，考虑通过应用这种分子，可以开发各种应用。
为了完成本发明，我们着眼于DnaK的底物结合域进行了多方面的研究，根据这些研究，可以得到与封闭作用表达的机制有关的多方面的知识，并且完成了本发明。
首先，我们尝试了通过在β片结构部分上添加变异来提高其疏水性，从而制作封闭效率好的蛋白质。该尝试是指(1)通过除去β片N末端的一部分，使β片的更疏水的部分暴露出来(破坏β片结构提高疏水性)，和(2)将β片上的亲水性氨基酸置换成疏水性氨基酸。结果发现，除去了β片结构的N末端部分的DnaK 419-607和将亲水性氨基酸置换成了疏水性氨基酸的DnaK 384-607(D479V，D481V)，封闭效率显著提高(图9)。这一次，特别是在DnaK 419-607中观察到封闭效率的显著提高。看起来这种蛋白质以图8所示的形态表现出封闭能力。即由于改变了疏水域结构，疏水域的结构发生变化，提高了疏水域的疏水性，这与封闭能力的提高相关联。
本发明所谓的封闭能力的提高，是指通过对候选蛋白质进行氨基酸序列置换、缺失或插入等，使得相对于原来的蛋白质或蛋白质的部分序列封闭能力提高。
封闭能力的提高，优选用上述2所述方法测定。另外，封闭能力的提高，有长时间的封闭能力和短时间的封闭能力，两者或两者之一中封闭能力可以提高。
进一步详细考查DnaK 419-607封闭能力显著提高的原因，推测其原因是通过除去了与DnaK底物结合域的コ字型结构的绞链部分相邻的β片部分，用于捕获作为陪伴蛋白的底物的肽的富于疏水性的コ字型结构内侧的一部分暴露于外侧。
即，本发明是封闭效率提高的DnaK蛋白质，其特征在于，从N末端开始，至少到第387个，至多到第472个氨基酸序列被除去了。另外，本发明是封闭效率提高的DnaK蛋白质，其特征在于，从N末端开始，至少到第387个，至多到第418个氨基酸序列被除去了。更优选由DnaK蛋白质的第419到第607个氨基酸序列组成的蛋白质。
另外，本发明是封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，将除去了ATPase域或它的一部分而得到的DnaK蛋白质的一部分亲水性氨基酸置换成了疏水性氨基酸。更详细地说，是将除去了ATPase域或它的一部分而得到的DnaK蛋白质的一部分氨基酸序列除去的封闭效率提高蛋白质，其第479个和第481个氨基酸由天冬氨酸置换成了缬氨酸。更优选使用由DnaK蛋白质的第384到第607个氨基酸序列组成，第479个和第481个氨基酸由天冬氨酸置换成了缬氨酸的蛋白质。
本发明中所谓的改变，是指借助候选蛋白质的氨基酸置换、缺失或插入而改变了氨基酸的序列。对于这种改变，优选通过在选择候选蛋白质或蛋白质的部分序列后进行上述的考查，通过以(1)不破坏亲水域和(2)使疏水域更具有疏水性等为意图改变蛋白质。另外，虽然在本发明中没有叙述，但当然也应该考虑使亲水域更具亲水性。
另外，在本发明中，进行关于封闭速度的研究，显示了本发明的有用性。即测定了在5分钟、10分钟、30分钟和3小时封闭时的封闭效率。结果得知，本次实验效果最显著的DnaK 419-607其在约5分钟的封闭效率是87.5％，而DnaK 384-638是58.8％。该速度比在3小时后表现同等封闭效果的BSA快，预测在非常早的阶段发挥向聚苯乙烯板吸附的封闭效果。因此，使用本发明，有可能开发出性能与常规的BSA效果同等或更好的新型封闭剂。
另外，本发明是具有一个以上亲水性域和一个以上疏水性域的封闭用蛋白质，疏水性域可以吸附在器壁上，亲水性域可以覆盖吸附在器壁上的疏水性域。此处所说的域，优选是由50个以上氨基酸组成的结构氨基酸的簇，即使是一部分氨基酸缺失或添加，也视作域。
另外，本发明对于封闭速度也作了规定。即，改变了的蛋白质，其特征在于，封闭速度比BSA提高。详细而言，是一种改变了的蛋白质，其特征在于，在对蛋白质量进行调整使得在3小时的封闭中显示出与BSA同等封闭效率的条件下，在小于10分钟的封闭能力比BSA优。此处所谓的改变，表示编码野生型蛋白质的基因序列通过氨基酸置换、消除或插入等而被变换了。评价方法并没有特别限定，优选采用实施例5和实施例7中所提供的方法，以IgG或过氧化物酶在聚苯乙烯板上的非特异吸附为指标进行测定。在采用IgG进行评价的方法中，在进行1～10分钟，优选2～10分钟封闭后，加入用PBS(-)稀释的人血清，37℃保温60分钟后，进行清洗，使最适浓度的抗人IgG抗体(过氧化物酶结合)反应，清洗后，用TMBZ显色，由此测定非特异吸附的IgG量。另外，在采用过氧化物酶进行评价的方法中，先用来自西洋辣根的标记用过氧化物酶(东洋纺织(公司)制PEO-131)溶解在待测定封闭能力的蛋白质溶液中，使其浓度为2mg/ml。然后由同一溶液制作过氧化物酶溶解液的40～320倍的系列稀释液，将各稀释液100μl分配到96孔板的各个孔中。室温放置1小时后，除去溶液，用含0.02％Tween20的PBS(-)缓冲液清洗。清洗操作反复进行6次，然后除去清洗液。加入四甲基联苯胺，在37℃精确保温10分钟后，加入1N硫酸停止反应并使其显色。用微型板读数器在主波长450nm副波长650nm下测定显色。详情记载在实施例7中。另外，同样地，在预先封闭的固相上添加稀释的过氧化物酶溶液测定其非特异吸附也可以。此处所用的过氧化物酶溶液的浓度，优选采用0.05mg/ml，但如果进行调整使得可以在常规范围内进行测定，能够更正确地评价。过氧化物酶的稀释可以用PBS(-)进行，但并非特别限定。
另外，在这个实施例中，使用0.7mg/ml的DnaK 419-607和3小时后显示同等封闭能力的浓度为2.4mg/ml的BSA(级分V，SIGMA公司制，(商品编号A-4503))(蛋白质量用Bradford法测定)。待测蛋白质的量可以在用于测定封闭能力的常规范围内，但优选在0.5～1mg范围内。本测定中使用的BSA的浓度，使用显示与待测蛋白质的第3小时的封闭效率同等的封闭效率的量，这需要事先对浓度加以研究。作为用于溶解这些蛋白质的缓冲液，优选采用20mM Tris-HCl(pH 7.0)或PBS(-)，但无特别限定。
本发明所用的蛋白质或蛋白质的片段也可以具有标记，实际上在研究中采用在氨基末端加上了组氨酸的那些进行研究。作为标记，可以采用组氨酸标记、GST(谷胱甘肽S转移酶)标记、MBP(麦芽糖结合蛋白)标记、Flag标记、Myc标记、TAP(串连型亲和纯化标记)中的任一种均可采用，根据需要也可以将各种蛋白质加以融合后应用。而且还可以在已知标记上加入任意的氨基酸序列等。
另外，当然也可以添加一般未知的标记或任意氨基酸序列。具体而言，当使用N末端侧被去除的蛋白质的部分序列时，当然需要在N末端导入蛋氨酸残基。另外，根据表达增加或限制酶的位点的关系，也考虑几个氨基酸的附加。例如在实施例7中的DnaK 419-607的N末端，加上了MRGS的4个氨基酸。当然作为与任意蛋白质的融合蛋白质表达也可以。待添加的位置则既可以是N末端侧也可以是C末端侧。
本发明的蛋白质的表达方法并无特别限制，但优选使用原核生物表达的方法，进一步优选用大肠杆菌表达的方法。另外，表达载体也没有特别限制，可以使用一般用于表达的载体。
本发明的蛋白质的纯化方法，除采用上述标记的纯化方法以外，将粗纯化溶液加热到适当温度，再将其离心上清液加以提纯，有时是效率好的纯化方法。加热温度优选50℃以上，更优选70℃以上。本实验采用的DnaK的底物结合域对热有抗性，在70℃30分钟的条件下未发现凝集，并确认蛋白质仍保留在离心上清部分中。因此，在纯化时，通过用柱色谱等方法对加热的离心上清液进行纯化，可以简单地将蛋白质纯化，是非常经济的方法。此外，经过加热工序，也可以预料共存的酶类已经失活。
本发明的封闭效率提高的蛋白质可以应用于封闭剂、赋形剂、稳定剂、重折叠辅助剂、包膜剂、医用敷料等。特别地，对于其作为利用免疫反应的检测系统中的封闭剂的期待很大，预计可以用于ELISA、免疫组织染色、蛋白质印迹等。实际上，在完成本发明时，已经考查了它在ELISA(酶联免疫吸附检测)中应用的可能性，得到了良好的结果(图12)。
本发明的实施形式之一是含有DnaK 419-607的封闭剂、赋形剂、稳定剂、重折叠辅助剂。
本发明的实施形式之一是含有DnaK 384-607(D479V、D481V)的封闭剂、赋形剂、稳定剂、重折叠辅助剂。
通过以下所示本发明的实施例，将更进一步表明本发明的效果。
实施例1 候选蛋白质的筛选为了从氨基酸序列筛选候选蛋白质，主要使用核酸氨基酸序列解析软件GENETYX(软件开发公司)进行。此软件有根据蛋白质的氨基酸一级序列计算出亲水性氨基酸残基和疏水性氨基酸残基数目的功能，很方便。用GENETYX计算出已经查明有各种封闭能力的蛋白质，以及来自大肠杆菌的蛋白质或部分序列的N末端侧的一半和C末端侧一半序列所含有的亲水性氨基酸和疏水性氨基酸的数目，将亲水性氨基酸含有率、疏水性氨基酸含有率、亲水/疏水率，以及二分的各自的亲水/疏水率之差的绝对值等汇总在图13和图14中。依从GENETYX的定义，亲水性氨基酸指天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸。疏水性氨基酸则为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸。
实施例2 DnaK片段的克隆和表达用从大肠杆菌K-12中提取出的基因组DNA为模板，用PCR法扩增目标基因的片段，将DnaK片段克隆。基因的PCR扩增采用东洋纺织出品的KOD-Plus-。DnaK 384-638扩增的具体过程是在50μl反应液中，制备试样以含有反应用缓冲液、1mM MgSO4、序列编号3和4所表示的引物15p mole、1单位多聚酶和配制100ng大肠杆菌DNA，将在94℃2分钟后，94℃15秒，55℃30秒、68℃1分钟的循环进行25次。另外，同样地，DnaK 386-586的扩增也用序列编号3和4所表示的引物。扩增的DNA片段用限制酶BamHI消化，对pQE30的BamHI-Sma I位点进行克隆(因为采用KOS-Plus-扩增的DNA片段平滑化了，扩增片段的下游一侧可以直接使用)。克隆的基因的序列通过序列分析加以确认。通过在该载体中克隆，可以在目的蛋白质的N末端加上6X His序列(组氨酸标记)。于是制备了表达质粒pQE30-DnaK384-638。
蛋白质的表达和提纯，是使用通过将导入了基因的JM109在LB培养基中振荡培养16小时，通过离心分离法回收菌体，悬浮在20mMTris-HCl(pH 7.0)中，进行超声破碎后，用微量高速离心机以15000rpm离心10分钟而得到的上清液来进行的。具体地，采用His-Select HCNickel Affinity Gel(SIGMA公司制)纯化，最后对Tris-HCl(pH 7.0)透析一夜后用于实验。蛋白质浓度测定使用以BSA为标准品的Bradford法测定(BIORAD Bio-Red protein Assay试剂盒；500-0006)。
实例3 除去C末端的DnaK克隆和点突变体的制备除去C末端的DnaK克隆，是以实施例1制备的pQE-DnaK 384-638为模板，采用Quickchange法在任意部位导入终止密码来制备的。实验采用Quick change site directive mutagenesis kit(Stratage公司制)，根据使用说明书进行。各个制备的克隆和在克隆中利用的引物的序列的组合如下DnaK 384-638序列编号5和6、DnaK 384-578序列编号7和8、DnaK 384-561序列编号9和10。另外，DnaK 384-607(D479V、D481V)是以pQE30-DnaK 384-607为模板，使用序列编号11和12进行变异的导入。制备的各个变异体用序列分析确认序列后，依照实施例1所述方法制备蛋白质。
实施例4 除去N末端的DnaK克隆的制备用实施例2制备的pQE-DnaK 384-607为模板，以下列引物进行PCR扩增，根据实施例1的方法，导入pQE30载体的BamHI-Sma I位点。用作制备克隆的引物组如下DnaK 508-607序列编号13和2；DnaK 525-607序列编号14和2；DnaK 419-607序列编号15和2。所制备的各种变异体通过序列分析确认序列后，按实施例1所述方法制备蛋白质。
实施例5 封闭效果封闭效果用以下方法测定。
以人血清IgG对聚苯乙烯板的非特异吸附为指标进行研究。
方法是，在20mM Tris-HCl(pH 7.0)中稀释的BSA(SIGMA公司，级分V)和各种DnaK样品，取100μl加入96孔聚苯乙烯板(Costar公司制，E.I.A./R.I.A 8Well Strip)上，在4℃静置4小时(原则上静置4小时，在研究封闭时间时任意设定封闭时间)。随后从板上除去溶液，然后加入50μl用PBS(-)稀释50倍的正常人血清，37℃保温1小时。然后将各孔用200μl清洗液(PBS(-)，0.05％Tween20)清洗4次，在各孔中加入50μl用抗体稀释液(0.01M PB(pH7.4)、0.15M NaCl、0.5％酪蛋白)稀释至最适浓度的过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(JacksonImmuno Research公司制)，37℃保温1小时。各孔再用200μl清洗液(PBS(-)，0.05％Tween20)清洗4次，加入100μl显色剂(四甲基联苯胺(TMBZ，3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine)，在室温下显色5分钟，用50μl 1N硫酸停止反应。用读数仪，以主波长450nm，副波长650nm测定显色。蛋白质的定量用Bradford法测定。
首先，对于制备成0.7mg/ml浓度的BSA、DnaK 384-638、DnaK384-607、DnaK 384-578、DnaK 508-607、DnaK 525-607测定4小时的封闭效率。结果如图5所示，对于BSA、DnaK 384-638、DnaK 384-607以外的那些而言，封闭效果低。在封闭效果低的克隆中，DnaK 384-607、DnaK 384-578是α螺旋被消除的克隆，而DnaK 508-607和DnaK525-607则是消除了β片的克隆，推测在使用DnaK的底物结合域的封闭中α螺旋结构和β片结构二者都是必需的。
其次，使用同浓度的BSA和DnaK 384-607作为对照，在以提高β片部分的疏水性为目的制备的DnaK 384-607(D479V、D481V)和DnaK 419-607(浓度各为0.7mg/ml)中比较4小时的封闭效果。结果表明，DnaK 384-607(D479V、D481V)、和DnaK 419-607都有比同浓度的BSA高的封闭效果，特别是DnaK 419-607更为显著。
进一步，对于上述实验中封闭效果最高的DnaK 419-607和DnaK384-638、BSA，考查了封闭浓度和封闭第4小时的封闭效果。结果，0.15mg/ml的DnaK419-607比12mg/ml的BSA的封闭效果显著，暗示着可以非常低浓度作为封闭剂使用(图10)。
最后，进一步对于上述实验中封闭效果最高的DnaK 419-607和DnaK 384-638、BSA，对于封闭时间和封闭效果进行了研究。蛋白质的浓度，对于DnaK 419-607和DnaK 384-638为0.7mg/ml，BSA浓度则为显示与上述研究的0.7mg/ml的DnaK419-607同等的封闭效果的2.4mg/ml。结果表明，DnaK 419-607的封闭时间大为缩短到10分钟而封闭效果充分，比在封闭3小时后才看到同等效果而浓度为2.4mg/ml的BSA的封闭速度更快(图11)。
实施例6 封闭效果(ELISA)用人类癌的胎儿性抗原(Carcinoembrionic antibodyhCEA)的ELISA系统，研究了DnaK的片段作为封闭剂的有用性。首先，用50mM的碳酸缓冲液(pH9.6)将hCEA MoAb稀释到10μg/ml后，各取100μ1加入96孔聚苯乙烯板(Costar公司制，E.I.A./R.I.A 8Well Strip)孔中，然后在37℃静置1小时。静置后，用150μl清洗液(PBS(-)，0.05％Tween 20)清洗孔3次，然后加入200μl封闭液，4℃静置4小时。封闭液用通常使用的浓度为2.4mg/ml的BSA(20mM Tris-HCl(pH 7.0))和溶解在同样缓冲液的DnaK 419-607，空白用20mM Tris-HCl(pH 7.0)。弃去封闭液后，加入50μl稀释成0、2.5、5ng/ml的hCEA溶液(Immunofluora东洋纺织制)，37℃保温1小时，然后用150μl清洗液清洗4次。然后加入稀释到最佳浓度的过氧化物酶标记的抗hCEA抗体(Immunofluora东洋纺织制)，37℃反应1小时后，进一步用150μl清洗液(PBS(-)，0.05％Tween 20)清洗孔3次，然后加入100μl底物溶液(四甲基联苯胺(TMBZ，3，3’5，5’-Tetramethylbenzidine))，37℃遮光，显色20分钟。最后，添加100μl反应停止液(1N H2SO4)，在450nm/650nm波长测定黄色的显色。
结果表明，空白测定没有直线性关系，与此相对，DnaK 419-607则和BSA一样有良好的直线性关系，DnaK 419-607在免疫学测定中也可以充分应用(图12)。
实施例7 无组氨酸标记(天然)的DnaK片段的封闭效果比较实施例2～4构建的DnaK片段的每一个，在其N末端都有来自表达载体pQE30的组氨酸标记，因此DnaK片段的等电点偏向中性pH。为此，构建了组氨酸标记被去除的DnaK片段，以维持固有的静电相互作用带来的封闭能力。
除去组氨酸标记的DnaK克隆，以实施例5制备的pQE-DnaK419-607为模板，采用QuickChange法切除起始密码子后到包含组氨酸标记的DnaK区域为止的氨基酸，由此进行制作。实验采用Quickchangesite directive mutagenesis kit(Stratagene公司制)，在组氨酸标记上游导入BamHI位点。操作按说明书进行。此时所使用的引物序列在序列编号16、17中表示。如实施例2所表明的，克隆的基因的上游侧设置了BamHI位点。因此，将用BamHI所得到的载体消化，并再结合，由此可以得到除去了组氨酸标记序列的克隆。
这个表达载体命名为pQE-DnaK419-607N。天然的pQE-DnaK419-607片段，是通过培养用此pQE-DnaK419-607N转化大肠杆菌JM109得到的转化体而取得的。
即，将大肠杆菌JM109(pQE-DnaK419-607N)接种在含100mg/L氨苄青霉素的营养肉汤(1.2％聚蛋白胨、2.4％酵母膏、0.5％甘油、17mM磷酸二氢钾、72mM磷酸氢二钾)中，在32℃振荡培养20小时。通过离心分离收集相对当1L培养液的菌体，悬浮在200ml 100mM pH9.0的Tris-盐酸缓冲液中，用French压力机破碎。在破碎液中加入聚乙撑亚胺使其终浓度为0.1％，然后在60℃保温2小时，通过离心分离加收上清液。然后加入50％饱和度的硫酸铵，通过离心分离收集沉淀物，然后再溶解在100mM pH9.0的Tris-盐酸缓冲液中。进而在64℃加温处理14小时，通过离心分离回收上清液。将此粗酶液供给Superdex200(Amacia Bioscience公司制)凝胶过滤色谱，再加入50％饱和度的硫酸铵，回收沉淀后，再溶解在100mM pH9.0的Tris-盐酸缓冲液中。用经同一缓冲液缓冲过的Sephadex G-25(Amacia Bioscience公司制)凝胶过滤色谱脱盐。然后，将此DnaK片段供给用含有20％饱和度的硫酸铵的浓度为100mM、pH9.0的Tris-盐酸缓冲液缓冲过的Phenyl Sepharose Fast Flow(Amacia Bioscience公司制)柱色谱，用20～0％饱和度的硫酸铵溶液进行梯度洗脱，得到纯化的DnaK片段级分。这一纯化片段级分经超滤膜浓缩后，用蒸馏水脱盐，最后得到纯化的DnaK片段。
BSA和天然DnaK 419-607片段的封闭效率的比较用以下方法测定。
首先将来源于西洋辣根的标记用过氧化物酶(东洋纺织公司制，PEO-131)溶解在含有BSA或天然DnaK 419-607片段的PBS缓冲液中使其浓度为2mg/ml。此时，将市售的BSA(级分V)的浓度调整为2mg/ml或10mg/ml，天然DnaK 419-607片段的浓度调整为0.1或0.5mg/ml。然后用相同溶液制备过氧化物酶溶解液的40～320倍系列稀释液，各取稀释液100μl分配到聚苯乙烯制96孔微型板上。室温放置1小时后，弃去溶液，用含有0.02％Tween 20的PBS缓冲液200μl清洗。反复清洗6次后，充分除去清洗液。再加入100μl四甲基联苯胺(Bio-Rad公司制)，37℃精确保温10分钟后，加入100μl 1N硫酸停止反应并使其显色。在微型板读数器上以主波长450nm、副波长650nm测定显色。
结果如图15～图17所示，可知天然DnaK 419-607片段在BSA浓度的1/20的浓度下显示与BSA同等的非特异显色抑制效果，表现出约为BSA 20倍的封闭能力。
工业实用性根据本发明，可以根据氨基酸序列信息筛选有封闭能力的新型蛋白质或部分序列蛋白质，另外，可以生产能够在大肠杆菌中大量表达的封闭效率提高的蛋白质。利用本发明所得到的蛋白质封闭能力高，能得到比过去所用方法既简便又确切的结果。本发明对于应用免疫学测定的临床诊断或医疗领域有大的贡献。
序列表<110>东洋纺织株式会社(Toyo Boseki Kabushiki Kaisya)<120>封闭效率提高的蛋白质(ブロツキング効率の向上したタンパク質)<130>SCT055668-25<160>16<170>PatentIn version 2.1<210>1<211>638<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>1Met Gly Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Cys Val1 5 10 15Ala Ile Met Asp Gly Thr Thr Pro Arg Val Leu Glu Asn Ala Glu Gly20 25 30Asp Arg Thr Thr Pro Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Gln Asp Gly Glu Thr35 40 45Leu Val Gly Gln Pro Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Gln Asn50 55 60Thr Leu Phe Ala Ile Lys Arg Leu Ile Gly Arg Arg Phe Gln Asp Glu65 70 75 80Glu Val Gln Arg Asp Val Ser Ile Met Pro Phe Lys Ile Ile Ala Ala85 90 95Asp Asn Gly Asp Ala Trp Val Glu Val Lys Gly Gln Lys Met Ala Pro100 105 110Pro Gln Ile Ser Ala Glu Val Leu Lys Lys Met Lys Lys Thr Ala Glu115 120 125
Asp Tyr Leu Gly Glu Pro Val Thr Glu Ala Val Ile Thr Val Pro Ala130 135 140Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Arg Ile145 150 155 160Ala Gly Leu Glu Val Lys Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala165 170 175Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly Thr Gly Asn Arg Thr Ile Ala Val180 185 190Tyr Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Ile Ser Ile Ile Glu Ile Asp195 200 205Glu Val Asp Gly Glu Lys Thr Phe Glu Val Leu Ala Thr Asn Gly Asp210 215 220Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Ser Arg Leu Ile Asn Tyr Leu225 230 235 240Val Glu Glu Phe Lys Lys Asp Gln Gly Ile Asp Leu Arg Asn Asp Pro245 250 255Leu Ala Met Gln Arg Leu Lys Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ile Glu260 265 270Leu Ser Ser Ala Gln Gln Thr Asp Val Asn Leu Pro Tyr Ile Thr Ala275 280 285Asp Ala Thr Gly Pro Lys His Met Asn Ile Lys Val Thr Arg Ala Lys290 295 300Leu Glu Ser Leu Val Glu Asp Leu Val Asn Arg Ser Ile Glu Pro Leu305 310 315 320Lys Val Ala Leu Gln Asp Ala Gly Leu Ser Val Ser Asp Ile Asp Asp325 330 335Val Ile Leu Val Gly Gly Gln Thr Arg Met Pro Met Val Gln Lys Lys340 345 350Val Ala Glu Phe Phe Gly Lys Glu Pro Arg Lys Asp Val Asn Pro Asp
355 360 365Glu Ala Val Ala Ile Gly Ala Ala Val Gln Gly Gly Val Leu Thr Gly370 375 380Asp Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly385 390 395 400Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Met Thr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Thr405 410 415Thr Ile Pro Thr Lys His Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Glu Asp Asn420 425 430Gln Ser Ala Val Thr Ile His Val Leu Gln Gly Glu Arg Lys Arg Ala435 440 445Ala Asp Asn Lys Ser Leu Gly Gln Phe Asn Leu Asp Gly Ile Asn Pro450 455 460Ala Pro Arg Gly Met Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala465 470 475 480Asp Gly Ile Leu His Val Ser Ala Lys Asp Lys Asn Ser Gly Lys Glu485 490 495Gln Lys Ile Thr Ile Lys Ala Ser Ser Gly Leu Asn Glu Asp Glu Ile500 505 510Gln Lys Met Val Arg Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ala Asp Arg Lys515 520 525Phe Glu Glu Leu Val Gln Thr Arg Asn Gln Gly Asp His Leu Leu His530 535 540Ser Thr Arg Lys Gln Val Glu Glu Ala Gly Asp Lys Leu Pro Ala Asp545 550 555 560Asp Lys Thr Ala Ile Glu Ser Ala Leu Thr Ala Leu Glu Thr Ala Leu565 570 575Lys Gly Glu Asp Lys Ala Ala Ile Glu Ala Lys Met Gln Glu Leu Ala580 585 590
Gln Val Ser Gln Lys Leu Met Glu Ile Ala Gln Gln Gln His Ala Gln595 600 605Gln Gln Thr Ala Gly Ala Asp Ala Ser Ala Asn Asn Ala Lys Asp Asp610 615 620Asp Val Val Asp Ala Glu Phe Glu Glu Val Lys Asp Lys Lys625 630 635<210>2<211>1917<212>DNA.
<213>大肠杆菌<400>2atgggtaaaa taattggtat cgacctgggt actaccaact cttgtgtagc gattatggat 60ggcaccactc ctcgcgtgct ggagaacgcc gaaggcgatc gcaccacgcc ttctatcatt 120gcctataccc aggatggtga aactctag ttggtcagccgg ctaaacgtca ggcagtgacg 180aacccgcaaa acactctgtt tgcgattaaa cgcctgattg gtcgccgctt ccaggacgaa 240gaagtacagc gtgatgtttc catcatgccg ttcaaaatta ttgctgctga taacggcgac 300gcatgggtcg aagttaaagg ccagaaaatg gcaccgccgc agatttctgc tgaagtgctg 360aaaaaaatga agaaaaccgc tgaagattac ctgggtgaac cggtaactga agctgttatc 420accgtaccgg catactttaa cgatgctcag cgtcaggcaa ccaaagacgc aggccgtatc 480gctggtctgg aagtaaaacg tatcatcaac gaaccgaccg cagctgcgct ggcttacggt 540ctggacaaag gcactggcaa ccgtactatc gcggtttatg acctgggtgg tggtactttc 600gatatttcta ttatcgaaat cgacgaagtt gacggcgaaa aaaccttcga agttctggca 660accaacggtg atacccacct ggggggtgaa gacttcgaca gccgtctgat caactatctg 720gttgaagaat tcaagaaaga tcagggcatt gacctgcgca acgatccgct ggcaatgcag 780cgcctgaaag aagcggcaga aaaagcgaaa atcgaactgt cttccgctca gcagaccgac 840gttaacctgc catacatcac tgcagacgcg accggtccga aacacatgaa catcaaagtg 900actcgtgcga aactggaaag cctggttgaa gatctggtaa accgttccat tgagccgctg 960aaagttgcac tgcaggacgc tggcctgtcc gtatctgata tcgacgacgt tatcctcgtt 1020
ggtggtcaga ctcgtatgcc aatggttcag aagaaagttg ctgagttctt tggtaaagag 1080ccgcgtaaag acgttaaccc ggacgaagct gtagcaatcg gtgctgctgt tcagggtggt 1140gttctgactg gtgacgtaaa agacgtactg ctgctggacg ttaccccgct gtctctgggt 1200atcgaaacca tgggcggtgt gatgacgacg ctgatcgcga aaaacaccac tatcccgacc 1260aagcacagcc aggtgttctc taccgctgaa gacaaccagt ctgcggtaac catccatgtg 1320ctgcagggtg aacgtaaacg tgcggctgat aacaaatctc tgggtcagtt caacctagat 1380ggtatcaacc cggcaccgcg cggcatgccg cagatcgaag ttaccttcga tatcgatgct 1440gacggtatcc tgcacgtttc cgcgaaagat aaaaacagcg gtaaagagca gaagatcacc 1500atcaaggctt cttctggtct gaacgaagat gaaatccaga aaatggtacg cgacgcagaa 1560gctaacgccg aagctgaccg taagtttgaa gagctggtac agactcgcaa ccagggcgac 1620catctgctgc acagcacccg taagcaggtt gaagaagcag gcgacaaac tgccggctgac 1680gacaaaactg ctatcgagtc tgcgctgact gcactggaaa ctgctctgaa aggtgaagac 1740aaagccgcta tcgaagcgaa aatgcaggaa ctggcacagg tttcccagaa actgatggaa 1800atcgcccagc agcaacatgc ccagcagcag actgccggtg ctgatgcttc tgcaaacaac 1860gcgaaagatg acgatgttgt cgacgctgaa tttgaagaag tcaaagacaa aaaataa1917<210>3<211>55<212>DNA<213>合成DNA<400>3gcggatccat cgagggtaga ggtgacgtaa aagacgtact gctgctggac gttac 55<210>4<211>27<212>DNA<213>合成DNA<400>4ttattttttg tctttgactt cttcaaattc agc 33
<210>5<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>5gccggctgac gactaaactg ctatcgagtc 30<210>6<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>6gactcgatag cagtttagtc gtcagccggc 30<210>7<211>27<212>DNA<213>合成DNA<400>7tgctctgaaa ggttaagaca aagccgctat 27<210>8<211>27<212>DNA<213>合成DNA<400>8atagcggctt tgtcttaacc tttcagagca 27<210>9
<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>9gcagcaacat gcctaacagc agactgccgg 30<210>10<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>10ccggcagtct gctgttaggc atgttgctgc 30<210>11<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>11ccttcgatat cgttgctgtc ggtatcctgc 30<210>12<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>12gcaggatacc gacagcaacg atatcgaagg 30<210>13<211>27
<212>DNA<213>合成DNA<400>13tctggatcca acgaagatga aatccag 27<210>14<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>14gcggatccgc tgaccgtaag tttgaagagc30<210>15<211>29<212>DNA<213>合成DNA<400>15ccggatcccc gaccaagcac agccaggtg 30<210>16<211>29<212>DNA<213>合成DNA<400>16attaactatg agaggatccc atcaccatc 29<210>17<211>29<212>DNA
<213>合成DNA<400>17gatggtgatg ggatcctctc atagttaat 29
权利要求
1.根据氨基酸序列信息筛选有封闭能力的新型封闭用蛋白质或部分序列的候选蛋白质的方法，筛选满足以下条件的蛋白质或部分序列蛋白质A.将蛋白质的氨基酸序列一分为二，根据各自的亲水性氨基酸(D、E、K、H、R、Y)和疏水性氨基酸(G、A、V、L、I、M、F、W、P)的含有率用下式计算出的一分为二的各部分中亲水/疏水率之差的绝对值为0.1以上；(亲水/疏水率)＝(亲水性氨基酸含有率)/(疏水性氨基酸含有率)B.亲水性部分的亲水/疏水率(亲水/疏水率高的一方的值)为0.5以上C.由超过100个氨基酸残基组成。
2.用权利要求1所述的方法筛选到的有封闭能力的新型封闭用蛋白质或部分序列蛋白质，其可以通过下述D的解析工序获得，并满足下述E的条件D.(1)聚苯乙烯制免疫滴定板上的各孔中分别加入满足权利要求1的条件的候选蛋白质(0.5～1mg/ml用20mM Tris-HCl(pH7.0)稀释)以及同样制备的牛血清蛋白(级分V)，在2℃～10℃封闭4～5小时，将液体丢弃的工序；(2)加入用PBS(-)稀释25～100倍的正常人血清，在37℃放置1小时后，用PBS(-)(0.05％Tween 20)清洗板的工序；(3)使用经酶标记的抗人IgG抗体，通过使用显色法的比色法比较非特异吸附在板上的IgG量的工序；E.候选蛋白质的显色是牛血清蛋白显色的2.5倍以下。
3.用权利要求1所述方法筛选到的有封闭能力的新型封闭用蛋白质或部分序列的候选蛋白质，其可以通过下述F的解析工序获得，并满足下述G的条件D.(1)将来自西洋辣根的标记用过氧化物酶溶解到候选蛋白质溶液(0.5～1mg/ml用PBS(-)稀释)以及同样制备的牛血清蛋白(级分V)中，使其浓度为0.05mg/ml的工序；(2)将上述稀释液分配到聚苯乙烯制96孔微型板中的工序；(3)在25℃放置1小时后，除去溶液，用含0.02％Tween 20的PBS(-)清洗的工序；(4)加入四甲基联苯胺溶液，37℃保温后，加入1N硫酸停止反应并使其显色的工序；(5)通过微型板读数器测定显色的工序；G.候选蛋白质的测定值为牛血清蛋白显色的2.5倍以下。
4.用权利要求1所述方法筛选到的有封闭能力的新型封闭用蛋白质或部分序列蛋白质，其可以通过下述H的解析工序获得，并满足下述I的条件H.(1)在聚苯乙烯制免疫滴定板上的各孔中分别加入满足权利要求1的条件的候选蛋白质(0.5～1mg/ml用PBS(-)稀释)以及同样制备的牛血清蛋白(级分V)，在2℃～10℃封闭4～5小时，将液体丢弃的工序；(2)加入配制成浓度为0.05mg/ml的过氧化物酶溶液，37℃放置1小时后，用PBS(-)(0.05％Tween 20)清洗板的工序；(3)25℃放置1小时后，除去溶液，用含0.02％Tween 20的PBS(-)清洗的工序；(4)加入四甲基联苯胺溶液，37℃保温后，加入1N硫酸停止反应并使其显色的工序；(5)通过微型板读数器测定显色的工序；I.候选蛋白质的测定值为牛血清蛋白显色的2.5倍以下。
5.通过满足权利要求1所述条件A、B、C的蛋白质或部分序列蛋白质的氨基酸序列的改变而获得的封闭效率提高的新型蛋白质。
6.权利要求5所述的封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，借助氨基酸置换、减除、插入改变了氨基酸序列。
7.权利要求5所述的封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，来自原核生物或真核生物。
8.封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，来自“HSP70家族蛋白质”。
9.权利要求8所述的封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，来自DnaK蛋白质。
10.权利要求8所述的封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，是除去了DnaK蛋白质的一部分氨基酸序列而得到的蛋白质。
11.权利要求8所述的封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，是除去了DnaK蛋白质的一部分氨基酸序列而得到的蛋白质，并且从N末端至少到第387个，至多到第472个氨基酸序列被除去了。
12.权利要求8所述的封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，是除去了DnaK蛋白质的一部分氨基酸序列而得到的蛋白质，并且从N末端至少到第387个，至多到第418个氨基酸序列被除去了。
13.权利要求8所述的蛋白质，由DnaK蛋白质的第419～607个氨基酸序列组成。
14.权利要求8所述的封闭效率提高的蛋白质，其特征在于，ATPase域或其一部分被除去的DnaK蛋白质的一部分亲水性氨基酸被置换成疏水性氨基酸。
15.权利要求8所述的封闭效率提高的蛋白质，其为ATPase域或其一部分被除去的DnaK蛋白质的一部分氨基酸序列被除去的蛋白质，其中氨基酸序列中第479和第481的天冬氨酸被置换成了缬氨酸。
16.权利要求8所述的封闭效率提高的蛋白质，其由DnaK蛋白质的第384～607氨基酸序列组成，并且氨基酸序列中第479和第481的天冬氨酸被置换成了缬氨酸。
17.具有一个以上亲水域和一个以上疏水域的封闭用蛋白质，其中疏水域可以吸附在器壁上，亲水域可以覆盖吸附在器壁上的疏水域。
18.被改变了的蛋白质，其特征在于，封闭速度比BSA提高。
19.权利要求18所述的被改变了的蛋白质，其特征在于，在3小时封闭中，在调整蛋白质量使得显示与BSA同等的封闭效率的条件下，小于10分钟的封闭能力比BSA优良。
20.权利要求2～19任一项所述的蛋白质，其特征在于，具有标记序列。
21.权利要求20所述的蛋白质，其特征在于，标记序列从组氨酸标记、麦芽糖结合蛋白(MBP)标记、谷胱甘肽S转移酶(GST)标记、Flag标记、Myc标记、串连型亲和纯化标记中选择。
22.权利要求2～19任一项所述的蛋白质，其特征在于，添加了任意的氨基酸序列。
23.蛋白质的生产方法，其特征在于，使用原核生物生产权利要求2～22任一项所述的蛋白质。
24.蛋白质的生产方法，其特征在于，使用大肠杆菌生产权利要求2～22任一项所述的蛋白质。
25.蛋白质的生产方法，其特征在于，使用无细胞蛋白质合成法生产权利要求2～22任一项所述的蛋白质。
26.权利要求2～22任一项所述的蛋白质的提纯方法，其特征在于，经过加热工序。
27.将权利要求2～22任一项所述的蛋白质在封闭、稳定、赋形、折叠辅助、重折叠辅助、包膜、医疗应用中使用的方法。
28.封闭试剂、稳定剂、赋形剂、折叠辅助剂、重折叠辅助剂、包膜剂或医疗用包膜剂，含有权利要求2～22任一项所述的蛋白质。
全文摘要
本发明提供根据氨基酸序列信息简便筛选有封闭能力的新型蛋白质或具有部分新序列的蛋白质的方法，并提供可以在大肠杆菌中大量表达的封闭效率提高的蛋白质。根据氨基酸序列信息筛选有封闭能力的新型蛋白质或部分序列蛋白质的方法；和通过改变氨基酸序列而封闭效率提高的蛋白质，以及该蛋白质的应用方法。
文档编号C07K1/14GK1816562SQ200480019080
公开日2006年8月9日 申请日期2004年7月2日 优先权日2003年7月3日
发明者黑板敏弘, 曾我部敦, 宝田裕, 田中直毅 申请人:东洋纺织株式会社