专利名称：：抗幽门螺旋杆菌的新免疫球蛋白的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于预防、治疗和诊断由幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)引起的感染的材料和方法。更具体地说，本发明涉及新的特异性抗体可变区，其衍生物和完全人免疫球蛋白Abba3，其显示对幽门螺旋杆菌表达的BabA抗原具有特异性活性，生产所述免疫球蛋白的方法，它们的分离和用途，例如检测由幽门螺旋杆菌引起的疾病。本发明还涉及治疗和预防幽门螺旋杆菌菌株引起的病理性感染的免疫疗法，即被动疫苗接种。
背景技术：
：幽门螺旋杆菌是革兰氏阴性细菌，定居在人胃粘膜，引起慢性胃炎，慢性胃炎可以发展为消化性溃疡和胃癌(6)。幽门螺旋杆菌在其表面表达粘附素，粘附素使得其与胃粘膜紧密粘附，以容许这些营养缺陷型生物从宿主组织获得营养。BabA粘附素是外膜蛋白平行同源家族的成员(2)，其与在上皮细胞上表达的岩藻糖基化AB0/Lewisb血型抗原结合(7，22)。BabA是一种可能的疫苗候选物，因为临床分离物中高比例显示出表达BabA(22，26,33)。由于胃肠道中免疫活性低，抗幽门螺旋杆菌的主动疫苗接种很困难。一个其他问题是幽门螺旋杆菌的高重组率。被动免疫反而更有利，因为Abba3抗体与抗原结合，使得幽门螺旋杆菌难于附着于粘膜。最近的研究也已经证明BabA表达与消化性溃疡和胃癌的发展之间有显著的关联(16,36)。现在，正在研究递送高度ABO/Lewisb岩藻糖基化糖缀合物进行被动免疫疗法的可能性(18，43)。做为选择，干扰粘膜粘附的抗体衍生物可以口服给予或由GRAS(GenerallyRecognisedAsSafe,公认安全的)微生物在原位产生，正如口服给予抗幽门螺旋杆菌的IgG(ll，25)，或给予表达抗链球菌突变株的单链可变片段(scFv)的乳酸杆菌(30)所显示。scFv是一种由免疫球蛋白的可变重链(VH)和轻链(VL)通过灵活的肽接头连接组成的基因工程抗体。胃中细菌不仅仅面临着宿主特定环境条件，而且要面对病变进展过程中粘膜糖基化模式的改变。尽管如此，幽门螺旋杆菌仍具有产生慢性和持续感染的卓越能力，这可能是由于它出奇高的重组率(15)。幽门螺旋杆菌紧密粘附和不粘附之间转换的能力使得该细菌得到从炎症组织渗漏的营养物，但同时也使细菌暴露于宿主炎症反应(37)。BabA通过以下方法有助于结合灵活性富含CT的引导序列中基于移码的变异，与BabA密切相关的外膜蛋白(OMPs)在它的N-和C_末端区域但位于不同位点的babB和babC(4，5，40)的水平基因转移和基因转换。尽管BabA主要发现在babA位点中，但是与位于babB位点中的BabB的基因转换导致较弱BabB启动子控制下的全长BabA形成或产生BabA区别于BabB的独特区域上游重组位点的嵌合BabA/BabB基因(12)。在受感染猕猴和患者中，重组还可以引起babA位点内BabB的存在，及随后Lewisb结合的丧失(12，20，40)。第三个位点BabC，以前仅在26695菌株中描述过，最近在另外的菌株中也表明其涉及与BabA的重组交换。Backstr6m等(5)已经表明已失去结合Lewisb能力的临床幽门螺旋杆菌分离株当中，一小部分细菌群隐匿BabB/BabA嵌合体，并且体外通过与磁珠包被的Lewisb淘选可以重建Lewisb结合。这将使细菌对宿主炎症反应时糖基化模式的改变产生应答。基因转换引起嵌合型BabA形成，但是CBD(碳水化合物结合结构域)突变将引起功能丧失并由此引起幽门螺旋杆菌急性传染期的存活率降低，其中血型抗原仍然在上皮细胞上高度表达。恒河猴试验性感染末期，所分析菌株中babA位点中唯独babB的存在产生了抗原变异用来避免宿主免疫应答的假说(40)。在两份报道中测试了患者血清中幽门螺旋杆菌抗原的抗原性，但是因为在二维分离前，蛋白被尿素变性，检测构象依赖性膜蛋白的可能性颇受限制(19，27)。用分离自包涵体的重组BabA(44)免疫兔子已经产生了多克隆抗BabA血清，并且在大多数菌株中显示出识别BabA。迄今为止，已经描述了两个单克隆BabA特异性scFv，其用BabA-GST融合蛋白免疫啮齿动物而产生，范围覆盖BabA-J99结构域的氨基酸128至310(21)。Western印迹分析所分析的菌株仅仅大约一半是阳性的，可能由于与多克隆血清相比单克隆抗体有更多限制表位。此外，对仅含一部分BabA，没有明确功能性构象的蛋白进行所描述scFv的噬菌体选择。预防通过粘膜部位传播传染性疾病的新方法包括通过乳酸杆菌或其他GRAS微生物原位递送抗体片段(30)。以前已经鉴定了BabA粘附素并表明位于幽门螺旋杆菌细菌的表面(SE9602287-6)。血型结合活性显示pH依赖性，本发明人现在证明了与Lewis-b受体结合的亲和力揭示高平衡常数。深入研究涉及由幽门螺旋杆菌引起的感染的免疫治疗和预防。EP0484148(Ando&Nakamura)描述了治疗和/或预防哺乳动物中上胃肠道疾病的方法，所述方法包括将含抗幽门螺旋杆菌多克隆免疫球蛋白和药物可接受载体的有效量的药物组合物口服给予需要其的患者。该说明书进一步详述了所述疗法与给予抗生素结合的联合方法。作为生产所述多克隆抗体的方法，EP0484148描述了从哺乳动物血清和乳汁中分离和纯化抗幽门螺旋杆菌免疫球蛋白。根据EP0484148，在牛、山羊、绵羊、猪或马的胃中没有发现幽门螺旋杆菌本身，但是人们认为这些动物物种中已经定居了具有与幽门螺旋杆菌抗原决定簇类似的决定簇的微生物，因为它们具有与在人类中发现的幽门螺旋杆菌菌株有交叉反应的免疫球蛋白。根据EP0484148，优选大型哺乳动物例如妊娠牛，用幽门螺旋杆菌全细胞免疫，和随后从乳汁或初乳中提取免疫球蛋白。在免疫实验中，使用NCTC菌株11362和临床分离株幽门螺旋杆菌No.153触发免疫球蛋白的产生。另一方面，使用NCTC菌株11637进行分析目的。声称免疫在乳汁中产生了如此幅度的抗幽门螺旋杆菌滴度，日剂量O.Ol-O.lg/天免疫球蛋白成分，足以进行成功的治疗。然而Ando&Nakamura提供的实验不支持O.Ol-O.lg/天的声称区间，因此至今在临床试验中未能证明如此低的剂量有效。实施例5和7中实际使用的剂量是lg/天的数量级，即已给出的区间上限的10倍。此外，Ando&Nakamura制备的非特异性免疫球蛋白混合物在所声称剂量下是有效的几乎不大可能，因为类似的剂量抗其他胃肠病原体无效。在该说明书中广泛论述的同时给予抗生素，强调了所公开免疫球蛋白的不足。EP0469359(Cordle&Schaller)同样描述了用福尔马林杀死的幽门螺旋杆菌细菌(ATCC菌株26695)免疫哺乳动物，优选妊娠牛。从乳汁中分离和纯化抗幽门螺旋杆菌多克隆抗体，并最后饲喂给小猪，总量大约O.5g免疫球蛋白，每天三次。通过测定活检标本中试验后革兰氏阴性细菌呈阳性的数量来评价结果。在饲喂非免疫性营养物质的小猪中78%发现革兰氏阴性细菌，但是饲喂含有所谓特异性抗幽门螺旋杆菌抗体的营养物质的小猪仅仅(Sic!)发现35%。US20040234529，与本发明相同的发明人的一件专利申请，公开了BabA蛋白。所述粘附素和/或DNA对诊断和治疗和/或预防幽门螺旋杆菌诱导的感染有效，例如胃炎和酸性消化性疾病(acidp印ticdisease)，即主动接种疫苗。他们还公开了用于被动免疫接种的免疫球蛋白组合物，其对结合幽门螺旋杆菌粘附素的Lewisb抗原显示出特异活性，用于治疗和/或预防由幽门螺旋杆菌引起的胃肠疾病。与本发明不同，该抗体是动物抗体，不是特异性选择的人抗体。此外，US20040234529的申请人没有提及粪便样品的检测。尽管BabA的中心部分是最不同的并且其决定了受体结合的特异性(4，22)，但是未定位的碳水化合物结合结构域(CBD)不能经受不丧失功能的高效率突变；不过分离自南美本土人群的幽门螺旋杆菌菌株经由BabA的适应性变化显示出了在进化过程中的微调，其优先结合这个洲中主要血型抗原O-Lewisb(命名为"专用(Specialists)"菌株)。相反，分离自洲的菌株，其中A/BLewisb血型抗原更能普遍代表老居民，这证明抗A/BLewisb(包括O-Lewisb)的更普遍结合能力并因此被命名为"通用(Generalist)"结合株(4)。比对BabA序列，但是没有定位出对应于通用对专用的特异性babA结构域。因此我们旨在开发对受体结合位点特异性的抗体并使用噬菌体展示技术富集来自于患者的抗体，患者的血清特征在于对Lewisb具有竞争性BabA结合特性。本领域已经认识到如何生产由外周血单核细胞得到的抗各种肽的人scFv文库。也获知了如何选择幽门螺旋杆菌的变性、线性、非天然肽。但是以前没有文献描述选择方法，选择天然、非变性、三维BabA多肽。这里，我们提供了一种由感染幽门螺旋杆菌的患者外周血单核细胞得到的人scFv文库，和所鉴定和选择的BabA特异性人单链之一转变为人IgGl抗体，名为Abba3。Abba3scFv是指可变结合区，且包括其衍生物。令人惊奇的是，该抗体结合大多数幽门螺旋杆菌临床分离株，并显示出与A-Lewisb或B-Lewisb血型糖抗原类似的结合特性，即优先识别世界范围内分布最广泛的"通用"型BabA。Abba3抗体通过与BabA结合而中和幽门螺旋杆菌，使得该细菌难于附着于粘膜。因此该细菌/抗体复合物从消化系统自然消失。由于胃肠道免疫活性低，抗体检测不如抗原检测有效。因此，优选使用Abba3抗体检测粪便样品中幽门螺旋杆菌的检测试剂盒。因为Abba3是一个完全人IgGl抗体，所以它具有在激活补体指导的细菌溶解中有效的优势，由此也激活免疫系统。因此本发明的一个目的是提供根据特异性结合幽门螺旋杆菌BabA的能力选择的抗体Abba3，用于被动疫苗接种。使用Abba3进行粪便样品中幽门螺旋杆菌的抗原检测也是本发明的一个目的。因此本发明的一个目的是提供使用本发明这里描述的方法根据其特异性结合幽门螺旋杆菌BabA的能力选择的任何抗体。由下列公开内容和所附权利要求，其他目的和优点将更加明显。
发明内容病原体幽门螺旋杆菌粘附人胃粘膜需要属于幽门螺旋杆菌外膜(HOP)蛋白家族的粘附素。较好表征的相互作用是BabA粘附素和岩藻糖基化血型ABO/Leb抗原之间的作用，所述抗原沿着胃肠道(GI)内壁以糖缀合物表达。这里，我们描述了对BabA蛋白具有特异性的人scFv抗体片段的鉴定和选择，尤其是竞争结合Lewisb抗原(Leb)的scFv克隆。选择其血清被证明与BabA介导的细菌结合Leb具有竞争性结合活性的感染幽门螺旋杆菌患者，和从外周血单核细胞(PBLs)分离的RNA用于构建噬菌体展示scFv文库。从幽门螺旋杆菌纯化的天然BabA粘附素用于探测文库并鉴定到克隆(Abba3)，其完成了完全人IgGl抗体并在昆虫细胞中表达。与Leb竞争性结合并结合于构象依赖性BabA免疫表位揭示自然受体的类似结合位点，即ABH/Leb抗原。如Aspholm-Hurtig等在2004年描述的具有通用(ABO/Leb抗原)结合特征的幽门螺旋杆菌菌株优先被Abba3抗体结合，提示通用对专用类型BabA在结构和构象上的差异。我们鉴定了通过结合BabA而中和幽门螺旋杆菌的Abba3抗体，使得该细菌难于定居在粘膜上，因此Abba3/BabA复合物从胃肠道自然消失。Abba3是一个完全人IgGl抗体，优势在于是非免疫原性的和同型IgGl在激活免疫效应器功能中有效。Abba3scFv是指可变结合区，且包括其衍生物。此外，公开了使用Abba3抗体和衍生物检测粪便样品中幽门螺旋杆菌的检测试剂盒。附图简要说明图1显示了各个噬粒承载克隆表达的scFv-pIII融合蛋白，在ELISA分析了其结合BabA。检测与抗pIIImAb—起进行。括号中的名称给出了测序后的克隆。作为阴性对照，等同检测相同噬粒载体中克隆的不相关抗Ph0xscFv。图2显示了分离的BabA-结合物推导的VH-(a)和VL-(b)氨基酸序列与它们的最接近人种系的V基因的序列比较。(a)与它们的种系基因相比VH链高数量的突变表明亲和力成熟。克隆5和6的VH序列仅在FR2区域有一个氨基酸序列置换而不同于Abba3序列。破折号表示序列同一性，和点表示序列中的缺口。(克隆C4的VH:IgHV3-48*3IgHD-19*01，IgHJ4*02;克隆C5的VH:IgHVl-18柳l，IgHD3-10柳2，IgHJ4氺02)。Abba3-VL来自种系基因IgKVl-39*01和J-片段IgKJl*01。克隆6和克隆C5很可能源自与它们所来源的相同种系和J-片段(IgKJ4*01)相同的前体。克隆5的VL通过与IgKJl*01重组，来源于种系基因IgKV2-30-l。图3显示了结合幽门螺旋杆菌菌株17875/Leb而不结合其中BabA基因已被敲除的相应菌株babAlA2突变株的scFv-Abba3。用PBS系列地稀释IMAC纯化的scFv-Abba3并在包被相应菌株的ELISA孔上孵育。使用抗myc标记的mAb(9E10)和HRP偶联抗鼠Ab检侧￡口口。图4显示了识别来自幽门螺旋杆菌菌株17875/Leb溶菌液的BabA的ScFv-Abba3(泳道1)，但是BabA双敲除菌株babAlA2溶菌液没有见到条带(泳道2)。甚至在粗略变性条件下，仍识别来自菌株17875/Leb溶菌液的BabA(泳道3至6)。相比之下，仅当蛋白被适度处理(泳道7)和在添加硫基乙醇和热处理(泳道8)后破坏了表位时，识别来自菌株17875/Leb的纯化BabA，提示细菌溶菌液中蛋白稳定。泳道1:非还原幽门螺旋杆菌溶菌液(5ii1菌株17875/Leb，0D1.0);泳道2:非还原菌株babAlA2，5ii10D1.0);泳道3至泳道6:粗略还原的幽门螺旋杆菌17875/Leb溶菌液(分别12yl，5yl，1yl，0.2yl，0D1.0;2.5%巯基乙醇，3%SDS和96。C加热15分钟)；泳道7:来自菌株17875/Leb的非还原的纯化的BabA(500ng);泳道8:来自菌株17875/Leb的还原纯化的BabA(500ng)。图5显示了与BabA-受体Leb竞争结合幽门螺旋杆菌的IgG-Abba3和scFv衍生物。幽门螺旋杆菌菌株17875/Leb与恒定量的放射性标记的HSA-Lewisb偶联物在各种量的竞争物存在下共同孵育。相对亲和力用使放射性标记的Lewisb与幽门螺旋杆菌菌株17875/Leb的结合降低至50%所需的竞争物的量来表示(参见本文)。抗体Abba3的相对亲和力显示比scFvAbba3(247pM)高五倍(47pM)。对E1-HCV包膜蛋白具有特异性的对照抗体和对半抗原2-苯基恶唑酮具有特异性的scFv不竞争Leb结合。图6显示了电子显微照片，证明幽门螺旋杆菌菌株17875/Leb的BabA被Abba3-Ab染色细菌与人抗体孵育并用金标记的A蛋白检测结合率。抗体Abba3-Ab与幽门螺旋杆菌菌株17875/Leb孵育(A，B);抗体Abba3与幽门螺旋杆菌菌株匿孵育(C)，不相关抗体(抗E1HCV包膜)与幽门螺旋杆菌菌株17875/Leb孵育(D)。图7显示了ELISA测定的Abba3_抗体结合不同幽门螺旋杆菌临床分离株的能力(A)。(A)ELISA中测试临床幽门螺旋杆菌分离株的功能性BabA表达。用生物素-Leb偶联物探测和用AP-链霉抗生物素蛋白检测包被菌株。(B)使用相同的包被情况，通过用AP偶联的抗人检测来测试Abba3-IgGl结合。总计79%(52株中的41株)所分析的菌株被Abba3-IgG结合。专用菌株用t标出。图8免疫印迹中显示了Abba3_抗体识别来自不同的幽门螺旋杆菌临床分离株的BabA的能力。从板上刮下幽门螺旋杆菌菌落，PBS中洗涤两次并标准化至0D0.6。SDS溶解的培养提取物在37t:孵育，用SDS-PAGE分离并转到硝酸纤维素膜上。Abba3_IgG(6yg/ml)检测后随之用HRP偶联的抗人IgG进行检测。显示了两个代表性的印迹。图9是图1的ELISA和Western印迹结合数据的图解说明具有通用Lewisb结合特性的几乎所有菌株都被Abba3抗体识别(31株中的30株)，而仅结合大约仅一半(21株中的ll株)的具有专用Lewisb结合特性的菌株。Fisher's精确检验揭示具有可信值p<0.0002的统计显著性。图10是总结ELISA和免疫印迹测定Abba3抗体的结合分析的表。注意到针对不同菌株，ELISA和免疫印迹结合之间清楚的一致性。第5栏显示了根据Aspholm-Hurtig等(4)，Leb对A-Leb结合之间的比值；值高于2.5的分为专用结合物并以粗体描述。来自(4)和本公开物所测定菌株的BabA基因序列的登录号列在第6栏。具体实施例方式BabA血清阳性的供体的选择测试36名感染幽门螺旋杆菌的瑞典患者的血清抑制多价连接于1251标记的白蛋白的Leb(Leb偶联物)与幽门螺旋杆菌菌株17875/Leb细菌结合的能力。几乎所有的患者显示低抑制滴度(平均1:50)。然而，六个血清显示出高滴度Leb抑制(1:355至1:8361)，使用两个瑞典人(Sw7，Sw44)，一个秘鲁人(P436)，一个阿拉斯加人(A714)，一个西班牙人(S863)，一个中国人(Chi)和一个参照菌株J99(3)进一步测试这些对Leb结合的抑制。三个血清显示对大多数菌株高抑制滴度(未显示数据)。V基因谱系和scFv文库的产生分离抑制阳性血清的三个患者的PBLs的RNA，产生相应cDNA并用于扩增编码抗体V区的基因。为了避免主要克隆的优先扩增造成的偏差，每个患者的VH和VL区与家族特异性引物分别扩增。混合每个患者的V1k即pa区并克隆入噬粒载体pSEX81(8)，产生三个k即paVL子库，每个库含有大约7X10S个单独克隆。20个单独克隆的测序证明完全不同。扩增的每个患者的VH区被克隆入相应VL-k即pa子库，产生三个分离的scFv文库，每个大约7Xl(f个单独克隆。为了控制文库的质量，Western印迹使用抗pIII结构域的mAb，分析scFv-pIII融合蛋白的全长表达(41)。由于15个单独克隆中有6个表达scFv-pIII融合蛋白，因此估计每个库的实际大小包含3X106个功能性克隆。特异性结合物的淘选三个文库混合库的噬菌体颗粒通过过度感染辅助噬菌体并经受在BabA包被免疫管上的三次淘选循环而产生。为了监测BabA特异性结合物的增加，噬菌体还要经受在BSA包被免疫管上的选择。如从BabA包被免疫管和仅被BSA封闭的免疫管洗脱的噬菌体比值所测定的富集因子所示，在第二轮淘选中是55，和在第三轮淘选中是2381。第三轮淘选后得到的单独克隆表达scFv-gIII融合蛋白并用ELISA筛选BabA结合。在所分析的24个克隆中，14个显示特异性结合BabA。图1显示了噬粒表达单独克隆的筛选ELISA试验。序列分析显示一个克隆流行(6x倍)相似V区的存在和组合，由此命名为Abba3(抗babA)(图2)。MGT数据库中Abba3-VH区的筛选揭示它是由种系基因IgHV3_48*3与D-片段IgHD2-15*01和J-片段IgHJ4*03重组产生的。其他代表性结合物的VH区来源于不同的B细胞前体，因为它们是由不同的种系基因或与不同D-和J-片段发生重组得到的(参见图2)。Abba3VL链来源于VL种系基因IgGKVlD_39*01，与J-片段IgKJl*01重组得到。类似地，其他结合物的VL区来源于不同的B细胞前体，因为与不同VL和J-片段发生重组。来自第二轮淘选的噬菌体也经固定化菌株17875/Leb淘选，用BabA配体亲和洗脱，即Leb代替常规三乙胺缓冲液，产生Abba3克隆的唯一选择(未显示数据)。Abba3的结合特异性主要的scFvAbba3亚克隆在原核生物表达载体上，允许用抗ciyc的单克隆抗体检测和IMAC纯化(13，14)。为了测试scFv-Abba3是否能够识别细菌上BabA，用固定化幽门螺旋杆菌进行ELISA结合试验。Abba3-scFv的系列稀释证明结合幽门螺旋杆菌菌株17875/Leb，但是不结合相应的阴性对照菌株DM，其中功能性BabA基因(BabA2)以及非转录BabA基因(BabAl)已被敲除(22)(图3)。免疫印迹分析进一步证明Abba3-scFv的特异性，因为它识别细菌溶菌液中预期分子量的条带和菌株17875/Leb的纯化蛋白条带(图4)。有趣的是，只有当纯化的BabA蛋白已在适度条件下处理时才发生特异性识别；用还原剂和加热96t:处理破坏Abba3表位(图4，泳道8)，类似Lewisb结合特性中所描述(22)。这与幽门螺旋杆菌17875/Leb溶菌液的BabA识别相比，在Western印迹中其甚至在粗略还原和变性条件下亦不会消除scFv的结合。这可能是由于BabA和其他稳定蛋白质之间形成复合物，该稳定物质在纯化后的蛋白制剂中缺乏。细菌溶菌液中双条带的出现可能是由于不同的糖基化模式，因为多个N-糖基化位点(N-X-S/T)位于BabA的C-末端区。为了达到稳定性、亲合力和极易操作，使用其它地方描述的表达载体将scFv转变为完全人IgG(24)。Abba3抗体在昆虫细胞中产生并显示出对ELISA板上包被的细菌不受限制的结合，且多个解冻循环时也不受损害(未显示数据)。为检测与Lewisb的竞争性结合，系列稀释Abba3-scFv和Abba3抗体并在恒定量放射性标记的Lewisb存在下与幽门螺旋杆菌菌株17875/Leb孵育。足以使Lewisb结合还原降至其最大值的一半的scFv和IgG抗体的浓度分别测定是0.25iiM和47pM。使用不相关scFv(抗半抗原2-苯恶唑酮)(31)或不相关同型匹配人单克隆抗体观察到不抑制Lewisb结合，后者已经通过重组而生产出来(抗HCV包膜蛋白El(23))(图5)。电子显微术中细菌外膜上BabA的染色可以通过Abba3-抗体与幽门螺旋杆菌菌株17875/Leb孵育证明，而不是与相应BabA敲除的菌株DM孵育。作为另外的阴性对照，与同型匹配人抗体在表达BabA的幽门螺旋杆菌菌株17875/Leb上不显示出任何染色(图6)。抗幽门螺旋杆菌分离株的反应性为测试Abba3免疫表位在全世界临床幽门螺旋杆菌菌株BabA中的流行程度，我们用代表性菌株进行全系列ELISA和免疫印迹测试。对于Abba3分析，仅仅考虑表达功能性BabA蛋白的这些幽门螺旋杆菌菌株。因此我们在ELISA结合试验中测试了菌株结合血型抗原的能力(图7a)。使用相同的ELISA条件，测定相同菌株的Abba3结合(图7b)。使用已经根据"适度方案"处理的幽门螺旋杆菌全部细胞抽提物进行免疫印迹分析，即无还原条件和低温，SDS-PAGE分离之前(22)(图8)。表1总结了所使用临床分离株的结合特性，即Leb配体和Abba3-抗体的结合能力。此夕卜，列出了相应babA基因的登录号。发现Abba3抗体识别最好的来自幽门螺旋杆菌菌株的BabA，其结合一系列ABO/Leb抗原(被(4)定义为通用型)，而Abba3抗体识别来自专用菌株(专用型)的BabA效率较低(图9)。大多数通用菌株(31株中的30株)被Abba3-Ab结合(日本菌株J507是例外)，而21株专用菌株中仅ll株(Sw60，Sw103，P302，P304，P308，P326，P330，P445，P449，P454，P455)被Abba3-Ab识另U。与专用型相比，Abba3抗体优先结合通用型可能是由于抗体的partope，分别反映A-Lewis和B-Lewis血型糖抗原较庞大的Gal和GaINAc末端基团。Abba3抗体与(Henning等，2004)描述的抗体相比，较高的结合率可能是由于受体竞争性结合特性和因此识别更保守表位。我们相信高亲合力抗体的成功选择建立在充分筛选合适的具有限定抗体结合特性的患者血清上。此外，在固定化抗原保持与其受体结合的条件下进行噬菌体的选择，如通过在免疫管中测定固定化BabA与生物素化Lewisb的结合进行验证(未显示数据)。噬菌体展示应用于从感染幽门螺旋杆菌患者开发和援救全部免疫系统(immuner印ertoire)被证明可成功选择具有限定特性的单克隆抗体。由于供体全部来自瑞典，可能他们已经感染了通用菌株，即使为构建噬菌体展示文库对抗体可变区进行了改组，看来也足以可能进行功能重组。既然胃肠道中免疫活性受限，那么就优选被动的免疫形式。Abba3抗体结合BabA，防止幽门螺旋杆菌粘附于胃粘膜。偶尔当抗体来源于动物时，由于过敏反应，被动免疫伴发并发症。由于Abba3抗体是人的，因此副作用风险降低了。由于胃肠道中免疫活性受限，通过检测抗体诊断幽门螺旋杆菌感染的可能性受限。因此优选检测粪便样品。预防通过粘膜部位传播传染性疾病的新方法包括通过乳酸杆菌或其他GRAS微生物原位递送抗体片段(30)。因此，具有抗BabA特异性的Abba3及其片段可以用来防止幽门螺旋杆菌定居在粘膜上。此外，增长的证据提示幽门螺旋杆菌参与冠状动脉病的发病(29)。与非人抗体相比，Abba3抗体完全是人源的，不激发免疫遗传应答，和IgGl型的优点是有效活化补体指导的细菌溶解，由此活化免疫系统的效应子功能。实施例1BabA-抗体阳性的供体的选择测试36名感染幽门螺旋杆菌的瑞典患者血清抑制放射性标记的Lewisb-HSA偶联物与幽门螺旋杆菌菌株CCUG17875结合(17875/Leb)的能力。为更容易回收沉淀，用已经失去结合Leb能力的菌株17874以1:60稀释0D0.1的菌株17875/Leb。血清系列稀释以封闭缓冲液(PBS0.05%Tween20，1%BSA)稀释，并添加50y1放射性标记的Lewisb-HSA偶联物(0.Olng/y1)至终体积500。添加500y1细菌后，管在RT(室温)轻柔混合17小时。样品离心(13000g，13分钟)，随后测定沉淀和上清的放射性并彼此建立关联，表示结合的和游离的偶联物。测试血清的相对滴度是通过缺乏任何血清时由偶联物结合测定的足以使结合降至最大值一半的浓度。进一步测试滴度最高的六个血清对放射性标记Lewisb-抗原与七个幽门螺旋杆菌临床分离株(Sw7，Sw44，P436，A714，S863，Chi(本文描述)和J99(3))结合的抑制。实施例2.人可变区的cDNA合成和PCR扩增Ficoll梯度从10ml患者血液分离外周血单核细胞(PBMCs)，并使用标准方案提取总RNA(Qiagen，Hilden，德国)。用寡d(T)弓|物(AmershamBiosciences,Buckingham,英国)合成第一条cDNA链，和在50iU反应中PCR扩增人可变免疫球蛋白基因，反应中包含lylcDNA、200iiMdNTPs、5ii110X反应缓冲液、1U聚合酶(BD-Advantage2，BDBiosciencesClontech，PaloAlto，CA)和适当的基于家族的正义和反义引物(500nM)，36个循环(94t:变性15秒，65t:退火30秒，72t:30秒)。正义和反义引物在其它地方已经描述过(31,42)。对于可变k即pa轻链扩增，为了引入MIuI克隆位点，正义引物在5'末端延长序列TACAGGATCCACGCGTA(SEQIDNO:1)和为了引入NotI位点，反义引物延长序列TGACAAGCTTGCGGCCGCG(SEQIDNO:2);对于可变重链扩增，正义引物延长序列GAATAGGCCATGGCG(NcoI)(SEQIDNO:3)和反义引物延长序列CAGTCAAGCTT(HindIII位点)(SEQIDNO.4)。反义引物分别在CHI和恒定K即pa区5'末端退火。全部扩增用每个家族特异性正义引物单独进行。混合PCR产物，凝胶提取(Qiagen)，对于可变轻链，用MIuI/NotI(NewEnglandBiolabs)消化，和对于可变重链的克隆，用NcoI/HindIII消化。消化后，再次凝胶纯化片段并保存在-20°C。实施例3.scFv文库的构建在CIP存在时，用MIuI/NotI消化噬粒载体pSEX81-ph0x(8)并在0.7%琼脂糖凝胶中分离和提取(Qiagen，德国)。lOOng消化的载体与lOng纯化的可变轻链16。C连接过夜，连接终体积为40ii1，其中含1U连接酶(Roche)。乙醇沉淀质粒DNA，在大肠杆菌菌株XLl-blue(Stratagene)中电穿孔，细菌在lmlS0Cmedia(含0.1M葡萄糖的LB)中生长lh以容许其恢复。随后将细菌铺在SOBGAT板(0.1M葡萄糖、100yg/ml氨苄青霉素、12.5yg/ml四环素)上，并37t:孵育过夜。刮下克隆并用阴离子交换层析柱(Macherey&Nagel，德国)分离载体DNA。对于可变重链的克隆，用HindIII/NcoI(NewEnglandBiolabs)消化载体DNA，与适当消化的VH链连接，转入XL-Iblue并如上所述生长。刮下单独的克隆并8(TC保存在25%甘油中，提供了最后的scFv文库。实施例4.噬菌体展示选择从基本上如Schier等1996年(39)描述的文库搜筛噬菌体联合抗体。在用5yg纯化BabA(D印artmentofOralBiology,UmeaUniversity,瑞典)4。C包被过夜并用2%MPBS(含2X(w/v)的PBS)低脂脱脂奶粉封闭的Maxisorb免疫管(Nunc,Wiebaden，德国)中进行淘选。包被BSA的管用作阴性对照。对于选择，添加等体积含4%乳剂(w/v)的PBS封闭噬菌体(1012菌落形成单位)，添加到管中并在恒定滚动下室温(RT)孵育2小时。随后丢弃溶液，和在第一轮淘选中，用PBS洗涤管10次。随着淘选循环的进展，增加洗涤严格性，用PBS/0.1%Tween20旋转10次。结合的噬菌体通过添加1ml三乙胺(0.1M)轻柔搅拌，洗脱5分钟，并用0.5mlTris-HCl，pH7.4(1M)中和。使用中和混合物37。C感染20ml2YT(12.5yg/ml四环素)中生长的指数期大肠杆菌XLl-blue。37°C不摇动孵育15分钟后，将细菌摇动45分钟，铺在SOBGAT板(参见上面)上，并37。C孵育过夜。如所述收获细菌，接种在10mlLB-培养基(氨苄青霉素100g/ml，0.IM葡萄糖)，0D0.4，生产用于随后淘选循环的噬菌体。洗脱的含辅助噬菌体或噬粒基因组的噬菌体滴度分别通过在LB-卡那霉素(70iig/ml)或LB氨节青霉素(100yg/ml)板上的cfu滴定来测定，基本上如Koch等2000年(28)的描述。选择步骤过程中，特异性结合物的富集用从包被BabA的免疫管洗脱的噬菌体数量除以从BSA包被的免疫管洗脱的噬菌体数量来确定。实施例5.用scFv-gIII融合蛋白进行EL1SA筛选利用在噬粒载体中编码的表达pIII的蛋白，改进但基本上如Mersma皿等1998年(32)的描述，筛选BabA特异性scFvs。简言之，IPTG(100yM)30。C诱导16小时，诱导对数生长细菌产生scFv-glII融合蛋白。将细菌离心，和将沉淀在球芽溶液(50mMTris-HClpH8.0，20%蔗糖，1慮EDTA)中冰上孵育20分钟，随后20000g，4。C离心45分钟。用相同体积的4%MPBS稀释代表周质提取物的上清，并用于ELISA试验。用200ngBabA在包被缓冲液(Na2C03-NaHC03pH9.6)中4。C过夜包被ELISA孔(NuncMicrotitreplates，德国)。2%MPBS封闭后，添加周质提取物并室温孵育4小时。结合抗原的scFv-pIII的融合蛋白的检测通过如下方法，与pIII特异性的鼠单克隆抗体(41);MobiTec，德国)室温孵育l小时，随后与辣根过氧化酶偶联兔抗鼠抗体(Dako，丹麦)室温孵育1小时。在底物缓冲液(lOOmM醋酸钠/柠檬酸pH4.9/H2020.004%)中使用TMB-(3，3'，5，5'-三甲苯，Merck，德国)来完成着色。作为阴性结合对照，在相同噬粒载体中表达2-苯恶唑酮(抗ph0x)(31)scFv，和使用包被ph0x偶联的BSA的ELISA分析这个scFv的表达。实施例6.亚克隆入原核生物表达载体p0PE101将来自噬粒载体pSEX81的全部scFv表达盒在NcoI和NotI位点亚克隆入原核生物表达载体p0PE101(Genbank#Y14585)。(该克隆名为p0PE101-Abba3并根据布达佩斯条约保藏在德国微生物保藏中心(DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)，德国Braunschweig。其收到保藏号DSM19101和2007年2月28日保藏)。myc-C-末端和(His)6-标记分别允许检测和IMAC纯化。如Breitling等2001年(9)描述的从周质间隙进行纯化。实施例7免疫印迹为了控制scFv文库的质量，将从IPTG诱导的单克隆细菌中提取的10iU周质提取物在12%SDSNuPageBis-Tris凝胶(Invitrogen，CA)上进行分离。分离的蛋白转移到I,bilonPVDF膜(Millipore，Bredford，MA)，用2%MPBS(含2%低脂脱脂奶粉的PBS)封闭并用抗gIIImAb(MobiTec，GSttingen，德国)，随后的AP偶联兔抗鼠(Fab)2Ab(Sigma-Aldrich，德国)和底物进行显影。对于功能性结合分析，BabA或可变量幽门螺旋杆菌细菌，于PBS中重悬并校准至OD0.6，溶解于一体积SDS-样品缓冲液(62mMTris-HClpH6.8，25%甘油，2%SDS，溴酚蓝)并加热至37。C10分钟(根据liver等1998年)或重悬于含巯基乙醇(5%)(或另外3XSDS)的l体积SDS-样品缓冲液并加热至96t:。样品进行SDS-PAGE，分离蛋白转移到Hybond-ECL硝酸纤维素膜(AmershamBiosciences)上。用2%M-PBS封闭膜并添加IMAC纯化的scFv-Abba3(PBS稀释)或Abba3_Ab(在T-PBS0.05X中含6iig/ml)4t:过夜。结合的scFv的检测通过将膜与生物素化的鼠抗mycmAb9E10孵育，随后与链霉抗生物素-HRP-偶联物孵育来进行。结合的Abba3抗体通过与T-PBS0.05%以1:3000稀释的HRP偶联抗人IgGAb(Dako，丹麦)孵育来检测。每个抗体孵育步骤后，膜用T-PBSO.05%洗涤4次。用ECL加Western印迹检测系统试剂盒(AmershamBiosciences)根据厂家规程进行显影。实施例8.完全人抗体的生产可变区克隆入分别携带人IgGl重链和人k即pa链的恒定区的昆虫细胞表达载体pMThlgGl-V(24)。PCR扩增使用VL链的引物:VL5'Sfil，TTACTCGCCTGGCCGTCGTGGCCTTTGTTGGCCTCTCGCTGGGCGACATCCAGATGACCCAGTC(SEQIDNO:5);VL3'BsiWI，AGCGTACGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCC(SEQIDNO:6);和VH链的引物VH5'SnaBI，GATGTCTACGTAGGCCTCTCGCTGGGCCAGGTGCAGCTGGTCCAGTC(SEQIDNO:7);VH3'Apal，ACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCGGAGGAGACGGCGACCAGGG(SEQIDNO:8);PCR扩增使用lOOng噬粒载体作为模板，各自的VL和VH引物对每种25pmol，2iiMMgCl2，0.2mMdNTP和lOUTaq聚合酶(Promega)。94°C2分钟初次变性步骤后，进行如下32个循环94。C15秒，62。C30秒，72。C30秒；最后一次延伸步骤72°C5分钟。PCR产物用QiagenPCR纯化试剂盒(Hilden，德国)纯化，并在克隆前用适当的限制性内切酶消化。如以前所述构建稳定的分泌抗体的S2细胞系(Invitrogen，美国)，使用G蛋白柱(AmershamPharmacia,Uppsala，瑞典)纯化培养基中的抗体并富集。分别用考马斯染色和ELISA分析所纯化抗体的纯度和功能。实施例9.表达抗体片段的乳酸杆菌的生产使用引物通过PCR扩增来源于Abba3抗体可变区(VH和VL)的scFv编码基因5'Clal-ABBA3(TTTGCATCGATCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTG)(SEQIDN0:9)作为正义引物和Vk-mycXhoITTCCACCTTGGT)(SEQIDNO;10);或Vk-myc-STOP-XhoITGATTTCCACCTTGGT)(SEQIDNO:ll)作为反义引物，用于分别克隆入载体pLP502-l禾口pLP502-2。这个穿梭载体允许在大肠杆菌中的克隆和繁殖和在乳酸杆菌中表达，因为它们包含大肠杆菌和乳酸杆菌两者的复制起点和它们的克隆位点上游的乳酸杆菌特异性调节序列和启动子。在载体pLP502-l中，scFv表达盒以和乳酸杆菌膜-蛋白基因prtp融合的形式克隆，该基因调节scFv盒在细胞表面的表达。载体pLP502-2允许scFv分泌到细菌细胞外部，因为scFv序列后存在终止信号。通过干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei，ATCC293)转化菌株的免疫印迹或可溶ELISA试验分析ScFv表达，使用用于检测的抗共表达myc-标记和AP-偶联抗鼠抗体的单克隆抗体。实施例10.使用改良乳酸杆菌生产口服疫苗和口服疫苗的用途改良的实施例9的乳酸杆菌菌株如工业中所知生长、收获和冷冻干燥，然后以每克至少104至1(fCFU范围的量装入标准硬凝胶胶囊。已知感染幽门螺旋杆菌的一组患者给予这种胶囊一周。这段时间之后，使用标准方法或本文描述的方法再次分析患者的幽门螺旋杆菌感染，表明在几名患者中，感染已经被消除或减轻。实施例11.幽门螺旋杆菌菌株的ELISA结合测试抗体-Abba3结合幽门螺旋杆菌临床分离株的能力。菌株在补充10%牛血和l%IsoVitox(SvenskaLABFAB，Ljusne，瑞典)的布鲁氏杆菌琼脂培养基上，37°C，10%C02和5%02生长4045小时。刮下细菌并通过悬于PBS洗涤两次，4000g离心和将沉淀重悬于PBS。光密度调至0D600nm0.6，和使用100ii1包被96孔MaxisorbELISA板(Nunc,丹麦)的每个孔。4t:过夜孵育后，用2XM-PBS封闭板，添加T-PBS(PBS0.05%Tween20)稀释的抗体4t:过夜。抗体的检测如下进行AP偶联抗人IgG(Dako，丹麦)室温孵育l小时，随后添加lmg/ml的4-磷酸硝基苯(Sigma-Aldrich，德国)。显色40分钟后，读取405nm处的吸光度。对于Lewis-b结合试验，向幽门螺旋杆菌包被的ELISA板的孔中添加生物素化HSALewis-b糖缀合物(Isos印.Tullinge，瑞典)(0.115iig/ml，4。C过夜)。通过与1:2000稀释的AP偶联链霉抗生物素室温孵育45分钟来检测结合的糖缀合物。T-PBS0.05%洗涤孔4次，添加lmg/ml4-磷酸硝基苯(Sigma-Aldrich，德国)10分钟后，随之测定405nm处的吸光度。实施例12.BabA的核苷酸序列分析菌株如上所述生长，从板上刮下菌落并洗涤，重悬于PBS至光密度OD1。使用一毫升这种悬液根据厂家指导(Qiagen，德国)分离基因组DNA。PCR扩增覆盖第一个核苷酸大约核苷酸1200的BabA片段，使用4iU基因组细菌DNA作为模板和正向弓|物babA2-271(4)(5'-ATCCAAAAAGGAGAAAAAACATGAAA-3')(SEQIDN0:12)/babA2-Leader(5'-GCTTTTAGTTTCCACTTTGAG-3')(SEQIDN0:13)两者之一与反向引物Jl1R(5'-TGTGTGCCACTAGTGCCAGC-3，)(SEQIDNO:14)或A26R(5'-TTGCTCCACATAGGCGCA-3')(SEQIDNO:15)之一的组合。PCR片段连入T-载体并用T7和SP6启动子特异性引物测序。实施例13.测序和DNA分析用Sanger的双脱氧链终止法测定核苷酸序列，使用BigDye终止循环测序试剂盒(BigDyeTerminatorCycleSequencingkit,AppliedBiosystems，FosterCity，CA)或使用丽G-BiotechAG，Ebersberg，德国的服务。使用网址http:〃imgt.cines.fr确定人V-D-J片段的IgG-种系序列。用载体NTI10程序(Invitrogen，CA)进行装配和序列分析。实施例14.预先免疫电子显微术(Pre-immunoelectronmicroscopy,p—iEM)幽门螺旋杆菌菌株17875/Leb和DM(BabA2和BabA双敲除)如上所述生长，从板上刮下并重悬和在PBS中校准至0D600nm1。将等分每个菌株重悬于含2%牛血清白蛋白(BSAV片段)的O.1M二甲次胂酸钠缓冲液(caco)中15分钟。然后将细菌离心并重悬于初级人抗体Abba3或不相关的相同同工型的人抗丙型肝炎病毒抗体(HCV)，稀释(1+1)于0.1Mcaco+0.1%BSA并孵育60分钟。孵育后，细菌在O.1Mcaco+0.1XBSA中洗涤两次并重悬于含有与10nm金颗粒偶联的A蛋白(Amersham，英国)的相同缓冲液中并孵育45分钟。添加戊二醛至终浓度1%终止孵育。4t:固定样品过夜。随后细菌离心成球丸并包埋进行其它地方(17)描述的常规电子显微镜检查并在TecnaiIO透射电子显微镜(Fei，荷兰)中80kV检查，和用MegaviewIII照相机(AnalySiS，Miinster，德国)收集数字图像。实施例15.直接免疫电子显微术(d-iEM)包埋前，取小份的球丸并将其重悬于蒸馏水中。小滴(3iU)置于聚醋酸甲基乙烯脂涂布的栅格并允许贴附5分钟。用滤纸除去过量水，栅格空气干燥5分钟，并用Tecnai10电子显微镜，100kV检查，和摄影胶片记录图像。实施例16.检测幽门螺旋杆菌或BabA的用于体外诊断用途的免疫测定对于体外诊断用途，Abba3可以用于酶免疫测定定量测定大便样品中毒力因子之一的幽门螺旋杆菌或BabA。对于该测试，用夹心法用特异性抗体捕获幽门螺旋杆菌将多克隆抗螺旋杆菌血清固定于微孔板的孔中，在本领域已知的封闭和PBS洗涤步骤后，移液管移取待检测的大便样品悬液和对照在环境温度下进行孵育。向微孔板中添加酶(例如过氧化物酶)偶联Abba3抗体在室温下检测结合的细菌，随后是进一步的洗涤步骤和添加底物时颜色形成。消光与样品中存在的幽门螺旋杆菌浓度成正比。实施例17检测试剂盒的制备使用免疫测定技术的试剂盒，其依赖于抗原和相应抗体例如Abba3之间的特异性结合，已经被证明是测定样品中存在(或缺乏)病原体的可靠方法。在本例中，是粪便样品中的幽门螺旋杆菌。—类装置，被认为是免疫层析检测(ICT)装置，使用免疫测定技术和与抗体偶联的标记相结合，现在常常用于快速、可靠现场检测确定特定分析物的存在或缺乏。该标记与抗体/抗原分子连接时，然后一起积聚在特定限制区域内，根据所用标记的类型，变得人裸眼或用扫描装置容易检测到。通常，标记可以是乳液、金或碳的颗粒，放射性颗粒，磁粉，或具有允许其被固定或吸引至某限定区域的其他物理或化学特性。使用夹心技术的ICT装置尤其易于使用。利用这个技术，结合待检测的特异性抗原的标记抗体混杂在怀疑包含特异性抗原的样品中。如果样品中存在抗原，标记的抗体与抗原结合而形成标记_抗体_抗原复合物。稳定固定在检测区并且也与特异性抗原结合的二抗在检测区与标记_抗体_抗原复合物结合。标记在检测区蓄积使得可见到阳性结果。这种装置是标准的产品，容易获得，经济，并且非专业人员可以使用。实施例18AbbaVH和AbbaVL的序列在此附上的是序列表，显示了AbbaVH(SEQIDNO:16)和AbbaVL(SEQIDNO:17)的核苷酸序歹!J，和AbbaVH(SEQIDNO:18)和AbbaVL(SEQIDNO:19)的氨基酸序列。参考文献1.Achtman，M.，T.Az丽，D.E.Berg，Y.Ito，G.Morelli，Z.J.Pan,S.Suerba咖，S.A.Thompson,A.vanderEnde，andLJ.vanDoom.1999.RecombinationandclonalgroupingswithinHelicobacterpylorifromdifferentgeogr即hicalregions.MolMicrobiol32:459_470.2.Alm，R.A.，J.Bina，B.M.Andrews,P.Doig，R.E.Hancock,andT.J.Trust.2000.ComparativegenomicsofHelicobacterpylori-analysisoftheoutermembraneproteinfamilies.InfectImm皿68:4155—4168.3.Alm，R.A.，L.S.Ling，D.T.Moir，B.L.King,E.D.Brown，P.C.Doig，D.R.Smith,B.Noonan，B.C.Guild,B.L.dejonge，G.Carmel，P.J.Tummino，A.Caruso，M.Uria-Nickelsen，D.M.Mills,C.Ives，R.Gibson,D.Merberg，S.D.Mills,Q.Jiang，D.E.Taylor,G.F.Vovis，andT.J.Trust.1999.Genomic—sequencecomparisonoftwounrelatedisolatesofthehumangastricpathogenHelicobacterpylori.Nature397:176-180.4.Aspho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