专利名称：制备淀粉状蛋白β肽的共价交联的寡聚体的方法
制备淀粉状蛋白(3肽的共价交联的寡聚体的方法发明领域本发明涉及用于制备淀粉状蛋白p的稳定化交联寡聚体的组合物 和方法，所述稳定化交联寡聚体用作生成抗体的免疫原，所述抗体用 于治疗阿尔茨海默氏病和与异常淀粉状蛋白卩聚集有关的其它状况。发明背景从人淀粉状蛋白前体蛋白(APP)衍生出的肽，即淀粉状蛋白-(3 (A卩) 肽，在水溶液中自结合，以形成寡聚形式的复合物和异质混合物(Klein, W丄.,等，Trends Neurosci. 24: 219-224 (2001》。已经从合成的Ap42 肽生产了 一类这样的寡聚体，称作淀粉状蛋白-衍生的可扩散配体 (ADDLs)(Chromy， B.A.,等，Biochemistry 42: 12749-12760 (2003)。据 报道，这些可溶的寡聚体与统称为阿尔茨海默氏病(AD)的神经毒性事 件和症状有关，推测是通过尚未鉴别出的受体-介导的途径(Klein, W丄.， Ne腦chem. Int. 41: 345-352 (2002)。在公开的文献中，已经以许多方式表征了 ADDLs,但是最常见的 是通过在凝胶电泳中的迁移模式和通过原子力显微镜(AFM)。在 SDS-PAGE凝胶上，观察到与单体、二聚体、三聚体和偶尔来自Ap42 肽的合成制剂的更高质量的寡聚体相对应的特征种类。在阿尔茨海默 氏病模型中在动物的脑提取物中，已经观察到类似的结果。AFM清楚 地区分球状的、可溶的寡聚体和伸长的原纤维的和初原纤维的形式。已经普遍地认识到，A卩肽制剂是动态的，即它们连续地经历结 合和解离事件，最终产生高级的聚集体。AD患者死后脑中淀粉状蛋 白斑形态学的流行病学关联，已经产生了该疾病与淀粉状蛋白原纤维 的沉积有关的理论。但是，最近的研究已经提示，在没有斑沉积的情 况下，相关的神经毒性和认知损伤事件由可溶寡聚体或ADDLs介导 (Kirkitadze， M.D.,等，J. Ne訓sci. Res.: 69: 567-577 (2002))。脑中的主要肽种类A^o和A(342表现出显著不同的聚集倾向，其中A^40主要以单体状态存在。由于转基因动物模型中Ap42水平的升高与增加的 AD-样表现相关联，所以认为A(342的自结合是神经毒性的原因事件。
合成肽的体外研究已经证实了 Ap42与A(34()相比倾向于聚集的性质 (Jarrett, J.T.,等，Ann. NY Acad. Sci.: 695: 144-148 (1993》。由于单体 A卩种类存在于正常组织中，所以它们被-见作免疫系统通常不识别的 自身抗原。在有升高的人|342浓度存在下的自结合导致寡聚体形成，且 虽然现在还不知道这些寡聚体的结构形式，但存在2个或更多个单体 肽的相互作用可生成不再被免疫系统识别为自身的新构象表位(新表 位(neoepitope))的可能性。同样，在AD治疗的主动或被动免疫方 案中，特异性地指向这样的构象表位的抗体应答可能是保护性的。合成的淀粉状蛋白肽的确定制剂含有有毒的寡聚体(Klein, W丄.， 等，Neurobiol. Aging: 25: 569-580 (2004))的观察使得可得到生产免疫 原的方法，以达到定向抗体应答。但是，如果"照现在的样子(asis)" 使用，产生的制剂可能在达到所需的抗体应答方面是次优的(1)这 样的制剂的不稳定性使它难以定义和靶向所需大小的寡聚体群体，因 为系统是在流动状态；(2)相当大水平的单体的存在，可能具有有害作 用，因为该种类被视作"自身的"，且大的量可能阻止寡聚体上新构 象表位的识别；和(3)高水平的单体可能诱导针对单体和寡聚体共有的 表位的应答。在后一种情况下，在生成的大多数抗体都识别分子的相 同区域的意义上，抗体应答可能针对优势免疫表位。对于Ap肽而言 确实如此，因为已经报道了识别该分子的氨基末端(残基l-15)的几种 单克隆抗体。尽管这可能不一定是有害的，但如果它们仅仅识别有毒 的寡聚体组分、且不识别单体自身抗原，则会提高这样被动施用的抗 体制剂的安全性水平。实际上，Pfeifer等报道，识别A卩的残基2-6 的单克隆IgG抗体的被动施用导致扩散淀粉状蛋白负担的显著减 小，但是也导致脑淀粉状蛋白血管病-相关的出血的2-倍增加(Pfeifer， M.，等，Science 298: 1379 (2002))。共价稳定化的寡聚形式的方7去，以用作生成治疗AD的抗体的免疫原。发明内容本发明的一个实施方案描述了生产A(3-衍生肽的共价偶联的寡聚 形式的方法。该肽包括全长A(3,其包含氨基酸残基1 -40 (A(34G) (SEQ ID NO. l)或氨基酸残基1-42 (Ap42) (SEQ ID NO. 2)，及其取代的或截短 的形式(SEQIDNO. 3-7)。肽来源可以是合成的、天然的或通过重组技 术生产的。这样的方法提供了稳定化的且具有100kDa- 200 kDa质量范围的优势寡聚种类的寡聚形式。在本发明的另一个实施方案中，该方法提供了组合物，其包含具 有八(342的可溶、寡聚体种类的构象表位的免疫原。在本发明的另一个实施方案中，提供了纯化Ap-衍生肽的共价偶 联的寡聚形式、从而可以生成确定分子量(Mw)群体的方法。该实施方 案包含使用层析分离步骤，其中基于质量分离群体，该技术称作大小 排阻层析(SEC)。发明详述交联是用于稳定化寡聚结构和增强肽制剂的免疫原性的确定技 术。 一种普通方案使用化学交联剂，例如戊二醛(Le Vine, H.， Neurobiol. Aging, 16: 755-764 (1995))。该方案已经用于测定寡聚蛋白的亚基结 构，但是当应用于肽时，它具有几个缺点。戊二醛不是零长度的交联 剂，且同样地，它在交联种类的结构内引入额外的接头原子，这可能 扰乱天然结构。对于Ap42寡聚体，这可能导致邻近寡聚体之间而不 是在给定寡聚体内的交联(Bitan, G.，等，J. Biol. Chem. 276: 35176-35184 (2001))。戊二醛也有助于许多不希望的副反应，例如在某些条 件下的本体聚合和赖氨酸修饰。同前。最近的报道描述了未修饰的蛋 白的光诱导的交联(PICUP)在A卩寡聚化研究中的用途(Bitan, G.，等 J. Biol. Chem. 276: 35176-35184 (2001); Bitan, G.，等.Proc. Natl.. Acad. Sci. USA 100: 330-335 (2003); Bitan, G.,等，J. Biol. Chem. 278: 34882-34889 (2003);和Bitan, G.和Teplow， D. B., Acc. Chem. Res. 37: 357-364 (2004))。美国专利号6,613,582所示的PICUP方法，使用共 价连接结构上非常接近的氨基酸残基(主要是芳族、His或Met)的光诱 导的自由基机理。尽管它4吏用相对较短的反应时间，^旦该方法对光输 入和强度的参数非常敏感。此外，体积和浓度变化可能对最终产物组 合物具有显著作用，例如改变低级寡聚体和存在的单体种类的比例。 迄今为止的报道已经表明，产生的种类通常是低级的，即二聚体至八 聚体(octomer)。 同前。
本文所述的发明包含生产Ap-衍生肽的共价偶联的寡聚形式的方 法，其中使用通过大小排阻层析特定分离的接近零长度的双功能交联 剂1,5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)。根据实施例1所述方案制备的寡 聚种类，具有100kDa-200kDa的平均分子量，且具有最4氐单体污染， 也就是说，未掺入的单体的百分比小于5%。通过亲核芳族取代，DFDNB通过它的2个氟取代基与伯胺反应， 以产生芳基胺衍生物。接近零长度的试剂的选择，对于交联自结合肽 种类是重要的，几个原因如下(1)它可以确保仅已经非常接近的残 基(即，在天然结构中接近的那些残基)反应，(2)这样的试剂使外 来间隔原子向结构中的引入最小化，所述引入可能具有去稳定或改变 构象的作用，和(3)试剂的小的、疏水性质，可以允许更好地渗透进肽 寡聚体的疏水内部。在本发明中，为A(3交联选择DFDNB,因为连 才姿的原子之间的^争^巨(spanning distance)小于5A，且交if关的刚'性明 显高于其它胺-活性试剂(Green， N.S.，等，Protein Sci. 10: 1293-1304 (2001))。尽管已知其它零或接近零的交联剂，例如l-乙基-3-(3-二曱 氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4-苯基-1,2，4三唑啉-3,5-二酮(PTD)，且 其可以用于交联肽例如A(3，但申请人发现，两种试剂都不能像DFDNB 一样提供具有要求保护的方法的最佳大小和最少污染的寡聚种类。在控制程度和按比例放大用前者可得到的方法的能力方面，化学 交联提供胜过光诱导的交联的其它优点。尽管是组成型反应性的，但 通过改变浓度、反应时间和温度，可以修改用双功能试剂得到的反应 程度。对于光交联，主要参数是光强度和持续时间，它们更难以以可 再现的方式控制和调节。此外，光交联固有的自由基机理可能对肽结 构具有不希望的作用，尤其在生成更高质量种类需要的更长的反应时 间时(Bitan, G" J. Biol. Chem. 276: 35176-35184 (2001))。同样，本领 域技术人员不一定会尝试使用DFDNB来交联本文的淀粉状蛋白-衍生 肽。本发明的A(3-衍生肽包括从全长AP衍生出的任意肽，其包括具 有39 - 43个氨基酸长度的AP形式。AP的全长序列记载在Kang等， Nature 325: 773-776 (1987)。本发明的A卩-衍生肽包括、但不限于， 包含残基1-42(八卩42)或残基l-40(A卩4Q)的肽，以及与野生型序列相比 包含一个或多个突变的肽，其保守取代或改变或截短形式。该序列可
以含有天然或非天然存在的氨基酸，且可以包括末端修饰，例如(l)为体内稳定化目的引入的乙酰化或酰胺化，(2)化学缀合反应基的引 入，包括但不限于，半胱氨酰化、马来酰亚胺化和溴乙酰化，和(3)间 隔键的引入，包括但不限于，氨基己酸、聚乙二醇衍生物和多酸性或 多碱性氨基酸重复。Ap-衍生肽可以是合成的、天然衍生的、或通过 本领域普通技术人员已知的重组技术生产的。下面是在要求保护的方 法中可以采用的Ap-衍生的肽序列的实例。人Ap40 (-40): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGS NKGAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO. 1)人Ap42(l-42): DAEFRHDSGYEVHHQKLWFAEDVGS NKGAIK3LMVGGW1A (SEQ ED NO. 2)人N-半胱氨酰化的卩42(1"42): Ac-C-Aha-DAEFRHDSGYEVH HQKLVFFAEDVGSNKGADGLMVGGWIA (SEQ ID NO. 3)人.N-马来酰亚胺化的截短的 A卩(9-42):马来跣亚胺.-Aha-GYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO. 4)人C-马来酰亚胺化的截短的A卩(942): GYEVHHQK LVFFAEDVGSNKGAHGLMVGGVVIA-Aha-Lys-马来跣亚胺(SEQ ID NO. 5)人N-马来酰亚胺化的修饰的A卩(8-l(反转的);942):马来酰亚胺-Aha-SD卿EADG YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO. 6)人C-马来酰亚胺化的修饰的 A卩(8-l(反转的)；942): SDHRFEAD GYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAEGLMVGGWIA-Aha-Lys-马来酰亚胺(SEQ ID NO. 7)在所有前述序列中，Aha代表"6-氨基己酸"，Ac代表"N-末端 乙酰化的"，N代表"N-末端"，且C代表"C-末端"。进行本文要求保护的本发明方法，从而使得得到的交联的Ap-衍 生肽之间的化学键在性质上是共价的，且在正常生理条件下是不可逆 的。术语"共价偶联的"和"共价稳定化的"指这样的种类，其已经 进行请求保护的本发明交联方法，且在正常生理条件下不会复原到单 体形式。这样的键的断裂通常需要苛刻的条件，例如高温酸或碱水 解，例如，6 N HCl， 100°C, 20小时)。这与已知A(3肽采用的非共 价的、自结合的种类形成对照。本发明的使用DFDNB作为双功能交联剂来生产共价稳定化的寡 聚体的方法，优于现有技术的方法，因为本发明的方法将允许生产含
有比以前报道更宽的质量范围的寡聚种类，并将允许从得到的寡聚制 剂去除单体种类的方法。在大小排阻层析分级分离后，从本文方法生产的主要形式具有100 kDa-200 kDa的分子量(如通过变性凝胶电泳 测得的)，且具有小于5%的单体污染(如通过凝胶光密度分析法所证 实的)。在本发明的另一个实施方案中，通过用零或接近零长度的双功能 交联剂交联Ap-衍生肽来生产共价稳定化的寡聚体的方法，包含生产 具有寡聚Af3种类的寡聚体-偏好表位的免疫原的方法。不希望受任何抗体，'所述抗体主要针对;i神纟l毒性^;的Ap形式。、 八 在另一个实施方案中，本发明包含纯化交联的种类的方法，从而 可以产生确定分子量(Mw)的群体。交联反应的控制，在一定程度上可 限制得到的种类的质量分布，但是不可能在维持中间质量种类的控制 的同时，驱动反应向消耗所有单体进行。在实现所有单体向寡聚体的 转化所需的延长的反应时间中，超过200 kDa的交联材料的百分比显 著升高。使用大小分级分离，可以在产生中间质量寡聚体的最佳时间 时，终止交联，并纯化出剩余的污染单体。该方法由基于质量分离群 体的层析分离步骤，即称作大小排阻层析(SEC)的技术组成。该方法 的主要优点是，与非共价结合种类相比，对于共价交联寡聚体可以采 用更严格的分离条件。应当认识到，通过淀粉状蛋白肽的固有性质， 交联的种类可以自身发生一定程度的自结合。但是，可以在解离条件 下分离这些种类，所述解离条件包括、但不限于，使用化学变性剂， 使用生物去污剂，使用升高的温度，和使用溶剂，单独地或组合地。 预期这样的处理破坏非共价相互作用，但是不破坏共价交联。应当认 识到，其它层析分离技术包括、但不限于，离子交换、反相和疏水相 互作用，可以用于类似的目的。在本发明的优选的实施方案中，SEC 方法包含，使用乙腈和含水緩沖液的1: l混合物，和约45。C-48。C的 温度。要求保护的方法的共价稳定化的寡聚体，可以用于制备肽抗原制 剂，如用于制备独特的和新的抗体的免疫原。预见到自结合肽寡聚体 的共价交联，将以确定结构稳定化那些种类，从而呈递在单体肽中未 发现的推定新表位。当这些交联的寡聚体用作小鼠或其它哺乳动物物 种的免疫原时，通过标准方法，可以从超免疫血清生产出单克隆抗体(mAb)，并筛选寡聚体-反应特异性。这些mAb会形成淀粉样变性病 的被动治疗性处理方案的基础，所述方案特异性地靶向A(3肽的可溶 寡聚体。更具体地，这些免疫原生产的mAb可以用作AD的治疗方案 的部分。对于被动免疫接种制剂，可以过滤灭菌纯化的交联的寡聚 体，与选择的适当免疫刺激佐剂一起配制，所述佐剂例如，羟基磷酸 铝 (aluminum hydroxyphosphate ) 或基于急香的佐剂，例^口 ISCOMATRIX , CSL Ltd., Parkville,澳大利亚。本领域技术人员会知 道如何制备这样的疫苗制剂。如果在动物试验中成功，那么可以在 cGMP指南下进行本发明的方法，以制备用于人临床试验的材料。本文要求保护的本发明提供了改进的生产AP-衍生肽的共价稳 定化的寡聚形式的方法，所述寡聚形式可以被分离，即不含有单体， 并用于动物免疫接种。尽管已经证实已知的未修饰的蛋白的光诱导交 联(PICUP)的方法提供ADDL的有效交联(Bitan, G. J., Biol. Chem. 276: 35176-35184 (2001))，但迄今为止的报道已经表明，产生的种类 通常是低级的，即二聚体至约八聚体。此外，凝胶分析已经表明，相 当大比例的单体仍然存在于这些制剂中。鉴于免疫学动物研究通常需 要的材料量是相当大的，以前描述的PICUP的按比例放大问题限制该 方案的效用。此外，PICUP的批次之间的再现性，受到前述该方法对参数的灵敏度的限制，所述参数例如输入光照强度和非常短的反应时间。对于本发明，使用DFDNB的化学交联在向生产大量材料调节工 艺的能力方面具有确定的优点，这归因于提高的批次之间的 一 致性、 更低水平的单体污染、和更低严格性的制备条件，例如必要的反应时间。通过使用DFDNB的交联，稳定化产生的寡聚种类，从而它们不 能在标准的生理条件下复原到单体。本领域普通技术人员知道，操纵 化学交联反应的反应条件，可以产生不同范围的Mw形式。例如，通 过延长反应时间、提高交联剂相对于底物的摩尔浓度、或升高反应温 度，可以促成更高质量的种类。请求保护的发明的重要方面是，通过 SEC分离这些种类和产生不含有单体的寡聚库的能力。这是重要的考 虑因素，因为如前所述，延长交联反应来将单体完全转化成寡聚体， 会导致高比例的材料在所需的质量范围之外，这实际上会降低所需种
类的得率。确定地观察到，当单独用作免疫原时，短多肽序列通常是抗原性差的(Perelson, A.S.详口 Wiegel, F.W.， Fed. Proc. 40: 1479-1483 (1981); Dintzis, R.Z.，等，J. Immunol.. 143: 1239-1244 (1989))。通过交联单体 种类或通过缀合，即将肽共价偶联到更大的生物分子(它在大多数情 况下是载体蛋白)上，可以显著提高这样的肽诱导高效价免疫应答的 能力。因而，预见到本发明的交联的淀粉状蛋白-衍生肽提供具有这样 的提高的免疫原性的免疫原。文献报道表明，天然的淀粉状蛋白肽仅仅是弱免疫原性的，因为 观察到需要多次施用大量抗原，以克服对自身抗原的耐受性屏障和诱 导应答(Lambert, M.P.,等，J. Neurochem. 79: 595-605 (2001): Kayed， R.， 等，Science 300: 486-489 (2003))。此外，甚至在物种例如小鼠和人之 间，当施用给小鼠时，A卩序列之间的相似性也阻止对人肽的高效价 IgG-优势应答。当诱导低IgG效价时，在具有正确亲和力的潜在抗体 库被显著限制的范围内，对于鉴别治疗性单克隆抗体，这些低抗体应 答是不希望的。此外，由于所需的应答是指向寡聚种类的应答，所以 呈递不含有单体的稳定化的寡聚体的策略，会提供达到所需的应答的;需"组分。如果活性狀的初始配制包括寡f！体-制备步骤「;么可以为肽-载体缀合物预见到类似的策略。在本发明中，这通过根据ADDL-制备方案制备肽来实现。本领域技术人员会认识到用淀粉状蛋白肽或ADDLs的天然制剂 免疫的某些缺点，包括、但不限于，(1)由于难以克服自身耐受性， 发生差的免疫应答，(2)对自身抗原产生免疫应答的有害作用的可 能，和(3)在这样的制剂中缺少寡聚体稳定性。尽管(1)和(2)可能看起 来是相互排斥的，但它们原则上是相关的。如上面所讨论的，与免疫 增强载体蛋白的交联和/或缀合，可以用于增强对淀粉状蛋白肽的应 答。但是，如果应答主要是指向可溶单体和有毒寡聚体共有的优势免 疫表位，则不能获得寡聚体-特异性，且实际上，可以实现自身免疫作 用，因为正常形式的肽现在不能被免疫系统识别。不希望受任何理论 的约束，因为寡聚体ADDL种类是与AD有关的急性神经毒性种类， 所以对这些形式特异性的抗体应当能克服上述缺点，并提供更安全的
诱导免疫应答和/或施用的方式。本发明提供了稳定化和分离作为更高 特异性的免疫原呈递的这些寡聚种类的方式。实施例实施例1: AP-衍生肽的制备从American Peptide Company (Sunnyvale, CA)得到肽序列(SEQ ID NO: l和2)，或内部合成肽序列(SEQIDNO: 3-7)。对于内部合成的 A(3衍生肽，使用生产商(PE Biosystems, Foster City, CA)供给的Fmoc 化学方案，通过在Applied Biosystems自动化肽合成仪上的固相合成， 制备肽。装配后，去保护树脂结合的肽，并使用94.5%三氟乙酸、2.5% 1，2-乙二硫醇、1%三异丙基硅烷和2.5%H20的混合物，从树脂切割。 处理2小时后，过滤反应物，浓缩，并用乙醚研磨得到的油。过滤固 体产物，溶于50%乙酸/1120，并冷冻干燥。使用0.1。/。TFA/H20/乙腈 梯度，在C-18支持体上，通过RPHPLC纯化半纯产物。通过分析型 HPLC,评价级分。合并纯级分(>98%)，并冷冻干燥。通过氨基酸分 析和质谦分析，证实同一性。实施例2: A卩42肽的化学交联本实施例描述了 A(342 (SEQIDNO. 2)的化学交联。从-70。C保藏取 出肽，并使其平衡至室温。称量22mg肽粉末，放入聚丙烯管，并用 2.2 mL 1，1，1,3,3,3六氟-2-丙醇(HFIP)溶解。在37°C水浴中温育肽〉容液 l小时，然后亚等分试样(sub-dliquoted)成2mg(200iil)保留物。使 用干冰/乙醇浴，冷冻肽保留物，并置于SpeedVac浓缩器(Thermo-Electron Corporation, West Palm Beach, FL)中，以乂人肽蒸发溶剂。干燥 肽在-7(TC保藏。融化4份2mgA卩42保留物(共8mg)。向每份保留物中，加入1.25 mL25mM硼酸钠，pH8.5緩冲液，并将管置于涡旋混合器上，在低 速摇动10-15分钟。合并溶解的肽，并加入另外5.4 mL硼酸盐緩沖 液，以使总体积达到10.4 mL (0.77 mg肽/mL)。通过反转混合溶液， 加入1.0 ml 20 mM 1,5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDBN)(溶于50%乙醇 /50%水中)，并再次通过反转混合溶液。交联反应在室温进行10.5 -12.5分钟。通过加入300 50mM二好u苏4唐醇，猝灭反应。 或者，使用该反应来制备交联种类的寡聚ADDL制剂。将HFIP-干燥的肽仏卩42) (8 mg)溶于354.4 DMSO中，在间歇涡旋下，将该 溶液逐渐加入10.04 mL 25 mM硼酸钠緩沖液，pH 8.5。在4 。C温育 肽溶液24小时，以形成ADDL,然后如上所述进行交联。实施例3:交联的A卩42肽的大小排阻层析(SEC)分离 本实施例描述了不同分子量的A(342的交联寡聚体的层析分离。在 偶耳关到996光二极管阵列4全测器(Waters Corp., Milford MA)的 Alliance 2690分离模块(Waters Corp.，MilfordMA)上，进行层析。大小 排阻柱是配有轴向位于SEC柱前面的TSK PWH保护柱(21.5 mm x 7.5 cm)的TSK凝胶G3000 PW (21.5 mm x 60 cm)(Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA)。 使用缠绕柱的 Thermolyne柔性电力口热带 (Bamstead International, Dubuque IO),将SEC柱力口热至45-48°C,并 通过Thermolyne 45500型丰lT入4空制器(Barnstead International, Dubuque K))进行控制。使用具有柔性温度传感器的数字温度计(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)，监控温度。在猝灭反应后，立即对交联肽进行层析。 使用手工注射器，通过空的12mL样品环，将交联肽装载到柱上。流 动相由乙腈和25 mMtricine、 150mMNaCl、 pH8.5緩沖液的1: 1混 合物组成，且以1.5 mL/分钟的速率，泵入流动相。通过方法开发的 过程发现，升高的温度和水性有机流动相的使用，对于从最终库中 有效去除单体肽是关键的。在215和280 nm监控吸光度。使用 Frac-100级分收集器(Amersham Bioscience, Piscataway, NJ),在1级 分/分钟的速率，在13x 100mm玻璃管中收集级分。将DMSO (15 |iL) 加入每个级分，并涡旋级分。将级分置于SpeedVac浓缩器(Themo-Electron Corporation, West Palm Beach, FL)中2-3分钟，以去除乙腈， 然后在4。C保藏。使用10-20% tricine凝胶，对SEC级分进行变性/ 非还原SDS-PAGE。使用Silver Xpress染色试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)，对凝胶染色。通过凝胶合并含有质量范围100 kDa - 200 kDa的寡聚体和非常小量单体的级分。使用N2气流，去除剩余的乙 腈。使用商业4匕的Bradford或二辛可宁酸(BCA)测定试剂盒(Pierce Biotechnology, Rockford, IL),测定蛋白浓度。
实施例4:用于动物免疫接种和免疫原性研究的交联产物制剂 本实施例描述了用于动物免疫接种和免疫原性研究的产物制 剂。将化学交联的AP42肽的高分子量寡聚体的SEC库配制进25 mM tricine, 150mMNaCl， pH8.5緩冲液中，至200pg/mL的终蛋白浓度。 另外，如上所述配制SEC库，然后在轻微涡旋下加入氢氧化铝，至 450|iig/mL的最终铝浓度。为每次免疫接种，新鲜制备制剂，并在注 射前保藏在2-8°C。开始研究，以评价化学交联的A(342肽在小鼠中的免疫原性，以及开发AP42肽-特异性的单克隆抗体。用20mcg在铝或弗氏佐剂中配制 的交联Ap"抗原肌内免疫雌性Bable/c小鼠，每组10只。免疫接种 包含共5次注射，间隔4周。在注射后2周，收集血样，并测定对 A(342抗原的抗体效价。对于单克隆抗体生产，从免疫的动物分离脾 细胞，且通过标准操作，将它们与SP2/0骨髓瘤细胞融合。通过酶联 免疫吸附测定(ELISA),筛选得到的杂交瘤的特异性单克隆抗体的生 产。实施例5: A卩肽与OMPC的化学缀合本实施例描述了从人A(3( 1 -42)衍生的肽与纯化的B型脑膜炎萘瑟 氏球菌(7Ve/^en'a mem77g/"cfe)的外膜蛋白复合物(OMPC)的化学缀 合。偶联的化学性质是马来酰亚胺-衍生肽和膜复合物的硫醇-衍生蛋 白之间的反应。如所述地合成上述修饰的淀粉状蛋白肽(SEQ ID NO: 6和7)，并用于缀合。这些肽含有氨基酸残基1-8的反转，随后是天 然的9-42淀粉状蛋白前体蛋白序列，其目的是指导免疫应答远离免 疫优势的1-10氨基酸残基区域。对于N-末端肽，使马来酰亚胺官能 团直接附着到Aha间隔基的伯胺上，而对于C-末端附着，将它置于末 端赖氨酸残基的s-胺上。按照标准的无菌技术，在层流环境中进行含 有OMPC的溶液的所有操作。A. OMPC的碌,醇化从Merck Manufacturing Division得到纯化的、无菌的OMPC ，并 使用试剂N-乙酰基高半胱氨酸硫内酯(NAHT， Aldrich, St. Louis, MO)，在它的表面-可接近的赖氨酸残基部分上^5克醇化。通过在4°C、 在289，000xg离心60分钟，沉淀117mg溶于水中的OMPC,并抛弃 上清液。将N2-鼓泡的激活緩沖液(0.11 M硼酸钠，pHll)加入离心管， 并用玻璃搅拌棒取出沉淀。将悬浮液转移至玻璃Dounce勻浆器，并 通过击打30次重新悬浮。洗涤离心管，并通过击打30次匀浆洗涤物。 在干净的容器中合并重新悬浮的沉淀和洗涤物，以产生10 mg/mL的 OMPC浓度。将固体DTT和EDTA溶于N2-鼓泡的激活緩冲液，并以 0.106 mg DTT/mg OMPC和0.57 mg EDTA/mg OMPC的比率，装入反 应容器中。轻柔混合后，将NAHT溶于N2-鼓泡的水中，并以0.89mg NAHT/mgOMPC的比率，装入反应物中。反应在环境温度避光进行3 小时。结束后，如上所述沉淀OMPC,通过Dounce匀浆化，以6 mg/mL 重新悬浮于N2-鼓泡的缀合緩冲液(25 mM硼酸钠，pH 8.5， 0.15 M NaCl)，以洗涤沉淀。对于最后的重新悬浮，如上所述沉淀OMPC, 通过Dounce匀浆化，以10mg/mL重新悬浮于Nr鼓泡的缀合緩冲液。 在4。C,在l，OOOxg进行最后的低速离心5分钟，以去除任何聚集的 产物。取出等分试样，通过Ellman测定进行游离碌iJ孚的测定，并将 大批产物在冰上、在黑暗中保藏备用。测得的硫醇含量是0.2 -0.3|umol/mL。B.肽与OMPC的缀合假定肽的功能性马来酰亚胺含量的摩尔比是1: 1。称量足够的 肽，以产生等摩尔量的马来酰亚胺和总硫醇。对于每次缀合，靶向的 总OMPC蛋白是约15 mg。以20 mg/mL，将肽重新悬浮于DMSO, 并在25 mM硼酸钠、pH 8.5、 0.15 M NaCl中稀释至5 mg/mL。在轻 柔涡旋下，将肽溶液緩慢加入硫醇化的OMPC溶液。使反应物避光， 并在没有混合下，在环境温度温育14小时。用2-倍摩尔过量的N-乙基马来酰亚胺，在环境温度猝灭剩余的游离OMPC硫醇基团3小 时。通过平行的缀合方案，进行仅>琉醇化的OMPC对照。完成猝灭后， 将缀合物和对照转移至100,000 Da分子量截止透析单元，并对20mM 硼酸钠、pH8.5緩冲液完全透析，更换至少5次緩冲液。完成透析后， 将样品转移至15 ml聚丙烯离心管，并在4 。C、在l,000 xg离心5 分钟，以去除任何聚集的材料。取出等分试样进行分析，并将大批保 藏在4 °C 。
C.分析通过改进的Lowry测定，测定总蛋白，并通过定量氨基酸分析 (AAA),分析缀合物和对照样品。通过酸水解新生的肽-OMPC键后释 放出的独特残基S-二羧基乙基高半胱氨酸(SDCEHC)的定量，测定肽 与OMPC的摩尔比。从肽序列缺少的、且因而OMPC蛋白独有的水 解稳定的残基，测定OMPC-比浓度。为每mol SDCEHC假定1 mol 肽，SDCEHC/OMPC的比因而等同于肽/OMPC含量。使用肽分子量 和40,000,000 Da的平均OMPC质量，^v该比率可以计算出肽的质量 装载。使用4-20% Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen, Carlsbad, CA),通过 SDS-PAGE分析，定性地证实缀合的共《介性质，其中与对照相比，观 察到考马斯染色的缀合物带的迁移率的上移。实施例6:检测交联的A(3寡聚体的测定本实施例描述了检测通过本文要求保护的方法生产的交联的Ap 寡聚体的测定。下述的测定记载在Ming Tain Lai等同时提交的申请 U.S.S.N 60/695,527中，且在本文中引入，如同全文阐述一样。A. ELISA平板的制备通过向96孔平板的每个孔中加入在包被緩沖液(50 mM碳酸氬 钠，pH9.6)中的100 |il 5 [ig/ml 6E10抗体(Signet Labs, Dedham， MA) (原液=1 mg/ml),包被Coming-Costar ELISA平板。用薄粘性膜覆盖 得到的平板，以防止蒸发和样品体积的损失，然后在4。C緩慢摇动过 夜。次日，用PBS-T(0.1%Tween-20，在常^L PBS中)洗涤平板2次。 然后，用200 jil含有PBS的SuperBlock封闭孔至少1小时。B. 测定方案将A(3交联的寡聚体标准、A(342单体对照和待评样品(100 [xL)加入 预先包被的平板，然后向所有样品中加入50 pi 6E10-AP (在0.3% Tween中1: 500稀释-在SuperBlock中)。在摇动下，在4。C温育得到 的平板过夜，且次日用200ul PBS-T洗涤5次。将碱性磷酸盐底物(100 IiL)导入平板上的每个孔中，以开始反应。在室温(RT)温育30分钟 后，在具有发光检测能力的标准多模态(multimode)读数器(以前的 Analyst, LJL BioSystems, Inc, Sunnyvale, CA;现在的Molecular Devices Corporation, Analyst GT多模态读数器，Sunnyvale, CA)上读样品。基于 标准曲线数据与适当才莫型的拟合(在Microsoft Excel中的线性或二次 拟合，或在JMP (SAS Institute, Cary，NC)中的3次样条拟合)，计算每 个样品的交联A(3寡聚体浓度。超过背景或单体对照水平的统计上有 意义的值，被视作交联A(3寡聚体相关的信号。尽管使用ELISA检测形式解释了本测定，但本领域技术人员会认 识到，可以使用上面Ming Tain Lai等所述的ECL或ALPHA筛选形 式，进行该测定。
权利要求
1. 生产共价稳定化的抗原的方法，其包含a.制备溶解的Aβ-衍生肽的溶液；b.将所述溶液和接近零长度的双功能交联剂组合，以形成混合物；c.温育所述混合物，其温度和时间段足以实现交联；和d.提供要用作抗原的步骤(c)的交联产物。
2. 权利要求1的方法，其中所述双功能交联剂是1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)。
3. 权利要求2的方法，其中所述交联产物具有100kDaJ00kDa的质量范围。
4. 权利要求2的方法，其中所述交联产物具有小于5%的单体污染。
5. 权利要求2的方法，其中所述交联产物另外与要用作免疫原 的佐剂一起配制。
6. 权利要求5的方法，其中所述佐剂是基于皂苷的佐剂。
7. 权利要求5的方法，其中所述制剂用作药物组合物。
8. 生产具有A卩的构象表位的共价稳定化的抗原的方法，其包含a. 制备溶解的A(3-衍生肽的溶液；b. 将所述溶液和双功能交联剂组合，以形成混合物；c. 温育所述混合物，其温度和时间段足以实现交联；和d. 提供要用作抗原的步骤(c)的交联产物。
9. 权利要求8的方法，其中所述双功能交联剂是1，5-二氟-2,4-二硝基苯(DFDNB)。
10. 权利要求9的方法，其中所述交联产物具有100kDa-200 kDa的质量范围。
11. 权利要求9的方法，其中所述交联产物具有小于5%的单体污染。
12. 权利要求9的方法，其中所述交联产物另外与要用作免疫原 的佐剂一起配制。
13. 权利要求12的方法，其中所述佐剂是基于皂苷的佐剂。
14. 权利要求12的方法，其中所述制剂用作药物组合物。
15. 生产纯化的共价稳定化的抗原的方法，其包含a. 制备溶解的A(3-衍生肽的溶液；b. 将所述溶液和双功能交联剂组合，以形成混合物；c. 温育所述混合物，其温度和时间段足以实现交联；d. 使用基于所述交联产物的质量的层析分离，纯化许多来自步骤 (c)的交联产物；和e. 提供要用作抗原的步骤(d)的纯化产物。
16. 权利要求15的方法，其中所述双功能交联剂是1，5-二氟-2,4-二硝基苯(DFDNB)。
17. 权利要求15的方法，其中步骤(d)的层析分离还包含乙腈和 含水緩冲液的1: 1混合物，且柱温度为45°C-48°C。
18. 权利要求15的方法，其中所述交联产物具有100 kDa-200 kDa 的质量范围。
19. 权利要求15的方法，其中所述交联产物具有小于5%的单体污染。
20. 权利要求15的方法，其中所述交联产物另外与要用作免疫 原的佐剂一起配制。
21. 权利要求20的方法，其中所述佐剂是基于皂苷的佐剂。
22. 权利要求20的方法，其中所述制剂用作药物组合物。
全文摘要
本发明涉及使用接近零长度的双功能交联剂，制备淀粉状蛋白β的稳定化交联寡聚体的方法，所述交联寡聚体用作生成抗体的免疫原，所述抗体用于治疗阿尔茨海默氏病和与异常淀粉状蛋白β聚集有关的其它状况。优选的双功能交联剂是1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)。
文档编号C07K14/47GK101213207SQ200680023511
公开日2008年7月2日 申请日期2006年6月26日 优先权日2005年6月30日
发明者D·纳夫罗茨基, J·G·乔伊斯, K·M·格林, 梁小平 申请人:默克公司