快速清除多肽的生物动力学的制作方法

专利名称：快速清除多肽的生物动力学的制作方法
技术领域：
总体上本发明的领域涉及能与目标结合的多肽。更具体地，本发明的领域涉及显 示有利生物动力学的低分子量结合剂，以及使用此类快速清除结合剂的成像方法。
背景技术：
可使用多种结合剂，例如抗体、亲和体(affibody)、anticalin、适配体，实现与样 品中目标的特异性结合。高分子量结合剂例如抗体不适合某些体内应用(例如成像应用)， 因为其花费很长时间迁移到目标位点，组织穿透性不佳，在对象体内停留很长时间，且主要 通过肝清除，与较小结合剂相比更有可能产生免疫应答。因此，对于某些体内应用，低分子 量、快速清除的结合剂是优选的，因为其快速迁移到目标位点、组织穿透性、以及从体内快 速清除。一种快速清除的结合剂为亲和体，其为一种基于蛋白A的ζ结构域的7kDa多肽。 亲和体均共享一种共同的3螺旋蛋白折叠。使用噬菌体或酵母展示技术将IgG结合表面的 13个氨基酸残基随机化产生抗新目标的亲和体。亲和力成熟的蛋白产生为单个7kDa结构 域(单价亲和体)或者两个串联7kDa结构域(二价亲和体)。因为组织穿透性和低抗原性而特别适合某些体内应用的快速清除结合剂仍然可 能以干扰所需应用的方式从体内清除。例如，通过肝清除可干扰基于肝的成像应用；通过肾 清除放射性同位素标记的结合剂可导致对肾不可接受的放射剂量；或者从血液快速清除可 能需要减速以实现难进入组织的穿透。因此，需要改变快速清除结合剂的生物动力学的方法。此外，需要快速清除的生物 动力学调整的结合剂用于体内成像，其可用于临床前或诊断成像的多种成像模式。

发明内容
本文提供了减少特异性结合目标的快速清除多肽肝摄取的方法，其包含提供一 种特异性结合目标的多肽；以及用酸性氨基酸残基替换至少一个碱性或至少一个中性氨 基酸残基以产生一种修饰多肽，其中所述修饰多肽的等电点低于天然多肽的等电点至少 0. 05-0. IpH 点。在某些实施方案中，所述修饰多肽的血液半衰期与天然多肽的血液半衰期基本相 同，而所述修饰多肽肝摄取与天然多肽相比大大减少。在某些实施方案中，所述多肽主要由包含α螺旋折叠的约60个氨基酸残基或包 含成对α螺旋折叠片段的约120个氨基酸残基组成。替代性地，所述多肽可主要由包含β 桶型折叠的约160个氨基酸残基组成。在所有实施方案中，所述修饰多肽保持对其天然目标的结合亲和力，因此，以未修 饰多肽的至少50%、75%、90%的特异性结合所述目标。在某些实施方案中，所述碱性氨基酸残基选自组氨酸、赖氨酸和精氨酸，所述酸性 氨基酸残基选自天冬氨酸或谷氨酸。所述中性氨基酸残基可选自除组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸之外的任何氨基酸残基，所述酸性氨基酸残基选自天冬氨酸或谷氨 酸，及其衍生物。所述修饰多肽可附加信号发生源，例如放射性、荧光、磁性、射线不透性("mTc或 18F)、冷光、磷光、同位素、或超声不透性信号发生源。可选地或另外地，所述修饰多肽附加靶 向部分。本文还提供了根据所公开的方法生产的多肽，包括主要由SEQ ID号码1-9的氨基 酸残基组成的分离的多肽。还提供了包含本发明的修饰多肽的药用组合物。本文还提供了包含所述修饰多肽和信号发生源的体内成像制剂。本文还提供了在使用结合目标的多肽进行体内成像程序期间降低肝背景噪声的 方法。


图1显示了根据本文教导修饰的5种单体亲和体的血液清除率。保留在血液(在 循环中)中的亲和体总注射量百分比显示于y轴。注射后时间显示于χ轴。数据显示尽管 序列变异，所述亲和体显示出相似的清除率特性。图2显示了 5种单体亲和体的肾和肝清除率。肝(组2A)和肾(组2B)的保留在 每克组织中的亲和体总注射量百分比对注射后耗用的时间作图显示。数据显示大范围的保 留值，显示在所述亲和体组中的序列可变性足以将其导向肝或肾清除。图3显示了肝和肾介导的亲和体清除的相关性。两者反向相关，显示所述亲和体 由肝和肾从血流中去除，在所述亲和体组中的序列变异足以将所述清除以这样或那样的方 式转变。图4显示了肝摄取与等电点的相关性。等电点和注射后2小时观察到的肝保留作 图，并拟合线性回归。所述相关性的r平方值大于0. 98。图5显示了 2种二聚体亲和体的血液清除率。保留在血液(在循环中)中的亲和 体总注射量百分比显示于y轴。注射后时间显示于χ轴。数据显示尽管序列不同，所述亲 和体显示出相似的清除率特性。图6显示了二聚体亲和体的肾和肝清除率。肝(左)和肾(右)的保留在每克组 织中的亲和体总注射量百分比对注射后耗用时间作图显示。数据显示大范围的保留值，显 示在所述亲和体组中的序列可变性足以将其导向肝或肾清除。图7显示了肝摄取与等电点的相关性。等电点和注射后2小时观察到的肝保留证 实使用等电点导向从特定器官的清除是有效的，还可用于指导候选制剂选择或淘汰目的。详细说明在第一方面，本发明提供了一种减少特异性结合目标的多肽体内肝摄取的方法， 其包含(a)提供特异性结合目标的多肽；以及(b)用酸性氨基酸残基替换步骤(a)中天然多肽的至少一个碱性氨基酸残基或至 少一个中性氨基酸残基以产生修饰多肽，其中所述修饰多肽的等电点低于步骤(a)中天然多肽的等电点至少0. 05-0. IpH
点ο
术语“氨基酸”系指天然存在和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸以相似方 式作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸为遗传密码编码的氨基酸，以 及后来修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、0-磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸 酪氨酸。本文定义的氨基酸类别并不互相排斥。因此，具有侧链显示两种或更多种物理-化 学性质的氨基酸可包括在多个类别中。例如，具有芳香基团的氨基酸侧链进一步被极性取 代基取代，例如Tyr (Y)，可同时表现出芳香疏水性和极性或亲水性，因此可包括在芳香和极 性两个类别中。根据本文提供的详细公开，任何氨基酸的适当分类对本领域技术人员是显 而易见的。“酸性氨基酸”系指具有侧链PK值低于7的亲水氨基酸。碱性氨基酸在生理pH 由于酸根的电离通常具有带负电荷的侧链。“碱性氨基酸”系指具有侧链PK值高于7的亲 水氨基酸。碱性氨基酸在生理PH由于与水合氢离子结合通常具有带正电荷的侧链。遗传 编码的碱性氨基酸包括His (H)、Arg (R)和Lys⑷。“中性氨基酸”系指非碱性或非酸性的 氨基酸，并因此在生理条件下实际上是非电离的。酸性、碱性和中性氨基酸的具体示例详见 表2(下面)。“结合目标”系指可被结合物结合的任何制剂。结合目标可包括一种或多种多肽、 蛋白质(例如抗体)、核酸(例如多核苷酸、DNA、RNA、或适配体)；多糖(例如凝集素或糖)、 脂、酶、酶底物、配体、受体、抗原或半抗原。所述目标可包括分离的化学基团或三维结构组 分(例如由肽折叠形成的3D结构)。“结合”系指结合剂优先结合目标的能力，其亲和力比结合除预定目标或密切相关 目标以外的非特异性目标(例如BSA或酪蛋白)的亲和力高至少两倍。本文提供的结合剂 结合其各自目标的亲和力KD值低于约1 X lOl1，更优选地低于约1 X lOl1，最优选地低于 约1Χ108ΜΛ类似地，“特异性结合”系指结合剂结合预定抗原的属性，其亲和力KD值低于 约 1Χ107ΜΛ当用于本文时，短语“血液半衰期”系指当消除为一级或准一级时，一种制剂的血 浆浓度降低一半所需的时间。对于多个衰减阶段，术语“血液半衰期”系指表观半衰期(如 果不同阶段的衰减半衰期相似)，或者显性半衰期(表明总清除)，如果不同半衰期不相似。当用于本文时，术语“荧光团”系指一种化学化合物，其暴露于特定波长的光被激 发时发光(在不同波长)。荧光团可以其发光性质或“颜色”描述。绿色荧光团(例如Cy3、 FITC和俄勒R绿)的特征在于其发光波长通常在515-540纳米范围内。红色荧光团(例 如德州红、Cy5、和4甲基罗丹明)的特征在于其发光波长通常在590-690纳米范围内。荧 光团的示例包括4_乙酰氨基4'-异硫氰酸根合芪_2，2' d 二磺酸，吖啶；吖啶和吖啶异 硫氰酸酯的衍生物；5_(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS) ；4-氨基_N_[3_乙烯基 磺酰基)苯基]萘二酰亚胺-3，5 二磺酸酯(荧光黄VS) ；N-(4-苯胺基1-萘基)马来酰 亚胺；邻氨基苯甲酰胺；亮黄；香豆素；香豆素衍生物；7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素 120) ；7-氨基-三氟甲基香豆素(香豆素151)；焰红染料；4'，6-diaminidino-2-苯基吲 哚(DAPI)、5'，5〃 - 二溴连苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7_ 二乙基氨基-3-(4'-异 硫氰酸根合苯基)4-甲基香豆素；4，4' -二异硫氰酸根合二氢-芪_2，2' -二磺酸、4， 4' -二异硫氰酸根合芪_2，2' -二磺酸、5-[二甲基氨基]萘1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)； 曙红；曙红衍生物例如曙红异硫氰酸酯；赤藓红；赤藓红衍生物例如赤藓红B和赤藓红异硫 氰酸酯；乙啡啶；荧光素及衍生物例如5-羧基荧光素(FAM) ；5-(4，6_ 二氯三嗪2-基)氨基荧光素(DTAF) ;2'，7' -二甲氧基-4' 5' -二氯_6_羧基荧光素(JOE)、荧光素异硫 氰酸酯(FITC) ；QFITC(XRITC)；荧光胺衍生物(与胺反应时放荧光)；IR144 ;IR1446 ；孔雀 石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；正甲酚酞；硝基酪氨酸；碱性副品红；酚红、B-藻红蛋白； ο-邻苯二甲醛衍生物(与胺反应时发荧光)；芘及衍生物例如芘、丁酸芘、和琥珀酰亚胺基 1- 丁酸芘；活性红4(Cibacron. RTM.亮红3B-A)、罗丹明及衍生物例如6-羧基-X-罗丹明 (R0X)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、 罗丹明X异硫氰酸酯、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101和磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物 (德州红)；N，N, N'，N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA) ；4甲基罗丹明、4甲基罗丹明 异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸和镧系元素螯合物的衍生物、量子原子团、花青和方 ■ (squaraines)0当用于本文时，术语“等电点”系指分子不携带净电荷时的pH。等电点可通过实验 确定，或者对于多肽可基于一级序列计算。术语“天然多肽”意为以未修饰形式特异性结合目标的多肽。当用于本文时，术语“顺磁性金属离子”、“顺磁性离子”或“金属离子”系指对磁场 平行或反平行磁化至与该磁场成一定程度的比例的金属离子。通常，这些是具有不成对电 子的金属离子。合适的顺磁性金属离子的示例包括，但不限于，钆III[Gd3+或Gd(III)]、铁 III [Fe3+或Fe (III)]、锰 II [Mn2+或Mn (II)]、钇 III [Yt3+或 Yt (III)]、镝[Dy3+或Dy (III)]、 和铬[Cr(III)或Cr3+]。在某些实施方案中，所述顺磁性离子为镧系元素原子Gd (III)，因 其高磁矩(u2 = 63BM2)、对称性电子基态(S8)、以及目前许可其用于哺乳动物诊断。“序列一致性百分比”意为通过在比较窗中比较两个最佳排列序列所确定的值，其 中对于所述两个序列的最佳排列，所述多核苷酸或多肽序列在比较窗中的部分与参考序列 (其不包含添加、替换或缺失)相比，可包含添加、替换或缺失(即缺口)。所述百分比计算 方法为，确定相同核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中都出现的位点数量以产生匹配位点 的数量，匹配位点数量除以比较窗中位点总数，所得结果乘以100以产生序列一致性百分 比。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”用于本文时描述任何氨基酸链，无论其长度或翻译 后修饰(例如糖基化或磷酸化)。因此，所述术语在本文可互换使用以指代氨基酸残基的聚 合物。所述术语还适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基为相应天然氨基酸的 人工化学模拟物。因此，术语“多肽”包括全长、天然蛋白质，以及重组或合成产生的多肽，其 对应于全长天然蛋白质或天然蛋白质的特定结构域或部分。所述术语还包括成熟蛋白质， 其具有一个添加的氨基末端甲硫氨酸以促进在原核细胞中的表达。本发明的多肽可为化学 合成或通过重组DNA方法合成；或者可按照标准生物化学纯化方法从其天然表达的组织中 纯化。当用于本文时，术语“生理条件”系指哺乳动物体内通常出现的条件。因此，生理 条件意为PH约6. 5到约7. 5，以及温度在约25°C到约37°C的范围内。当用于本文时，术语“放射性核素”通常系指引入对象之后可被放射性检测追踪的 任何原子。代表性的放射性原子包括氟-18、锕-225、铋-212、砷-72、铟-110、铟-111、 铟-113m、镓-67、镓-68、锶-83、锆-89、钌-95、钌-97、钌-103、钌-105、汞-107、汞-203、 铼-186、铼-188、硫-121m、硫 _122m、硫 _125m、铥-165、铥-167、铥-168、锝 _94m、锝 _99m、银-111、钼-197、钯-109、铜-62、铜-64、铜-67、钇-86、钇-90、钪-47、钐-153、镥-177、 铑-105、镨-142、镨-143、铽-161、钬-166、金-199、钴-57、钴-58、铬-51、铁-59、硒-75、 铊-201、或镱-169。术语“anticalin骨架”系指多肽的氨基酸残基，其提供由一个或多个环连接的8 个反平行β链组成的圆柱形β桶的三维结构，以足够容纳具有目标结合环的桶型一端，因 此可结合目标。术语“亲和体骨架”通常系指多肽的氨基酸残基，其提供足够容纳所述多肽的结合 界面氨基酸残基的三维结构，因此可结合目标。以相同拓扑结构(ζ-域3螺旋折叠)维持 结合位点和结合活性的任何序列都基于所述亲和体骨架。术语“基本一致”或“同源”的多种语法形式在肽的语境下表明包含具有所需一致 性序列的肽，例如在特定比较窗中与参考序列有至少80 %、85 %、90 %、或95 %的序列一致 性。当用于本文时，术语“信号发生源”系指使用一种或多种检测技术(例如光谱测 定、量热法、光谱法或肉眼检查)能提供可检测信号的分子。可检测信号的合适示例可包括 光信号、和电信号或放射性信号。用于所述创新方法的信号发生源的示例包括，例如，生色 团、荧光团、Raman活性标签、放射性标记、酶、酶底物、或上述各项的组合。合适的放射性同
氟、溴和碘)同位素以及包括锝、钇、铼和铟的金属也是有用的标记。可用作信号发生源的 优选射电金属包括99mTC、mIn、97RU、67CU、67Ga、68Ga、72AS、89&和2(I1T1。可用作信号发生源的 优选放射卤素包括=123I和131L用于通过正电子成像术(“PET”)体内诊断成像的放射性 同位素包括"C、18F和1241。顺磁性标记可为以金属复合物或金属氧化物颗粒形式存在的金 属离子。合适的顺磁性同位素可包括157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe。当用于本文时，术语“靶向基团”系指在蛋白质-蛋白质复合物中识别并特异性结 合一种或多种蛋白质的化学种类(即，有机分子或生物分子)。在一些实施方案中，所述靶 向基团能结合靠近或邻近短暂反应(例如仅反应数秒或数分钟)部分的蛋白质片段。实施方案本文提供了通过改变等电点调整蛋白质序列的生物动力学以增加或减少体内肝 和/或肾新陈代谢的方法。还提供了已使用本方法改变以表现改善生物动力学的多肽。进 一步提供了使用本文提供的多肽在体内成像的方法(例如临床前成像或诊断成像)。总体上，本文提供的方法使本领域普通技术人员可通过改变多肽的等电点调整多 肽的生物动力学。可用于氨基酸替换的方法包括通过本领域技术人员已知的多种方法诱 变编码所述多肽的cDNA，所述诱变方法包括随机诱变、定点诱变、以及使用易错PCR诱变。 一种向结合界面位点引入随机替换的方法为在所需替换的密码子处使用包含简并引物的 DNA。替代性地，可使用标准合成肽合成技术产生所述多肽。表1 (下面)提供了在多种类型的快速清除结合剂中替换类型的通常指导。变化 列表明对于对应类型的替换等电点转变的方向。
初始替换变化影响
权利要求
一种减少特异性结合目标的多肽体内肝摄取的方法，其包含(a)提供一种特异性结合目标的多肽；以及(b)用酸性氨基酸残基替换步骤(a)中天然多肽的至少一个碱性氨基酸残基或至少一个中性氨基酸残基以产生修饰多肽，且其中所述修饰多肽的等电点低于步骤(a)中天然多肽的等电点至少0.05 0.1pH点。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰多肽以天然多肽的至少50%、75%、或 90%的特异性结合所述目标。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述碱性氨基酸残基选自组氨酸、赖 氨酸和精氨酸，所述酸性氨基酸残基选自天冬氨酸或谷氨酸。
4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其中所述中性氨基酸残基选自除 组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸之外的任何氨基酸残基，且所述酸性残基选自 天冬氨酸或谷氨酸，及其衍生物。
5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述修饰多肽主要由SEQID 号码1-8的氨基酸残基组成。
6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述修饰多肽进一步包含靶 向部分。
7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述修饰多肽进一步包含信 号发生源。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述信号发生源选自放射性、荧光、磁性、射线不 透性、冷光、磷光、同位素、或超声不透性信号发生源。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述信号发生源包含99mTc或18F。
10.一种修饰多肽，如权利要求1到6中任一权利要求所定义。
11.一种药用组合物，其包含根据权利要求10所述的修饰多肽。
12.一种包含所述修饰多肽的诊断成像剂，所述修饰多肽带有如权利要求7到9中任一 权利要求所定义的信号发生源。
13.根据权利要求12所述的诊断成像剂，其作为药用组合物提供。
14.一种目标体内成像的方法，所述方法包含(a)作为成像程序的部分，将根据权利要求12或权利要求13所述的诊断成像剂引入哺 乳动物对象；以及(b)使所述对象成像。
全文摘要
本发明提供了减少特异性结合目标的多肽体内肝摄取的方法，其包含(a)提供一种特异性结合目标的多肽；以及(b)用酸性氨基酸残基替换步骤(a)中天然多肽的至少一个碱性或至少一个中性氨基酸残基以产生一种修饰多肽，其中所述修饰多肽的等电点低于天然多肽的等电点至少0.05-0.1pH点。还提供了使用所述创新方法生产的多肽，以及使用所述方法和制剂的成像技术。
文档编号C07K16/28GK101952314SQ200880127378
公开日2011年1月19日 申请日期2008年12月17日 优先权日2007年12月19日
发明者B·D-L·李, C·伦德尔, E·贡内里乌松, F·A·休德, J·W·卡斯特尔, M·E·马里诺, M·林德博里 申请人:通用电气公司