新的凝血酶功能化合物和基于其的药物组合物的制作方法

专利名称：新的凝血酶功能化合物和基于其的药物组合物的制作方法
新的凝血酶功能化合物和基于其的药物组合物本发明涉及新的化合物，这些化合物作为凝血酶抑制剂的用途，以及基于它们的 药物组合物，且其可用于治疗和预防凝血酶-相关的血栓栓塞性事件，以及用于研究目的。凝血酶为血液凝结系统(将可溶血浆蛋白(纤维蛋白原)转化为不溶的纤维蛋白 凝块)的主要的酶。凝血酶形成(造成纤维蛋白聚合反应的过程)和凝血酶抑制(亦即抑 制凝血酶活性的过程)之间存在脆弱的平衡。过量的凝血酶形成造成血栓形成。直接凝血酶抑制剂是对强烈直接结合至活性酶中心且阻断纤维蛋白原(天然底 物)脱离活性中心的抑制剂的命名。该阻断中止了凝血酶-催化的纤维蛋白从纤维蛋白原 的转化，且(作为结果)阻止纤维蛋白凝固并减缓或完全阻止血液凝固。因此，为了具有强 烈的抗凝血酶活性，直接凝血酶抑制剂应当与活性凝血酶中心具有最大可能强度的结合。 为此目的，它们应当满足由凝血酶分子的活性中心的结构所指示的几个条件。活性凝血酶中心通常为了便利分为几个穴(cavity)或袋(pocket)，以接受在酰 胺解反应发生点附近的其纤维蛋白原底物的不同氨基酸。袋S1为一个深且窄的穴，其具有 由憎水性氨基酸残基和负电荷源形成的壁，且该负电荷源事实上在该穴的底部并在氨基酸 Asp 189的羧基基团存在下产生。袋S1起到将纤维蛋白原中的主要氨基酸残基(赖氨酸或 精氨酸)直接结合至肽键断裂点(在赖氨酸或精氨酸的C-端)的作用。该主要氨基酸的 长直链烃残基延伸了袋S1的全长，而在烃残基末端的正电荷主要片段对袋S1底部的负电 荷天冬氨酸残基形成了盐桥。因此，袋S1对于鉴定纤维蛋白原的多肽链中的主要氨基酸残 基是最适宜的。另一个袋S2，通过非极性氨基酸残基形成，紧邻着袋S1，且起到鉴定纤维蛋白原 的氨基酸序列中在袋S1接收的主要氨基酸后(在主要氨基酸的N-端)的次要憎水性氨基 酸(缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)的作用。袋S2具有比袋S1稍微较小的容积，且其并不含 有任何带电氨基酸基团。因此，袋S2对于结合非极性脂肪氨基酸的小型烃残基是理想适宜 的。发现另一个袋S3在凝血酶表面上与袋S2相接。其也是憎水性袋，但是其具有相 当大的容积且不是精确限定的，因为其相当大的一部分为开放的，且直接暴露于溶剂。袋S3 起到了接收纤维蛋白原的大型脂肪和芳香憎水性氨基酸片段的作用，其中该片段在肽链中 距离断裂处两至三个单元(link)。直接凝血酶抑制剂必须以优化的方式填充于凝血酶分子的活性中心的这三个袋 中。例如，公知的三肽抑制剂D-Phe-Pro-Arg通过X-射线结构分析发现与活性凝血酶中心 反应如下精氨酸残基填充袋S1，脯氨酸残基占据袋S2，和D-苯丙氨酸占据袋S3。在目前临床实践中使用以控制血栓形成的药物通常并不适于抑制血液中已经形 成的过量的凝血酶。医生倾向于自由地使用间接凝血酶抑制剂，如未分级的肝素和低分子 量肝素，和维生素K拮抗剂(华法林(warfarin))。所有的这些药物本身并不能抑制在系 统中累积的过量凝血酶。各种肝素仅加速了存在于血浆中的天然凝血酶抑制剂-抗凝血酶 III (AT III)-的抑制作用，且因此如果患者血浆中的AT III含量出于这种或那种原因非常 低时，肝素仅具有弱的抗凝血作用，。维生素K拮抗剂通过抑制肝中凝血因子的前体的合成
6而降低凝固速率。明显地，这为相对较慢的选择，其在需要快速抑制血液中存在的凝血酶的 紧急情况下不能提供帮助。间接凝血药治疗的限制已经导致了药物公司意欲开发强效的且具选择性的直接 凝血酶抑制剂。当目前为止，大量的此类凝血酶抑制剂已经被开发出来。然而，它们中的大 部分并没有显示出药物所需的所有性质。继续进行研究以改善它们的药理学性质如有效时 间、低毒性、水中的溶解度、口服生物利用度等。理想的凝血酶抑制剂还必须对固定于血块 中的凝血酶有效。其必须对凝血酶具有选择性，而不抑制血纤蛋白溶解中涉及的蛋白酶，在 血液中保持很长时间，在肝中抵抗酶和细胞色素P450的作用，保持于水性介质中，对于血 液蛋白结合免疫(或仅稍微结合)，且为无毒的。然而，对化合物的初步测试对于其满足这 些要求中的合适性而言是非决定性的。尽管大量有效的低分子量凝血酶抑制剂已经被合成 了，但是在今天使用的仅有一个(阿加曲班，合成于日本)(U.S.专利5，214，052，1993)，其 已经通过了所有必须的临床测试。然而，其并不是理想的抑制剂，因为其在溶液中具有低溶 解度(其血浆中T1/2为36分钟)。这意味着对于开发新的有效且安全合成凝血酶抑制剂仍 然存在着挑战。目前可得到的公开的专利和科学研究描述了大量的凝血酶抑制剂。这些文献总结 如下U.S.专利申请 2006/0014699 (Astra Zeneca AB) ,2006,和 U. S.专利 5，795，896 (Astra Aktiebolag)，1998，描述了包含美拉加群抑制剂的抗凝血药物化合物。现有技术中也已知吡咯烷凝血酶抑制剂(其描述于U. S.专利5，510，369 (Merck & Co)，1996中)和吡啶凝血酶抑制剂(如描述于U. S.专利5，792，779 (Merck & Co)，1998 中的那些)。本申请人已经研究了许多科技文献和著作，其含有关于已有抑制剂的结构以及抑 制剂和凝血酶分子之间的反应机理的信息。研究的文献，如表1中所显示，事实上包括已知 为凝血酶抑制剂的所有种类的化合物。表1中所列的文献已经相当足够了(即使不使全部 的话)。由于我们开发了自己的凝血酶抑制剂，我们故意避开了这些文献中描述的结构。我 们引用的文献并不含有具有我们作为发明所要求保护的新化合物的机构特征的凝血酶抑 制剂的信息。本发明的实际目标为开发能够作为直接凝血酶抑制剂的新化合物。这些抑制剂可 用于治疗在各种病理学影响下的有机体中发展的急性血栓性病症。有机体大量的不同的病 理学病症涉及止血体系的病症。作为疾病如心肌梗死、中风、深静脉或肺动脉的血栓形成的 的结果而出现的血栓栓塞性病症为全世界死亡的主要原因。并不令人惊讶的发现，进行了 多年研究努力以开发能够用作有效安全临床药物的药品。这些药物主要为具有抗凝血性质 的抗凝血药物。除非另有说明，在本说明书中使用下列定义活性中心为蛋白质大分子在生化反应中起着关键作用的区域。蛋白质是指蛋白质大分子。目标蛋白质是指在结合过程中涉及的蛋白质大分子。配体是指低分子量化学结构的集合。结合过程是指配体和目标蛋白质的活性中心之间形成范德华力或共价络合
7(complex)0筛选是指在一组化学结构的化合物中鉴定与蛋白质大分子的特定区域选择性反 应的化合物。校正定位(Correct positioning)是指将配体置于相应于配体-蛋白络合物的最 小自由能的位置。选择性配体是指以特异性方式结合至具体目标蛋白的配体。有效性(Validation)是指一系列计算和比较方法学以评估操作系统的质量和其 在从随机组的配体中选择可靠结合至所给目标蛋白的配体中的效力。参照蛋白是指用于调节模型计算(评分)参数以符合实验数据的蛋白，或在操作 系统有效性期间，或以评价具体抑制剂的特异性结合。特异性结合配体是指仅结合至特定蛋白而不结合至其他蛋白的配体。抑制剂是指结合至具体目标蛋白的活性中心且阻止生化反应的正常进行的配体。对接(Docking)是指在蛋白的活性中心定位配体。分数(Scoring)是指估算结合配体至蛋白所需的自由能的计算。A G结合是指结合配体至目标蛋白所需的最终自由能计算增益(freeenergy calculation gain)(使用 SOL 软件)。(V6烷基是指具有1-6个碳原子的包括直链或支链烃链的烷基，例如，甲基、乙基、 正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。(V6烷氧基是指具有1-6个碳原子的包括直链或支链烃链的烷氧基，例如，甲氧 基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基等。卤素是指氯、溴、碘或氟。可药用盐是指由式(I)活性化合物形成的任何盐，除了为有毒的或抑制活性化合 物的吸收和药效的盐。此类盐可通过式(I)化合物和有机碱或无机碱之间的反应来制备， 如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、甲胺、乙胺等。溶剂合物是指式(I)的活性化合物的结晶形式，其晶格包含该式(I)活性化合物 从其中结晶的水或其他溶剂的分子。可药用载体是指必须与组合物的其他成分相容的且对于接受者无害的载体，亦 即，以对细胞或哺乳动物无毒的剂量和浓度使用。通常，可药用载体为水性PH缓冲溶液。 生理学上可接受的载体的实例包括缓冲液如基于磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸的盐的溶 液；抗氧化剂，包括抗坏血酸、低分子量的多肽(小于10个残基)；蛋白质，如血清白蛋白、 明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天 冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖，和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯 合剂，如EDTA ；和糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇。治疗有效量是指在哺乳动物有机体中达到所需凝血酶抑制程度需要的量。哺乳动物，在本文中所使用的意义，包括灵长类动物(例如，人类、类人猿、非_类 人猿，和低等猴类)，食肉动物(例如，猫、犬和熊)，啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠和松鼠)， 食虫动物(例如，駒鼯和鼹鼠)等等。发明人所设定的实际目标通过开发通式(I)化合物包括其可药用盐或溶剂合物 而达到
8
A-B-C (I)其中C选自下列结构 其中礼、R2、R3和R4彼此独立地为氢或C^烷基；B为-(CH2)n-，其中n为1至5的整数；和A选自下列结构
其中 R5 选自氢、Ch-烷氧基、CH2NR10Rn 和 CH(CH3)NR10Rn,
Ar
其中R6和R7彼此独立地为氢、C^e烷基、(V6烷氧基或卤素； R8为氢或Cm烷基； R9选自下列基团
Rl2
I
zN\ Z Ar /s；
/\ o o
r12
Ar'
O
R10和R12彼此独立地选自氢、。烷基、(CH2)mC00R13和(CH2)mC0N(R丄，
CN 101861304 A
说 明 书5/45页
o、
r7vvv
5
v/
,R8
I
/
N
O
,R7
Re \
Rs
10 其中m为1至4的整数，R13为氢或Ch烷基，Rn 为 Ch 烷基或 Ar ；Ar为苯基、吡啶基、噁唑基、噻唑基、噻吩基、呋喃基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、吲哚 基、苯并呋喃基或苯并噻吩基，其具有1-5个选自下列的取代基氢、Ch烷基、CH 烷氧基、卤素、N(R13)2、OH、N02、CN、C00R13、C0N(R13)2 禾口 S02R13。所述通式⑴化合物中排除从该列表排除的化合物是已知的，具体而言，4-氨基-1-[3-[(2_甲基苯基)氨 基]-3-氧代丙基]吡啶鐺氯化物描述于Journal of Medicinal Chemistry, 17 (7), 739-744,1974,题目为“Carbocyclic Derivatives Related to Indoramin” ；4_ 氨 基-l-(2-苯氧基乙基)-吡啶鐺氯化物描述于Journal of Organic Chemistry, 26, 2740-7,1961,题目为"Application of Sodium Borohydride Reduction toSynthesis of Substituted Aminopiperidines, Aminmopiperazines, AminopyridinesAnd Hydrazines，，。 但是，应当注意，这些来源并没有指出这些化合物用作凝血酶抑制剂的可能性。本发明的优选实施方案描述了下列的权利要求1的化合物，和它们的可药用盐或 溶剂合物
接基也位于袋S3中。从结合至活性凝血酶中心的角度来看，该连接基可表示为亲水性和憎 水性分子基团，但需要其通过选择憎水连接基从而作为整体来部分地平衡抑制剂的憎水性 质，以对抑制剂分子给出有利的药物代谢动力学性质。同样出于该目的，位于袋S3中的憎 水性片段可使用位于该袋中的在暴露于溶剂一侧的憎水性残基来修饰。本文中描述的凝血 酶抑制剂完全满足上述要求。本权利要求通过本发明的凝血酶抑制剂对活性凝血酶中心的选择性定位(对接) 按照下述程序来证明。对接受到抑制剂分子的总能量的全局最小化的影响。总抑制剂能量 由抑制剂结合至活性凝血酶中心的对应构象中的抑制剂的内部张力能量和处于凝血酶区 域的抑制剂能量所构成。反过来，凝血酶区域引起与抑制剂分子的静电、范德华力反应，且 许多反应由凝血酶分子和配体的单独部分的溶剂化和脱溶剂化反应而引发。这些反应已经 描述于很多文献中，且对于本领域的技术人员而言是熟悉的。使用遗传算法重复多次进行 全局最小化。最小化程序得到凝血酶抑制剂在该酶的活性中心的空间位置和功能分数值， 该值用于估计形成本文所述的凝血酶抑制剂和凝血酶分子的络合物的自由能。对于本文描 述的抑制剂，功能分数通常小于-5kCal/mol，这与在小分子范围和下面的抑制常数所一致。 利用功能分数预测的可靠性可通过本领域技术人员已知的各种方法来测试。尤其是，所谓 的凝血酶抑制剂增强系数(表明在随机分子中已知的活性凝血酶抑制剂的选择性)基于功 能分数值等于0. 85，这充分证明了预测的可靠性。本文中描述的抑制剂的几何位置通过前 述的对接程序获得，且也满足对于凝血酶抑制剂结合至活性凝血酶中心的优化条件，其中 它们的内在抑制活性由凝血酶催化的纤维蛋白原酰胺解反应来显示。所要求保护的化合物可通过对于有机化学领域的技术人员而言已知的常用方法 而获得。生物体的许多各种病理学病症涉及在止血系统中发展的病症。在此类病症如心肌 梗死、中风、深静脉或肺动脉的血栓形成中出现的血栓栓塞性病症为世界范围的主要的死 亡的原因。本发明也包括药物组合物，其用于治疗和预防凝血酶-相关的血栓栓塞性事件， 其包含治疗有效量的权利要求1的化合物或其可药用盐或溶剂合物，和可药用载体。本发明的化合物可以以它们的生物累积于血液中的任何适宜的方式给药。这可通 过肠胃外给药方法得到，包括静脉内、肌内、经皮、皮下和腹膜内注射。也可以使用其他的给 药方法，如经由口服施用适宜的组合物通过胃肠道吸收。口服施用由于其使用容易而优选。 或者，药物可通过阴道和直肠肌肉组织给药。此外，本发明的化合物可以通过皮肤注射(例 如，透皮)或通过吸入给药。应当理解，优选的给药方法取决于患者的病症、年龄和易感性。对于口服施用，药物组合物可以封装为(例如)片剂或胶囊，还含有可药用添加 剂，如粘合剂(例如，胶溶玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羟基丙基甲基纤维素)。填料(例 如，乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙；硬脂酸镁、滑石或二氧化硅；马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸 钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。片剂可以为包衣的。液体口服组合物可以以下列 形式制备，例如，溶液、糖浆或悬浮液。此类液体组合物通过通常方法利用可药用添加剂，如 助悬剂(例如，纤维素衍生物)；乳化剂(例如，卵磷脂)，稀释剂(纯化的植物油)；和防腐 剂(例如，甲基或丙基-n-羟基苯甲酸酯或山梨酸)而得到。组合物也可含有适宜的缓冲 盐、调味剂、色素和甜味剂。
在这些组合物中的活性成分的含量介于0. 至99. 9%组合物重量之间，优选为 5%至 90%。这些凝血酶抑制剂的毒性使用标准药物规则在实验室动物中测量LD5(I(50%数量 的致死剂量)来确定。对于本发明的优选化合物，LD5(I剂量为超过367mg/kg，这与临床测试 后阿加曲班的致死剂量相一致，阿加曲班的LD5Q = 475mg/kg。为了更好地理解本发明的主题，下面为一些实施例，其示例性地说明新化合物的 合成，以及用于它们合成的中间体产物的原料，还有用于研究本发明所要求保护的新化合 物的抗凝血活性的方法的说明。实施例仅为示例性的，且本发明的思想并不限于下面所给出的实施例的范围。实施例1
中间体产物3-(3-氯丙氧基)-5-甲基苯酚的合成 将3. 8g(27mmol)的二羟基甲苯(orcin)水合物、4. 8g(30mmol)的 1-溴-3-氯丙 烷，和4.0g(29mmol)的碳酸钾的混合物于30ml乙腈中在搅拌下沸腾36小时。然后蒸发反 应混合物，溶于30ml乙醚中，用15ml饱和碳酸钾溶液洗涤两次，弃去水层，乙醚层用15ml 的10%氢氧化钠溶液萃取3次。弃去乙醚层，水层小心地用浓HC1酸化，然后用15ml乙醚 萃取3次。合并乙醚萃取物，用少量的饱和碳酸氢钠溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥，用约 1/3份(体积)的己烷稀释，并通过硅胶层过滤。蒸发得到1.7g黄色油状物，为约70%二 羟基甲苯(RfO. 10)和约30% 3-(2-氯丙氧基)-5-甲基苯酚(RfO. 26，产量约1. 2g(22%纯 度))的混合物。类似方法用于制备3-(2-氯乙氧基)-5-甲基苯酚(Rf 0.26，产率约1. lg(20%纯 度))，从二羟基甲苯水合物和1-溴-2-氯乙烷，以及3- (4-氯丁氧基)-5-甲基苯酚从二羟 基甲苯水合物和1-溴-4-氯丁烷得到。实施例2中间体产物苯磺酸的3-(3-氯丙氧基)-5-甲基苯基酯的合成 将3g(17mmol)苯磺酰氯和2g(20mmol)三乙胺加至1. 6g前述实施例混合物于 30ml无水四氢呋喃(THF)中的溶液中。将该混合物搅拌7小时，将沉淀三乙基氯化铵过滤出，并蒸发。将得到的油状物溶于20ml乙醚中，并在10ml的10-12%氨水溶液中洗涤几 次，以分离过量的未反应的苯磺酰氯(通过薄层层析(TLC)控制)，然后用10ml约20%的 盐酸洗涤。用无水硫酸钠干燥，并蒸发，得到1.94g黄色油状物，其含有约等量的苯磺酸的 3_(3_氯丙氧基)-5_甲基苯基酯(Rf 0.36)和二羟基甲苯的二苯甲酰磺酸酯(Rf 0.25) (根据TLC)。类似地，3_(2_氯乙氧基)_5_甲基苯酚，3_(3_氯丙氧基)_5_甲基苯酚，和 3_(4_氯丁氧基)-5_甲基苯酚和适宜的芳基磺酰氯得到2-氯苯磺酸的3-(3-氯丙氧基)-5-甲基苯基酯(77%纯度)2-氟苯磺酸的3- (3-氯丙氧基)-5-甲基苯基酯(88% )2-甲酯基苯磺酸的3_(3_氯丙氧基)_5_甲基苯基酯(56% )苯磺酸的3_(2_氯乙氧基)_5_甲基苯基酯(72%)2-氯苯磺酸的3-(2-氯乙氧基)-5-甲基苯基酯(35% )2-氟苯磺酸的3-(2-氯乙氧基)-5-甲基苯基酯(34% )2-甲酯基苯磺酸的3_(2_氯乙氧基)_5_甲基苯基酯(37% )苯磺酸的3-(4-氯丁氧基)-5-甲基苯基酯(45% )2-氯苯磺酸的3-(4-氯丁氧基)-5-甲基苯基酯(27% )2-氟苯磺酸的3_(4_氯丁氧基)_5_甲基苯基酯(32% )2-甲酯基苯磺酸的3-(4-氯丁氧基)-5-甲基苯基酯(21%).实施例3中间体产物2-氯苯磺酸的3_(3_碘丙氧基)_5_甲基苯基酯的合成
下文简称为ClPhO-3-I将2g(13mmol)经煅烧的碘化钠加至于30ml无水丙酮中的2. 6g混合物(含有 2-氯苯磺酸的3-(3-氯丙氧基)-5-甲基苯基酯，类似于上面实施例制备)，并煮沸48小 时。然后使用10ml己烷稀释反应混合物，并蒸发。得到2. 45g亮黄色油状物，其含有苯磺酸 的3-(2-碘乙氧基)-5-甲基苯基酯(RfO. 35)和相应的二羟基甲苯的二苯甲酰磺酸酯(Rf 0. 25)。类似技术用于将适宜的氯化物制备为苯磺酸的3_(3_碘丙氧基)_5_甲基苯基酯2-氟苯磺酸的3_(3_碘丙氧基)_5_甲基苯基酯2-甲酯基苯磺酸的3_(3_碘丙氧基)_5_甲基苯基酯苯磺酸的3_(2_碘乙氧基)_5_甲基苯基酯 2-氯苯磺酸的3-(2_碘乙氧基)-5_甲基苯基酯2-氟苯磺酸的3_(2_碘乙氧基)_5_甲基苯基酯2-甲酯基苯磺酸的3_(2_碘乙氧基)_5_甲基苯基酯苯磺酸的3-(4-碘丁氧基)-5-甲基苯基酯2-氯苯磺酸的3-(4-碘丁氧基)-5-甲基苯基酯2-氟苯磺酸的3-(4-碘丁氧基)-5-甲基苯基酯2-甲酯基苯磺酸的3-(4-碘丁氧基)-5-甲基苯基酯实施例44-氨基-1-(3-(3-甲基-5-(2-氯苯磺酰基氧基)苯氧基)丙基)_吡啶鐺碘化物 (HC_023s_I0C)的合成 将0. 55g的“粗碘化物”(来源于前面实施例)(计算为70 %活性物质)和 0. 08g(0. 85mmol)的4-氨基吡啶于10ml无水二噁烷中的混合物煮沸20小时。将混合物冷 却后，将溶液蒸发，并将得到的油状物用几批乙醚研磨直到其变为固体。将固体沉淀过滤， 并从二噁烷和乙腈的混合物(5 1)重结晶两次，将盐沉淀物滤出，并用乙醚洗涤。真空下干燥，得到0.35g(65%)白色盐。NMR ^(Bruker DRX500，500MHz，DMS0_d6， m. d.，J Hz) :2. 21s, 3H ；3. 91t，2H，J = 5. 49 ；2. 18m, 2H, J = 6. 10 ；4. 26t，2H，J = 6. 71 ；
6.40s, 1H, 6. 50s, 1H, 6. 68s, 1H ；7. 59t, 1H, J = 7. 94，7. 83t, 1H, J = 7. 94，7. 87d, 1H, J =
7.93，7. 95d, 1H, J = 7. 93 ；6. 80d, 2H, J = 6. 72,8. lid, 2H, J = 6. 72 ；8. 07s, 2H。类似技术用于将适宜的碘化物和杂环化合物、硫脲和硫脲衍生物制备为4-氨基-l-(3_(3-甲基_5-(苯磺酰基氧基)苯氧基)丙基)_吡啶鐺碘化物 (HC_016s_I0C)产率78%。NMR ^(Bruker DRX500, 500MHz, DMS0_d6，m. d.，J Hz) :2. 20s, 3H ；3. 88t，2H，J = 5. 50 ；2. 16m，2H，J = 6. 11 ；4. 25t，2H，J = 6. 71 ；6. 31s, 1H，6. 44s, 1H，6. 66s, 1H ；7. 68t，2H，J = 7. 94，7. 82t, 1H, J = 7. 94，7. 87d, 2H, J = 7. 32 ；6. 81d, 2H, J = 6. 72,8. 17d, 2H, J = 6. 72 ；8. 09s，2H。2-氨基-l-(3_(3-甲基-5_(苯磺酰基氧基)苯氧基)丙基)_噻唑鐺碘化物 (HC_017s_I0C) 产率65%。NMR (Bruker DRX500，500MHz，DMS0_d6，m. d.，J Hz) 2. 21 s，3H ； 3. 93t，2H，J = 6. 11 ；2. llm，2H，J = 6. 10 ；4. 15t，2H，J = 6. 71 ；6. 35s, 1H，6. 44s, 1H，6. 68s, 1H ；7. 69t，2H， J = 7. 33,7. 84t, 1H, J = 7. 32,7. 88d, 2H, J = 7. 93 ；7. 02d, 1H, J = 4. 27,7. 42d, 1H, J = 4. 27 ；9. 42s，2H。3- (3-甲基-5-(苯磺酰基氧基)苯氧基)丙基-异硫脲鐺碘化物(HC_018s_I0C) 产率80%。NMR ^(Bruker DRX500, 500MHz, DMS0_d6，m. d.，J Hz) :2. 21s, 3H ；3. 95t，2H，J = 6. 10 ；2. 00m, 2H, J = 6. 71 ；3. 25t, 2H, J = 7. 32 ；6. 40s, 1H, 6. 25s, 1H, 6. 74s, 1H ；7. 69t, 2H, J = 7. 94，7. 84t, 1H, J = 7. 93,7. 89d, 2H, J = 7. 33 ；9. 03s，4H。4-氨基-l-(2_(3-甲基-5_(苯磺酰基氧基)苯氧基)乙基)_吡啶鐺碘化物 (HC_019s_I0C) 产率60%。NMR 屯(Bruker DRX500, 500MHz, DMS0_d6，m. d.，J Hz) :2. 20s, 3H ；4. 24t，2H，J =
174. 88 ；4. 48t, 2H, J = 4. 89 ；6. 39s, 1H, 6. 45s, 1H, 6. 73s, 1H, ；7. 68t, 2H, J = 7. 93,7. 82t, 1H, J = 7. 93,7. 87d, 2H, J = 7. 32 ；6. 82d, 2H, J = 7. 32,8. 18d, 2H, J = 7. 33 ；8. 14s, 2H。2- (3-甲基-5-(苯磺酰基氧基)苯氧基)乙基-异硫脲鐺碘化物(HC_020s_I0C) 产率45%。NMR ^(Bruker DRX500, 500MHz, DMS0_d6，m. d.，J Hz) :2. 22s, 3H ；4. llt，2H，J = 5. 49 ；3. 54t, 2H, J = 5. 49 ；6. 41s, 1H, 6. 48s, 1H, 6. 76s, 1H ；7. 69t, 2H, J = 7. 93,7. 84t, 1H, J = 7. 93，7. 89d，2H，J = 7. 32 ；9. 10s，4H。2- (3-甲基-5- (2-氯苯磺酰基氧基)苯氧基)乙基_异硫脲鐺碘化物(HC_024s_ IOC) 产率53%。NMR ^(Bruker DRX500, 500MHz, DMS0_d6，m. d.，J Hz) :2. 21s, 3H ；3. 95t，2H，J = 5. 50 ；2. 12m，2H，J = 5. 50 ；4. 15t，2H，J = 6. 10 ；6. 42t, 1H，6. 51s, 1H，6. 70s, 1H ；7. 59t, 1H, J = 7. 32,7. 83t, 1H, J = 7. 94，7. 88d, 1H, J = 7. 94，7. 95d, 1H, J = 7. 94 ；7. Old, 1H, J = 4. 27，7. 42d, 1H, J = 4. 27 ；9. 39s, 2H。3-(3-甲基-5-(2-氯苯磺酰基氧基)苯氧基)丙基-异硫脲鐺碘化物(HC_026s_ IOC) 产率55%。NMR ^(Bruker DRX500，500MHz，DMS0_d6，m. d.，J Hz) :2. 22s, 3H ；3. 97t,2H, J =
6.10 ；2.01m，2H，J = 7. 33，J = 6. 10 ；4. 26t，2H，J = 7. 33 ；6. 47s, 1H, 6. 51s, 1H, 6. 75s, 1H ；
7.60t, 1H, J = 7. 93,7. 84t, 1H, J = 7. 94，7. 88d, 1H, J = 7. 93,7. 96d, 1H, J = 7. 94 ；8. 95s, 2H，9. 07s，2H。4-氨基_l-(2-(3-甲基-5-(2-氯苯磺酰基氧基)苯氧基)乙基)_吡啶鐺碘化物 (HC_025s_I0O 产率58%。NMR ^(Bruker DRX500, 500MHz, DMS0_d6，m. d.，J Hz) :2. 20s, 3H ；4. 26t，2H，J = 4. 88 ；4. 49t, 2H, J = 4. 88 ；6. 45s, 1H，6. 51s，1H, 6. 74s, 1H ；7. 58t, 1H, J = 7. 93,7. 84t, 1H, J = 7. 94，7. 88d, 1H, J = 7. 93,7. 94d, 1H, J = 7. 94 ；6. 82d, 2H, J = 7. 32,8. 18d, 2H，J = 7. 33 ；8. 14s，2H。以类似方式，通过描述于实施例1-4中的技术，从各种芳基苯磺酰氯和杂环苯磺 酰氯。合成化合物的化学式、质谱参数和计算的功能评分显示在表2中。化合物能够以碘 化物、溴化物、氯化物或其他盐的形式得到。实施例5化合物的的合成 1. 4-氯-3-硝基苯-1-磺酰氯将邻-硝基氯苯胺(15g)在搅拌下加至30ml氯磺酸中，并在100°C加热2小时， 接着在110°C加热2小时，在127°C加热5小时。将反应混合物冷却至室温，并倾倒至碎冰 (140g)中。将沉淀过滤；滤饼用冰水淋洗，并在空气中干燥。得到15g的4-氯-3-硝基 苯-1磺酰氯。
2. 4-氯-N-甲基-3-硝基-N-苯基苯磺酰胺 将4-氯-3-硝基苯-1-磺酰氯(10. 6g,0. 041mol)溶于甲苯(50ml)中；然后加入 三乙胺(4. 14g，0. 041mol)。向得到的溶液中，在搅拌下加入N-甲基苯胺(4. 4g，0. 041mol)。 反应混合物在70-80°C进行1小时。此后，将其冷却。冷却的溶液用30ml水洗涤两次，并 真空浓缩。残余物从乙醇中重结晶。4-氯-N-甲基-3-硝基-N-苯基苯磺酰胺的产量为 9. 4g(61% )。3. N-甲基-4-(甲基氨基)-3-硝基-N-苯基苯磺酰胺 将4-氯-N-甲基-3-硝基-N-苯基苯磺酰胺(9. 4g，0. 029mol)于乙醇(50ml)中的 溶液与25ml的40%甲胺水溶液混合。将反应混合物加热至70°C，并在此温度搅拌1小时。 冷却并过滤后，滤饼用乙醇洗涤，并在60°C干燥。N-甲基-4-(甲基氨基)-3_硝基-N-苯 基苯磺酰胺的产量为9. 0g(97% )。4. 3-氨基-N-甲基-4-(甲基氨基)-N-苯基苯磺酰胺 将N-甲基_4-(甲基氨基)-3-硝基-N-苯基苯磺酰胺(9g，0.028mol)溶于异丙 醇(90ml)中。向该溶液中，加入胼水合物(11ml)，活性炭(2g)，和FeCl3 6H20(0.5g，于 10ml乙醇中)。将反应混合物沸腾8小时。活性炭通过过滤除去。将滤液蒸发至干。3-氨 基-N-甲基-4-(甲基氨基)-N-苯基苯磺酰胺的产量为8. lg(99% )。5.3-氯-N-(5-(N-甲基-N-苯基氨磺酰基)-2-(甲基氨基)苯基)丙酰胺 向在冰上冷却( 5°C )的3-氨基-N-甲基_4-(甲基氨基)-N-苯基苯磺酰胺 (5. 4g，0. 018mol)和三乙胺(1. 81g，0. 018mol)于二甲基甲酰胺(16ml)中的溶液中，加入氯 丙酰氯(2. 32g，0.018mol)。反应在室温搅拌5小时。此时，加入水(14ml)和乙腈(5ml)， 持续5小时。形成的沉淀过滤。3-氯-N-(5-(N-甲基-N-苯基氨磺酰基)-2-(甲基氨基) 苯基)丙酰胺的产量为3. lg(45%)。6. 4-氨基-1-(3-(5-(N-甲基_N_苯基氨磺酰基)_2_ (甲基氨基)苯基氨 基)-3-氧代丙基)吡啶鐺氯化物 将3-氯-N-(5_(N-甲基-N-苯基氨磺酰基)_2_(甲基氨基)苯基)丙酰胺(lg， 0. 0026mol)和4-氨基吡啶鐺(0. 73g,0. 0078mol)在无水丙酮(50ml)中沸腾50小时。将 残余物过滤，并从10 1的乙腈与乙醇的混合物中进行结晶。4-氨基-1- (3- (5- (N-甲基-N-苯基氨磺酰基)_2_ (甲基氨基)苯基氨基)_3_氧 代丙基)吡啶鐺氯化物的产量为0. 54g(43% )。7.4-氨基-1-(2_(1-甲基-5_(N-甲基_N_苯基氨磺酰基)-1H_苯并[d]咪 唑-2-基)乙基)吡啶鐺氯化物 向4-氨基-l-(3-(5_(N-甲基-N-苯基氨磺酰基)-2_(甲基氨基)苯基氨 基)_3_氧代丙基)吡啶鐺氯化物(0.2g，0.00042mol)于乙腈(8ml)中的溶液中，加入亚硫酰氯(0. 2ml)。反应混合物沸腾10分钟后，将其在室温室温静置24小时，然后用乙醚 (8ml)稀释。形成的沉淀通过过滤收集，并从10 1的乙腈与无水乙醇的混合物结晶。4-氨 基-l-(2-(l-甲基-5-(N-甲基-N-苯基氨磺酰基)-lH-苯并[d]咪唑-2-基)乙基)吡 啶鐺氯化物的产量为0. 055g(26% )。以类似的方式，通过描述于实施例5中的技术，合成多种化合物，其化学式、质谱 参数和计算的功能评分显示在表3中。化合物能够以碘化物、溴化物、氯化物或其他盐的形 式得到。实施例6测试化合物对凝血酶活性的作用的研究合成的物质对凝血酶活性的作用通过下列方法研究测量凝血酶在水性缓冲 液中水解特异低分子量底物的速率(在上述化合物存在或不存在的情况下)。这些底 物之一为发色底物 Chromozim TH(CTH) :N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Arg-pNA[Sonder SA, Fenton Jff 2nd. ThrombinSpecificity with Tripeptide Chromogenic Substrates Comparison of Human andBovine Thromibins with and without Fibrinogen Clotting Activities. Clin. Chem.，1986，32 (6) =934-937] 在许多实验中使用的另一底物为荧光底 物BOC-Ala-Pro-Arg-AMC(S)，其中B0C为丁氧基羰基基团，和AMC为7-氨基-4-甲基香豆 基[Kawabata S, Miura T, Morita T,Kato H, Fujikawa K,IvanagaS,Takada K,Kimura T, Sakakibara S. Highly Sensitivepeptide-4-methylcoumaryl-7-amide Substrates for Blood-Clotting Proteases andTrypsin. Eur. J. Biochem. ,1988,172(1) : 17—25]。将普通96-孔板的各孔填充有缓冲液(其含有140mM的NaCl，20mM的HEPES，和 0. 聚乙二醇(Mw = 6000), pH = 8. 0)。加入底物(孔中最终浓度为lOOmcM)、凝血酶(最 终浓度为190pM)和不同浓度的测试化合物(建议的凝血酶抑制剂)(0. 002mM至3. 3mM)。 当使用发光底物时，在分光光度计Molecular Devices板读数器(Thermomax，U.S.)上跟 踪有色反应产物_对硝基苯胺_的累积，在405nm波长测量吸光度的增加。在荧光底物的 情况下，凝血酶从荧光底物分裂出氨基甲基香豆基，在水解期间以游离形式显著地发荧光 (激发入_380nm和发射入_440nm)。反应动力学记录在荧光TitertekFluoroskan板读数 器(LabSystem, Finland)上。初始反应速率测量为动力学曲线倾角对直线部分的斜率(从记录的10至15分 钟)。假定没有抑制剂的反应速率为100%。两次独立实验的算术平均值用作最终结果。

图1显示的为对于发光底物Chromozim TH(CTH)在凝血酶的作用下的特征动力学 水解曲线的实例，在不同浓度化合物HC-019S-I0C(参见表4)存在下。没有抑制剂的动力 学水解曲线用作对照。图2显示CTH水解抑制程度和体系中另一新合成化合物(HC-018S-I0C)(其为高 度有效的凝血酶抑制剂(参见表4))的浓度之间的关系。大量新合成化合物对凝血酶活性的抑制作用程度的数据显示在表4中。因此，如上得到的结果显示所有新合成的化合物为直接凝血酶抑制剂。不同的化 合物抑制程度不同，但是大多数的新化合物为高度有效的凝血酶抑制剂，适于用作用于控 制凝血酶_相关的血栓栓塞性病症药物组合物的基础，且也用于研究。表1 对于多种凝血酶抑制剂的公开的关键文献列表
表3通过实施例5描述的方法合成的凝血酶抑制剂的质谱参数和计算的功能分数 表4在不同浓度系列的新合成化合物存在下，凝血酶底物的水解速率的变化的实例
45
权利要求
通式(I)化合物及其可药用盐或溶剂合物A-B-C(I)其中C选自下列结构其中R1、R2、R3和R4彼此独立地为氢或C1-6烷基；B为-(CH2)n-，其中n为1至5的整数；A选自下列结构其中R5选自氢、C1-6烷氧基、CH2NR10R11和CH(CH3)NR10R11；其中R6和R7独立地为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基和卤素；R8为氢或C1-6烷基；R9选自R10和R12彼此独立地选自氢、C1-6烷基；(CH2)mCOOR13和(CH2)mCON(R13)2，其中m为1至4的整数，R13为氢或C1-6烷基，R11为C1-6烷基或Ar；Ar为苯基、吡啶基、噁唑基、噻唑基、噻吩基、呋喃基、嘧啶基、哒嗪酮基、吡嗪基、吲哚基、苯并呋喃基或苯并噻吩基，其具有1-5个选自下列的取代基氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素、N(R13)2、OH、NO2、CN、COOR13、CON(R13)2和SO2R13；所述通式(I)化合物中排除FPA00001037517500011.tif,FPA00001037517500012.tif,FPA00001037517500021.tif,FPA00001037517500022.tif,FPA00001037517500023.tif,FPA00001037517500031.tif,FPA00001037517500032.tif
2.权利要求1的化合物，及其可药用盐或溶剂合物，尤其为Rn为烷基或Ar ； Ar为苯基、吡啶基、噁唑基、噻唑基、噻吩基、呋喃基、嘧啶基、哒嗪酮基、吡嗪基、吲哚 基、苯并呋喃基或苯并噻吩基，其具有1-5个选自下列的取代基氢、Ch 烷基、CH 烷氧基、卤素、N(R13)2、OH、N02、CN、C00R13、C0N(R13)2 禾口 S02R13 ； 所述通式(I)化合物中排除 其中Y选自氢、卤素、C00R13、C0N(R13)jP S02R13 ；以及 r为2至5的整数。
3.权利要求1的化合物及其可药用盐或溶剂合物，其能够抑制凝血酶。
4.权利要求1的化合物及其可药用盐或溶剂合物的用途，其用作凝血酶抑制剂。
5.药物组合物，其用于治疗和预防凝血酶_相关的血栓栓塞性事件，该组合物包含治 疗有效量的权利要求1的化合物、其可药用盐或溶剂合物、以及可药用载体。
全文摘要
本发明涉及新的化合物、这些化合物作为凝血酶抑制剂的用途，以及基于它们的药物组合物，以及可用于治疗和预防凝血酶-相关的血栓栓塞性事件以及在研究中的用途。
文档编号C07D401/06GK101861304SQ200880104825
公开日2010年10月13日 申请日期2008年6月27日 优先权日2007年6月28日
发明者亚历克西·A·博戈莱伯夫, 亚历克西·N·罗马诺夫, 亚历山大·S·戈巴坦科, 伊里纳·V·格里布科瓦, 埃琳娜·I·西诺里兹, 奥尔加·A·康达科瓦, 安德雷·A·巴蒂林, 尤里·V·库兹涅索夫, 弗拉迪米尔·B·苏利莫夫, 法佐尔·I·阿陶拉卡诺夫 申请人:Bionika有限责任公司