专利名称：C2H7的Fab片段与CD20抗原表位多肽的复合物的制作方法
技术领域：
本发明属于抗体药物技术领域，具体地说，是关于一种抗人B细胞表面的CD20分子 的单克隆抗体C2H7的Fab片段与CD20抗原表位多肽的复合物，获得所述复合物的方法， 以及所述复合物的三维晶体结构及其应用。
背景技术：
人CD20是一类表达于B细胞表面的标记分子(Stashenko， P., L. M. Nadler, etal. (1980). J. Immunol. 125(4): 1678-85)。它是一个四次跨膜的蛋白，被预测有一个大的胞外环区(从 142位赖氨酸到182位的酪氨酸)，并且可以在B细胞表面寡聚化(Bubien, J. K., L.丄Zhou, et al. (1993). J. Cell Biol. 121(5): 1121-32; Teeling, J. L， W. J. Mackus, et al. (2006). J. Immunol. 177(1): 362-71.)。尽管CD20的确切功能并不是很清楚，但是很多实验证据显示 CD20的功能很可能是形成或者调节电压门控性钙离子通道(Bubien, J. K., L. J. Zhou, et al. (1993). J. Cell Biol. 121(5): 1121-32)。由于CD20分子具有以下一些性质CD20分子在80% 以上的B细胞淋巴瘤中有表达，但是在干细胞，原B细胞以及一般的浆细胞和其它组织 中没有表达，而且被抗体交联以后并不引起细胞的内吞作用(Anderson, K.C.,M. P. Bates, et al. (1984). Blood 63(6): 1424-33; Press, 0, W,, J. Howell-Clark, et al. (1994). Blood 83(5): 1390-7),使其成为一个非常好的B细胞淋巴瘤的药物靶标分子。
2H7是在一株鼠源的抗人CD20的IgG2b(k)单克隆抗体，而C2H7则是将2H7的可 变区与人IgGl (k)的恒定区嵌合所得到的嵌合抗体,具有潜在的应用于淋巴瘤以及自身免 疫性疾病的治疗的药用价值(Liu, A. Y" Robinson, R. R" et al. (1987). J Immunol 139: 3521-6)。通过嵌合可以降低抗体在人免疫系统内的排斥反应，并且是抗体在人免疫系统 获得介导补体依赖的细胞毒作用和抗体依赖的细胞毒作用。2H7它的抗原表位至今没有明 确的报道，现有的一些实验数据显示它的抗原表位大致定位于人B细胞表面抗原CD20的 胞外区的从163位天冬酰胺到187位谷氨酰胺的区域(Polyak, M.丄and J. P. Deans (2002). Blood 99(9): 3256-62; Teeling, J. L., W. J. Mackus, et al. (2006). J Immunol 177(1): 362-71 )。 尽管己经有多种抗CD20类抗体药物包括Rituximab (嵌合的2B8抗体)，Zevalin (放射性 90Y标记2B8抗体)，Bexxar (放射性1311标记和未标记的Bl抗体)成功上市(Garber, K.(2003). J Natl Cancer Inst 95(3): 189)，但是因为B细胞表面的CD20表达在不同的患者之 间有着显著的差异，对于B细胞表面CD20低表达量的患者来说，现有药物并不能完全达 到预期的治疗效果，因而基于己有抗体获得高亲和性和高特异性的抗体对于CD20表达水 平低的患者的治疗有着重要的意义(Keating, M. and S. O'Brien (2000). Semin Oncol 27(6 Suppl 12): 86-90; McLaughlin, R， F. B. Hagemeister, et al. (2000). Semin Oncol 27(6 Suppl 12): 37-41)。
此外，这几种以及其它的一些鼠源的针对CD20的抗体，例如1F5和AT80，被认为 识别CD20上相似的区域(从165位酪氨酸到182位酪氨酸)(Polyak, M. J. and J. P. Deans (2002). Blood 99(9): 3256-62; Teeling, J. L., W. J. Mackus, et al, (2006), J Immunol 177(1): 362-71)。然而这些抗体在功能上还是有差异。比如大部分的抗体结合会使CD20积聚到去 垢剂不溶的脂筏中，但是B1却没有这样的作用。这个性质可能与其介导补体依赖性的细 胞杀伤作用相关，但与其引起细胞凋亡的能力无关(Deans,丄P., S. M. Robbins, et al. (1998). J Biol Chem 273(1): 344-8; Chan, H. T., D. Hughes, et al. (2003). Cancer Res 63(17): 5480-9; Cragg， M. S., S. M. Morgan, et al. (2003). Blood 101(3): 1045-52)。
为了解CD20抗体的功能多样性以及其潜在的机制，鉴定2H7以及其它识别CD20的 单克隆抗体的抗原表位在近几年引起广泛的兴趣，人源化的2H7抗体Ocrelizumab (罗氏 公司)被称誉为下一代的抗CD20类药物。人和鼠的CD20分子的序列对比显示尽管两者 有73%的序列一致性，但是在胞外环区的43个氨基酸中只有16个相同(Polyak, M. J. and J. P. Deans (2002). Blood 99(9): 3256-62)。突变实验显示出人CD20上的170位的丙氨酸和 172位的脯氨酸是决定CD20上2H7所识别的抗原表位的关键(Polyak, M. J. and J. P. Deans (2002). Blood 99(9): 3256-62)。肽段相互作用实验显示CD20上从165位酪氨酸到182位 酪氨酸是潜在的2H7抗体结合的表位(Teeling, J. L., W. J. Maekus, et al. (2006). J Immunol 177(1): 362-71)。
因此，构建C2H7的Fab片段与CD20抗原表位多肽的复合物可以给开发C2H7的药 用价值提供理论依据，对于在已有C2H7抗体的基础上进行进一步的改造以获取更高亲和 力的抗体药物，并且对于CD20胞外区的抗原空间表位信息的揭示和依据此空间表位的药 物设计有着重要的提示意义。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种单克隆抗体C2H7的Fab片段与CD20抗原表位多 肽的复合物。本发明的另一个目的在于，提供一种C2H7的Fab片段与CD20抗原表位多肽的复合 物的制备方法。
本发明的又一个目的在于，提供一种C2H7的Fab片段与CD20抗原表位多肽形成的 复合物的三维晶体结构。
本发明的还有一个目的在于，提供一种C2H7的Fab片段与CD20抗原表位多肽形成 的复合物的三维晶体结构的用途。
为实现上述目的，发明人设计并合成了 CD20从163位天冬酰胺到187位谷氨酰胺的 肽段，并且，在肽链中、对应于人CD20胞外区的167位和183位的这2个半胱氨酸之间 人工合成引入了一个链内的二硫键，以模拟CD20自然的状态。
随后，发明人将纯化的C2H7的Fab和抗原表位肽混合并进行共结晶，获得C2H7的 Fab和抗原表位肽的复合物。
发明人还测定了所述C2H7的Fab片段与抗原表位肽的共结晶复合物的三维晶体结 构，并对所述的复合物的结构进行了分析。
所述的复合物的结构的分析结果显示了 C2H7和抗原表位肽相互作用的关键残基。同 时，分析结果还很好的解释了以往文献(Polyak, M. J. and J. P. Deans (2002). Blood 99(9): 3256-62)中提及的生化数据，即人CD20上的170位的丙氨酸和172位的脯氨酸是决定 CD20上C2H7所识别的抗原表位的关键；并且，为设计和改造C2H7及其它由2H7衍生 的抗体以得到具有更高亲和力和更高特异性的抗体提供了理论基础。根据本发明，在所述 的复合物中，CD20抗原表位肽段呈现独特的环状结构，可用于筛选针对该表位的新的抗 体。
图1显示了电泳检测C2H7Fab的纯度和均一性的结果。 图2显示了抗原表位肽的分析型反相色谱层析结果。 图3显示了抗原表位肽的质谱分析结果。
图4是C2H7 Fab片段与抗原表位肽的复合物的结构的立体图。 图5是C2H7 Fab片段与抗原表位肽的相互作用的细节立体图。
具体实施例方式
以下结合附图，以具体实施例对本发明作进一步详细说明，应理解，以下实施例仅用 于说明本发明而非用于限定本发明的范围。以下实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件，如《分子克隆
实验室手册》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)等中所述的条件进行。
本发明中使用的木瓜蛋白酶购自Sigma-Aldrich公司，本发明中使用的层析柱SP-S印harose FF和Phenyl-Sepharose HP均购自GE Healthcare 。
实施例1、抗体的制备
参考Liu， A. Y., Robinson, R. R.等发表于〈Uournal oflmmunology》第139期3521 — 3526页的方法制备抗体，将得到的抗体以木瓜蛋白酶酶切C2H7，酶切条件为10mg/ml的C2H7中加入木瓜蛋白酶(Sigma-Aldrich)至终浓度为O.lmg/ml;然后于37。C,酶切18小时，缓冲液为0.1MTris-HCl+2mMEDTA + l mM 二硫苏糖醇，pH 8.0。将酶切产物先通过层析柱SP-S印harose FF进行阳离子交换层析，再通过层析柱Phenyl-Sepharose HP进行疏水相互作用层析，获得C2H7的Fab片段。
采用SDS-PAGE对Fab片段的纯度和均一性进行验证，结果如图1所示，根据图1的结果，纯化得到的C2H7的Fab片段，其纯度大于95%，并且均一性良好。
将纯化的Fab片段浓缩至7mg/ml，同时将缓冲液置换为100 mM的NaCl+10 mMTris-HCl， pH8.0。
实施例2、 CD20抗原表位肽的制备 .
对应于人CD20胞外区163位到187位残基的肽段，设计并合成了一段含有25个氨基酸的抗原表位肽片段，该片段序列如下NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ 。
同时，在该片段中对应于人CD20胞外区的167位和183位残基的2个半胱氨酸(已在序列中用下划线标识)之间引入了一个链内二硫键，从而模拟出CD20的自然状态。
参考操作手册所述方法，通过分析型反相色谱层析(图2)和质谱分析(图3)，确定所制备的氨基酸片段的纯度大于95%。
实施例3-5、抗体与抗原表位肽的共结晶
分别按照l: 1、 1: 5禾fU: 10的摩尔比，将纯化好的C2H7 Fab和CD20抗原表位肽，在4'C混合12小时，获得蛋白-肽的混合溶液。采用悬滴扩散法，将混合所获得的蛋白-肽的混合溶液与结晶池液(0.2 M磷酸氢二 铵，20%聚乙二醇3350)各1微升混合形成悬滴后，置于含有500微升结晶池液的结晶 槽中进行晶体生长。
在4'C下生长两月左右，即收获方形的共结晶复合物晶体。
将晶体冷冻保存在加入18%聚乙二醇500的结晶池液中，然后迅速降温至-170。C。 在BL6A射线源(日本光子工厂)上，进行共结晶复合物的衍射实验，并收集共结晶
复合物的2.6埃分辨率的衍射数据，并用软件HKL2000 (光子工厂提供)处理收集的数据，
结果如表1所示。
由表1的结果可知，C2H7 Fab和在CD20上被它识别的表位肽的复合物晶体衍射数 据，有较高的质量和完整度，这套数据可以很好的反映出复合物的结构。从结构的修正统 计来看，整体结构模型的误差低于一般公认的可接受的结构模型误差标准(R因子低于等 于25%， Free R因子低于等于30X)，可以有效地反映出C2H7 Fab与其在CD20上的表 位肽的复合物的真实结构。
7表l、衍射数据和结构修正统计表
衍射数据统计表
衍射光源波长(A)1.0000
空间群
晶胞参数
a, 6轴(A)96.5
c轴(A)107.6
衍射分辨率(A)a20.0-2.60 (2.69-2.60)
观察到的衍射点178,866
实际独立的衍射点(信噪比>0)15,644
平均冗余度11.4(10.9)
平均信噪比21.7(4.5)
完整度(°/p)97.6 (98.7)
R瞎ge值(％) &10.0(48.8)
结构修正模型的数据统计
衍射点数量(F。>(te(F。))
修正组14,828
, 检测组781
R因子(e/p) C23.4
FreeR因子(％)30.1
氨基酸残基数456
水分子的数目117
所有原子的平均B因子(A2)46.1
键长的均方差(A)0.012
键角的均方差co1.22
Ramachandr肌点分布(％)
最可几区84.7
可几区13.0
基本上可几区2.0
不可几区0.3
其中，a括号中的数据代表最高衍射层的统计数据。
cr因子-Mf。I-IkII/If。1。
8实施例6、共结晶复合物的结构测定，优化和分析
C2H7 Fab与其在CD20上的表位肽的共结晶复合物的结构在软件MOLREP (http:〃www.ccp4.ac.uk/html/molrep.htmi)中用分子置换的方法进行解析以本单位所解
单克隆抗体Rituximab的Fab片段的结构(Du, J., Wang, H., et al. (2007) . J Biol Chem 282 (20 ) : 15073-15080 )作为分子置换的模型；结构的修正在REFMAC5 (http:〃www.ccp4.ac.uk/html/refmac5.html)中用标准的流程进行。Free R值用5X随机选
择的数据来计算。
在软件O (http:〃www.imsb.au.dk/~mok/o/o—man/manual.html)中经过模型构建之后， 电子密度图中可以清晰地发现对应于肽的电子密度。结构的立体化学分析采用了软件 Procheck (http:〃www.biochem.ucl.ac.uk/ roman/procheck/procheck.html)， 该结丰勾{彦正的统 计结果见表1。 CD20表位肽与C2H7的Fab片段的复合物的结构被修正到R值23.4%和 free R值到30.1%。
Fab的肘角用Stanfield等人表述的方法来计算(StanfieW, R. L., A. Zemla， et al.(2006).丄 Mol Biol 357(5): 1566 — 74),结果为141度。
复合物的整体结构利用用软件Pymol (http://pymol.sourceforge.net/)制作，结果见图 4。如图4所示，晶体结构的一个不对称单元中包含一个抗原抗体复合物分子。其中，抗 体的结构是经典的由四个卩桶形结构域所组成的规范的免疫球蛋白折叠轻链折叠为VL 和CL结构域，重链折叠为VH和CHl结构域，每个结构域中包含一个链内二硫键稳定其 结构，重链和轻链的碳末端通过一个链间二硫键连接起来。抗体的六个互补决定区中，轻 链L1和L2没有参与与抗原的相互作用，轻链L3和重链H1、 H2、 H3四个互补决定区形 成一个口袋与抗原发生相互作用。如图4和图5显示，复合物的结构中的肽段形成一个特 殊的环状构象。肽段的N端的环尽管没有二级结构但是其结构却由于与Fab的相互作用而 得到稳定，中间的ANPS区和环通过丰富的氢键与肽上其它部分相互作用形成稳定的结 构。C末端是一小段疏水的螺旋区，预测其为CD20跨膜区的延伸的解旋状态。
Fab与抗原表位肽之间有441平方埃的面积被包埋在相互作用的界面内，并且具有一 定的形状互补值(0.69)，略高于一般的抗原抗体之间0.64—0.68的形状互补值(Lawrence, M. C. and P. M. Colman (1993). J Mol Biol 234(4): 946-50)。
C2H7的Fab的互补决定区L3， HI, H2和H3参与了与肽段的相互作用，并且形成
一个深的口袋将肽段中的几个关键氨基酸，ANP'^包埋在口袋的内部。它们之间有一些
极性相互作用见图5，肽上168位的谷氨酸通过其主链的羰基与Fab上轻链93位天冬酰胺的侧链氨基形成氢键；肽上170位的丙氨酸通过其主链羰基与Fab上重链59位的丝氨 酸侧链羟基形成氢键；肽上175位的赖氨酸与Fab上重链57位的天冬氨酸形成潜在的盐 碱相互作用。除去氢键以外肽段和Fab之间还有丰富的范德华力接触，尤其是在关键的 ，ANPS173与Fab之间有45个范德华力接触，而整体的肽段与Fab之间一共有57个范德 华力接触。
根据以上对复合物的结构的分析，可将所获得的信息用于基于所述复合物的结构的药 物的虚拟改造；还可用于筛选针对CD20抗原表位肽段呈现独特的环状结构的新的抗体。
权利要求
1、一种抗体与抗原的复合物，其特征在于，所述抗体为C2H7的Fab片段，所述抗原为CD20抗原表位多肽。
2、 如权利要求l所述的复合物，其特征在于，所述复合物为共结晶复合物。
3、 如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述的CD20抗原表位肽的氨基酸序 列为NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ 。
4、 如权利要求3所述的复合物，其特征在于，所述的CD20抗原表位肽的2个半胱 氨酸之间有一个链内二硫键。
5、 如权利要求1一4中任一项所述复合物的制备方法，其特征在于，所述复合物通过 共结晶方法获得。
6、 如权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤A、 C2H7的Fab和CD20抗原表位肽混合；B、 共结晶。
7、 如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的CD20抗原表位肽的氨基酸 序列为NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ 。
8、 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的CD20抗原表位肽的2个半胱氨 酸之间有一个链内二硫键。
9、 如权利要求6所述的方法，其特征在于，C2H7的Fab和CD20抗原表位肽混合的 摩尔比为h 1 h 10。
10、 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的摩尔比为l: 5。
11、 如权利要求6所述的方法，其特征在于，共结晶步骤中，含有蛋白-肽的混合悬 滴与结晶池液的体积比为1: 1。
12、 如权利要求1_4中任一项所述复合物的三维晶体结构。
13、 如权利要求12所述的复合物三维晶体结构的应用，其特征在于，用于基于所述 复合物的结构的药物的虚拟改造。
14、 如权利要求12所述的复合物三维晶体结构的应用，其特征在于，用于筛选针对 CD20抗原表位肽段的抗体。
全文摘要
本发明提供了一种抗人B细胞表面CD20分子的单克隆抗体C2H7的Fab片段与CD20抗原表位多肽的复合物，获得所述复合物的方法，以及所述复合物的三维晶体结构及其应用。本发明提供的复合物的三维晶体结构的分析结果不仅揭示了C2H7和抗原表位肽相互作用的关键残基，并且，为设计和改造C2H7以及其它由2H7衍生的抗体以得到更高亲和力和更高特异性的抗体提供了理论基础，可用于基于所述复合物的结构的药物的虚拟改造。另外，本发明提供复合物中，CD20抗原表位肽段呈现独特的环状结构，可用于筛选针对该表位的新的抗体。
文档编号C07K16/28GK101492507SQ20081003285
公开日2009年7月29日 申请日期2008年1月22日 优先权日2008年1月22日
发明者丁建平, 杜嘉木, 琛 钟 申请人:中国科学院上海生命科学研究院