专利名称：制备型横向电场的体积排阻电色谱分离生物大分子的方法
技术领域：
本发明涉及一种在交变电场作用下利用体积排阻电色谱分离蛋白质等生物大分子的色谱分离方法，属于生物产品加工与分离技术领域。
背景技术：
在生化分析蛋白质和核酸等生物大分子的各类方法中，电泳被认为是一种具有最高分辨能力的分析方法。然而，电泳也是一种放大效果最差的技术。到目前为止，由微克级分析提高到克级制备还无法实现。色谱被认为是一种仅次于电泳分离能力的技术，同时它还是一种放大效果很好的方法。其中，体积排阻色谱由于其温和的操作特性，产品收率可接近100％；分离机理简单，操作参数少；介质相对价廉，且容易规模放大等优点而常用于蛋白质等生物大分子的分离纯化中。因此，人们自然会想到将电泳和液相色谱相结合的复合分离技术，这样的结合既可以保留色谱优越的放大效果又可以引入电泳的精细分离能力。这样的电色谱也被人们寄予很大的希望，被认为是一种很有潜力的制备型分离技术。体积排阻电色谱就是其中最主要的一种形式。
但在制备型电色谱的放大过程中，必须解决由于外电场的引入而带来的一些问题。其中最重要的是要解决焦耳热和电解气问题。大多数蛋白质在40℃左右就会快速变性，电色谱中焦耳热的产生和柱截面积及电压的平方成正比。在电色谱放大时，一方面，提高柱高需要增大柱两端的电压来维持柱内合适的电场强度；另一方面，增大柱直径将导致柱截面积的增大，从而使柱内产生的焦耳热大大增加。当柱内热量的产生超过其散热能力时将会引起柱内温度的升高而导致蛋白质的热损失。同时，产生的电解产物会污染洗脱液及产品。因此，有效移除焦耳热和电解气便成为设计制备型电色谱的一个关键因素。
已有技术中的制备型体积排阻电色谱都属于轴向电场电色谱，即电场应用在色谱柱的轴向，缓冲液同时用做电极液。例如，1997年，Cole和Cabezas在《Journal of ChromatographyA》第760卷中报道了一种在柱塞内修整出一个隔离的电极室来引入外电场，并用截留分子量为6000～8000的渗析膜来隔离流动相和电极室(K.D.Cole and H.-Jr.Cabezas.JChromatogr A，1997，760，259-263)。这种设计使色谱柱的凝胶部分与电极室分离开来，电解产物不会进入凝胶，这是它的一大优点。2000年，Keim和Ladisch在《Biotechnology andBioengineering》第70卷中报道了他们设计的一种新型端塞结构的体积排阻电色谱柱，在端塞内引入电极，并采用径向进、出料的方式来避免缓冲液通过端塞。同时，利用截留分子量为500的超滤膜来隔离色谱柱的凝胶部分和端塞(C.Keim and M.Ladisch.BiotechnolBioeng，2000，70，72-81)。这种结构的设计优点是简化了柱塞处的复杂结构设计，在柱的轴向引入外电场。这类轴向电场电色谱技术的共同缺点是(1)轴向电场电色谱的两个电极间的距离长，应用电压高，导致柱内焦耳热效应严重，冷却负荷大。(2)操作过程中，正负离子的持续定向迁移，会造成电极处异性电荷的升高，这将导致柱内电场强度的降低。(3)操作过程中会有大量的蛋白质吸附在异性电极的隔离膜上，造成产品损失。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用制备型横向电场体积排阻电色谱分离蛋白质混合物的方法，它是将横向电场与体积排阻色谱分离相结合，利用待分离组分的电泳迁移速率、分子扩散系数和分子尺寸等差异进行分离，具有分离不同类型的蛋白质混合物的能力，如分离被凝胶排除的蛋白质大分子的组合和可部分渗入凝胶但分子量接近的蛋白质组合或者提高蛋白质混合物的分离度和上样量。
本发明是通过下述技术方案加以实现的。一种利用制备型横向电场的体积排阻电色谱分离生物大分子的方法，所述的制备型横向电场电色谱分离设备，其中横向电场是指电场方向与液体流动方向垂直，电色谱包括凝胶室和两侧的电极室构成，凝胶室是两侧有对称的槽沟、槽沟内平台上有密封凹槽和中间为长方形中空的有机玻璃体；槽沟内设置具有截留分子量大于1000道尔顿的、可自由通过导电离子的膜板；在凝胶室外两侧各有一个电极室；电极室内壁固定惰性铂电极；电极室与凝胶室中充有包括乙酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液；采用该设备分离生物大分子的方法，其特征在于，包括以下过程配制含有0-100mmol/L氯化钠的1.0-20mmol/L乙酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液为流动相和电极液，流动相使用前经0.45μm超滤膜和超声处理；生物大分子溶于流动相中制备成浓度为0.1-100mg/ml的溶液；凝胶室和两侧的电极室用流动相平衡后，将Sephadex G-75或Spharose FF凝胶按重力填充的方法填充到电色谱柱的凝胶室；流动相流速为10-200cm/h，温度为2-25℃；在凝胶室两侧施加电极电压为1-600伏、电流交变周期为2-200秒的等周期交变电场，电极液流速为20-400cm/h，温度为4-25℃；待系统稳定后，待分离样品以脉冲方式进样，色谱柱流出液经检测器检测。
上述的优化条件配制含有5-50mmol/L氯化钠的2.0-15mmol/L乙酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液为流动相和电极液；生物大分子溶于流动相中制备成浓度为0.5-50mg/ml的溶液；凝胶室和两侧的电极室用流动相平衡后，将SephadexG-75或Spharose FF凝胶按重力填充的方法填充到电色谱柱的凝胶室；流动相流速为20-70cm/h，温度为4-15℃；在凝胶室两侧施加电极电压为5-300伏、电流交变周期为4-120秒的等周期交变电场，电极液流速为40-300cm/h，温度为5-15℃。
下面对本发明进行详细说明本发明的关键技术有八点一是色谱中横向交变电场的引入，采用了一种三腔室的矩形色谱柱，中间装填料的凝胶室和两侧的电极室，凝胶室和电极室之间由平面膜板来隔离，电极室内设置电极，电极和外电源相连，凝胶室内便产生了横向电场。关键技术之二是膜板为具有一定分子截留能力的亲水性膜板，其主要作用是阻止生物大分子进入两侧的电极室而导电离子可自由通过，膜板的厚度和其内部的焦耳热有关，膜板越薄焦耳热越小，但膜板也需要有一定厚度(或需一定厚度的支撑板)来满足流动相的液压和本身机械强度的要求。关键技术之三是等周期交变电场的应用，用等周期来解决生物大分子在隔离膜板处的堆积，同时也解决了轴向电场电色谱中由于电场的持续应用而引起的诸多问题；周期的大小又是影响蛋白质的横向电泳迁移距离和传质速率的重要因素。关键技术之四是缓冲液为常规的色谱缓冲液，缓冲液的离子强度为0.5-100mmol/L；过小的离子强度将导致蛋白质和色谱填料的静电吸附严重，过大的离子强度将导致蛋白质电泳迁移速率的锐减。关键技术之五是为了保证操作过程中色谱柱内缓冲液的电导率和pH的稳定，电极液与缓冲液组成相同。关键技术之六是缓冲液和电极液的温度必须具有一定减缓凝胶室及电极室内焦耳热效应的能力。关键技术之七是缓冲液和电极液流速的选择除应满足分离效率和填料承载能力的要求外，还要满足消除凝胶室及电极室内焦耳热的要求。关键技术之八是电压的选择，电压的大小直接影响蛋白质的横向电泳迁移距离、传质速率和凝胶室及电极室内焦耳热效应。
本发明的横向电场体积排阻电色谱分离方法同现有的轴向电场体积排阻电色谱分离方法相比，其明显的优点是(1)由于采用膜板隔离的三腔室色谱柱结构，电极产生的电解气被完全限制在电极室，并可稳定地被循环的电极液带走，而色谱柱中产生的焦耳热可被轴向压力驱动的、冷却的流动相带走；(2)柱侧向的距离远小于其轴向距离，施加较小的电压就可以在得到较高的柱内电场强度，从而避免使用高压电源，降低了能耗；同时，低电压的使用也会带来柱内低焦耳热效应及柱内电场稳定等优点；(3)三腔室的矩形色谱柱的分割结构使样品上样、洗脱等步骤在电场下可持续进行。因此，该技术在蛋白质等生物大分子的分离纯化过程中具有广阔的应用前景。
图1给出了本发明涉及的电色谱柱整体结构示意2给出了交变电场的应用方位以及荷电溶质的迁移示意图。
图3给出了牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白G(IgG)的分配系数在横向电场电色谱中随电场强度的变化趋势。图中mT为蛋白质的分配系数由下式来计算，mT=Ve-V0Vt-V0]]>式中Ve为样品蛋白质的洗脱体积；Vt为色谱柱的总体积；V0为色谱柱的空隙体积。缓冲液是3.9mmol/L三羟甲基氨基甲烷-47mmol/L甘氨酸(pH8.2)，流速为20cm/h。
图4给出了肌红蛋白(Myo)和溶菌酶(Lys)的分配系数在横向电场电色谱中随电场强度的变化趋势。缓冲液为4.0mmol/L乙酸盐缓冲液(pH4.9)流速为60cm/h。
图5给出了牛血清白蛋白(BSA)和肌红蛋白(Myo)的分配系数在横向电场电色谱中随电场强度的变化趋势。缓冲液为4.0mmol/L乙酸盐缓冲液(pH4.9)流速为60cm/h。
图6给出了本发明工作流程示意图。
具体实施例方式
下面的实例将对本发明予以进一步的说明。
下面结合附图，详细介绍本方法中电场的应用和样品组分的分离原理。
图2中给出了交变电场的应用方位和荷电溶质的迁移情况。所图所示，由于电力线与压力流线相垂直，在压力流的垂直方向上，存在随电场周期变化的电泳对流传递，故溶质将以Z型轨迹在柱内移向柱出口。这也是横向电场体积排阻电色谱与轴向电场体积排阻电色谱的主要差别。
图3-5给出了三对蛋白质的分配系数在横向电场电色谱中随缓冲液pH和电场强度的变化情况，以便根据蛋白质分配系数的变化情况选择合适的分离条件。所选择的几对蛋白质具有广泛的代表性(1)完全被凝胶排除的蛋白质组合(BSA/IgG)；(2)可部分渗入凝胶但分子量接近的蛋白质组合(Myo/Lys)；(3)完全被凝胶排除和可部分渗入凝胶的蛋白质组合(BSA/Myo)。由图可知，同一缓冲液中，电场强度对不同蛋白质分配系数的影响不同；同一蛋白质在不同缓冲液中，其分配系数受电场强度的影响也不同。例如，在pH8.2时，BSA的分配系数随电场强度的增大而急剧增大，但IgG增大则比较缓慢(图3)；在pH4.9时，Lys的分配系数随电场强度增大的程度远大于Myo的(图4)。在图5中，由于缓冲液的pH(pH4.9)与BSA的等电点相同，其分配系数几乎不受电场强度的影响；而缓冲液的pH远离Myo的等电点，其分配系数随电场强度的增大而急剧增大。图3-5的结果很好地解释了缓冲液pH和蛋白质等电点的差异对横向电场体积排阻电色谱中蛋白质保留行为的影响。因此，可以根据蛋白质保留行为的差异来选择合适的实验条件，如缓冲液pH、电场强度等来提高不同蛋白质间保留行为的差异，从而提高分离能力。这一结论适合不同类型的蛋白质混合物，如被凝胶排除的蛋白质大分子的组合(IgG、BSA，图3)；可部分渗入凝胶但分子量接近的蛋白质组合(Myo、Lys，图4)；被凝胶排除的蛋白质大分子和凝胶渗透的小分子蛋白质的组合(BSA、Myo图5)。由此可见，横向电场体积排阻电色谱可分离完全被凝胶排除的蛋白质组合和尺寸相近的蛋白质组合，从而使其对生物大分子的分离能力显著提高。
实施例1分离牛血清白蛋白和免疫球蛋白G混合物电色谱凝胶室的尺寸为(长×宽×深)20.0×0.5×1.2cm，电极室的尺寸为20.1×0.8×0.8cm。流动相缓冲液为含有5.0mmol/L氯化钠的3.9mmol/L Tris-47mmol/L Gly缓冲液(pH8.2)。总浓度为1.0mg/mL的蛋白质混合物是由等体积、浓度均为1.0mg/ml的牛血清白蛋白和免疫球蛋白样品液混合而成。所有的缓冲液均经0.45μm的微孔膜过滤和15min超声脱气处理。凝胶室和两侧的电极室用缓冲液平衡10分钟后，将Sephadex G-75凝胶按重力填充的方法填充到电色谱柱的凝胶室。然后，用流动相缓冲液平衡凝胶室中介质，直到UV吸收值(280nm)达到基线并稳定在基线附近。缓冲液流速为0.2ml/min。在凝胶室两侧施加电极电压为90伏、电流交变周期为40秒的等周期交变电场，电极液流速为1.6mL/min。待系统稳定后，用脉冲方式进样，样品体积为0.2ml。实验过程中，电极液由冷却器冷却在6℃，流动相则由冰水混合物冷却。实验结果牛血清白蛋白和免疫球蛋白G得到了基线分离；而不加电场条件下，这两种组分出峰时间重叠。
实施例2分离肌红蛋白和溶菌酶混合物电色谱凝胶室的尺寸为(长×宽×深)20.0×0.5×1.2cm，电极室的尺寸为20.1×0.8×0.8cm。流动相缓冲液为8.0mmol/L乙酸盐缓冲液(pH4.9)。总浓度为1.0mg/mL的蛋白质混合物由混合相同体积的上述单蛋白质样品溶液来配制。所有的缓冲液均经0.45μm的微孔膜过滤和15min超声脱气处理。凝胶室和两侧的电极室用缓冲液平衡10分钟后，将Sephadex G-75凝胶按重力填充的方法填充到电色谱柱的凝胶室。然后，用流动相缓冲液平衡凝胶室中介质，直到UV吸收值(280nm)达到基线并稳定在基线附近。缓冲液流速为0.2ml/min。在凝胶室两侧施加电极电压为70伏、电流交变周期为40秒的等周期交变电场，电极液流速为1.6mL/min。待系统稳定后，用脉冲方式进样，样品体积为0.2ml。实验过程中，电极液由冷却器冷却在6℃，流动相则由冰水混合物冷却。实验结果肌红蛋白和溶菌酶得到了基线分离；而不加电场条件下，这两种组分出峰时间接近而仅出现一个色谱峰。
实施例3分离牛血清白蛋白和肌红蛋白混合物电色谱凝胶室的尺寸为(长×宽×深)20.0×0.5×1.2cm，电极室的尺寸为20.1×0.8×0.8cm。流动相缓冲液为8.0mmol/L乙酸盐缓冲液(pH4.9)。总浓度为1.0mg/mL的蛋白质混合物由混合相同体积的上述单蛋白质样品溶液来配制。所有的缓冲液均经0.45μm的微孔膜过滤和15min超声脱气处理。凝胶室和两侧的电极室用缓冲液平衡10分钟后，将Sephadex G-75凝胶按重力填充的方法填充到电色谱柱的凝胶室。然后，用流动相缓冲液平衡凝胶室中介质，直到UV吸收值(280nm)达到基线并稳定在基线附近。缓冲液流速为0.2ml/min。在凝胶室两侧施加电极电压为90伏、电流交变周期为40秒的等周期交变电场，电极液流速为1.6mL/min。待系统稳定后，用脉冲方式进样，样品体积为1.0ml。实验过程中，电极液由冷却器冷却在6℃，流动相则由冰水混合物冷却。实验结果牛血清白蛋白和肌红蛋白得到了基线分离；而不加电场条件下，这两种组分出峰时间接近而仅出现一个色谱峰。
实施例4分离牛血清白蛋白、肌红蛋白和溶菌酶混合物电色谱凝胶室的尺寸为(长×宽×深)20.0×0.5×1.2cm，电极室的尺寸为20.1×0.8×0.8cm。流动相缓冲液为8.0mmol/L乙酸盐缓冲液(pH4.9)。总浓度为1.0mg/mL的蛋白质混合物由混合相同体积的上述单蛋白质样品溶液来配制。所有的缓冲液均经0.45μm的微孔膜过滤和15min超声脱气处理。凝胶室和两侧的电极室用缓冲液平衡10分钟后，将Sephadex G-75凝胶按重力填充的方法填充到电色谱柱的凝胶室。然后，用流动相缓冲液平衡凝胶室中介质，直到UV吸收值(280nm)达到基线并稳定在基线附近。缓冲液流速为0.2ml/min。在凝胶室两侧施加电极电压为90伏、电流交变周期为40秒的等周期交变电场，电极液流速为1.6mL/min。待系统稳定后，用脉冲方式进样，样品体积为0.2ml。实验过程中，电极液由冷却器冷却在6℃，流动相则由冰水混合物冷却。实验结果牛血清白蛋白、肌红蛋白和溶菌酶得到了基线分离；而不加电场条件下，这三种组分不能分离，其中肌红蛋白和溶菌酶由于出峰时间接近而仅出现一个色谱峰。
权利要求
1.一种利用制备型横向电场的体积排阻电色谱分离生物大分子的方法，所采用的制备型横向电场电色谱分离设备，所述的横向电场是指电场方向与液体流动方向垂直，电色谱包括凝胶室和两侧的电极室构成，凝胶室是两侧有对称的槽沟、槽沟内平台上有密封凹槽和中间为长方形中空的有机玻璃体；槽沟内设置具有截留分子量大于1000道尔顿的、可自由通过导电离子的膜板；在凝胶室外两侧各有一个电极室；电极室内壁固定惰性铂电极；电极室与凝胶室中充有包括乙酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液；采用该设备分离生物大分子的方法，其特征在于，包括以下过程配制含有0-100mmol/L氯化钠的1.0-20mmol/L乙酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液为流动相和电极液，流动相使用前经0.45μm超滤膜和超声处理；生物大分子溶于流动相中制备成浓度为0.1-100mg/ml的溶液；凝胶室和两侧的电极室用流动相平衡后，将Sephadex G-75或Spharose FF凝胶按重力填充的方法填充到电色谱柱的凝胶室；流动相流速为10-200cm/h，温度为2-25℃；在凝胶室两侧施加电极电压为1-600伏、电流交变周期为2-200秒的等周期交变电场，电极液流速为20-400cm/h，温度为4-25℃；待系统稳定后，待分离的样品以脉冲方式进样，色谱柱流出液经检测器检测。
2.按照权利要求1所述的分离方法，其特征在于流动相和电极液为含有5-50mmol/L氯化钠的浓度为2.0-15mmol/L缓冲液；生物大分子溶于流动相中制备成浓度为0.5-50mg/ml的溶液；流动相流速为20-70cm/h，温度为4-15℃；在凝胶室两侧施加电极电压为5-300伏、电流交变周期为4-120秒的等周期交变电场，电极液流速为40-300cm/h，温度为5-15℃。
全文摘要
本发明公开了一种在交变电场作用下利用体积排阻电色谱分离蛋白质等生物大分子的色谱分离方法。所述的制备型电色谱分离设备包括凝胶室和两侧的电极室构成，采用该设备分离生物大分子的方法，其特征在于配制乙酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或三羟甲基氨基甲烷－盐酸缓冲液为流动相；流动相平衡后的凝胶室中用重力填充方法填充凝胶；流动相流速为10－200cm/h，温度为2－25℃；在凝胶室两侧施加电极电压为1－600伏、电流交变周期为2－200秒的等周期交变电场，电极液流速为20－400cm/h，温度为4－25℃；样品以用脉冲方式进样。本发明的方法具有分离能力强、处理量大和适用范围广等优点，在蛋白质、核酸等生物大分子的分离与纯化中具有广阔的应用前景。
文档编号C07K1/00GK1736537SQ20051001469
公开日2006年2月22日 申请日期2005年8月2日 优先权日2005年8月2日
发明者孙彦, 谭国民, 史清洪, 董晓燕, 白姝 申请人:天津大学