专利名称：一种双发色团荧光探针及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种含有罗丹明和荧光素基团的双发色荧光探针及其制备方法。 荧光探针可以研究复杂的生物体系，但应用环境微小变化会对荧光产生巨大影 响，如果荧光物质带有酸性或碱性取代基，溶液的pH值的改变对其荧光性能有很大的影 响。利用荧光化合物的荧光性能随环境PH值变化而改变的特点，来检测细胞生理范围pH 值变化的荧光化合物被称为PH荧光探针。 一些荧光物质在酸性或碱性条件下发生水解，环 的破裂或键的断开，使荧光性能发生改变，荧光物质在酸或碱的条件荧光光谱也会有明显 的差别。如罗丹明类荧光染料，处于酸性或中性条件下为醌式结构，有荧光；碱性条件下形 成螺式结构而无荧光产生。而荧光素由于其荧光量子产率对PH值敏感，荧光素处于酸性 条件下无荧光，在碱性条件下发射黄绿色荧光，荧光量子产率高，因此常用来检测细胞介质 的pH值。但其荧光量子产率在pH > 8时才能达到最大，而正常细胞质液的pH值在6. 8 7. 4的变化范围，因而降低荧光探针适合检测的pH值，使其在细胞生理环境下荧光强度最 大，具有重要的意义。为此利用这两类荧光探针产生荧光条件的互补性，将罗丹明与荧光素 相连在一个分子中得到一种具有双吸收、双发射基团的化合物，以适应较宽pH范围的荧光 分析，具有探索价值
发明内容
本发明目的就是为了解决上述技术问题，提供一种含有罗丹明和荧光素基团的双 发色荧光探针的制备方法。 本发明具体提供了一种新型的含有罗丹明和荧光素基团的双发色荧光探针，其结
构式为
其中1^、1 2、1 3、1 4各自为氢、不含活泼氢的取代或未取代烷基或芳基中之一种，1 5、
R6、 R7、 R8各自为氢、卤素、不含活泼氢的取代或未取代烷基或芳基中之一种。 n是介于1到9之间的自然数，An—选自氯离子、溴离子、高氯酸根或硫酸根中的一种。 上述双发色团荧光探针的制备方法包括以下步骤 用氯化亚砜将罗丹明衍生物酰氯化，即得到罗丹明酰氯粗产品；加入有机溶剂使 罗丹明酰氯溶解完全，在室温下缓慢加入二胺类物质，溶液搅拌2小时以上，得到一端氨基
背景技术：
被酰化的罗丹明酰胺，减压除去溶剂后将其与5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯共同溶解在N， N-二甲基甲酰胺中，冰浴下滴加N-乙基二异丙胺，室温反应，TLC检测(石油醚乙酸乙酉旨 =3 : 1， Rf 二0.3)，用无机酸调pH值为中性，柱层析纯化，得目标产物，即含有罗丹明和
荧光素基团的双发色荧光探针。其反应过程如下式所示
<formula>formula see original document page 4</formula> 本发明采用的干燥有机溶剂有乙腈、二氯甲烷、二甲基亚砜、氯仿、N， N-二甲基甲 酰胺、四氢呋喃，或者它们的混合物。 本发明所述的用于调pH值的酸包括无机酸如盐酸、氢溴酸、高氯酸或硫酸。 由于上述技术方案运用，本发明与现在技术相比具有下列优点 1.根据本发明制备的含有罗丹明和荧光素基团的双发色荧光探针，在不同pH值
条件下表现出不同的荧光特性，能进行双吸收、双发射的荧光检测，在pH二 4时，这种双发
色荧光探针表现的荧光性能和罗丹明荧光探针相近，在pH = 10时这种双发色荧光探针的
荧光性能与荧光素相近，可用来检测细胞生理范围pH值变化，还可将这类探针作为pH的荧
光指示剂。 2.本发明合成的含有罗丹明和荧光素基团的双发色荧光探针，不含有任何生物特 征基团，具有非常高的检测灵敏度，适合微量检测，有良好的应用前景。
图1是实施例1所得双发色团荧光探针在甲醇中的紫外-可见光谱 图2是实施例1所得双发色团荧光探针在p = 4、pH = 10溶液中荧光发射光谱
具体实施方式
实施例1
将2. 15g(5. Ommol)罗丹明化合物溶解在15mL干燥的氯仿中，冰浴条件下滴加氯 化亚砜7mL，撤去冰浴，室温条件下反应4小时，减压除去溶剂后得到的深紫色固体用20mL 二氯甲烷溶解完全，在室温下缓慢加入到O. 98g(13. 5mmol)l，3-丙二胺的二氯甲烷溶液 中，室温反应，TLC检测(CH30H : CH2C12=1 : llO，Rf = 0. 45)，12小时后减压除去溶剂， 用柱层析纯化，先使用CH^^将淡红色层冲至硅胶柱2/3，洗脱剂改用CH30H : CH2C12 :
冰醋酸=10 : iooo : 5直至分离完毕，得淡紫红色固体即一端氨基被酰化的罗丹明酰胺
2. 07g(3. 62mmol)，将所得固体与1. 75g(3. 70mmol)5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯完全溶解 在20mLDMF中，冰浴下滴加N_乙基二异丙胺0. 67mL (4mmo1) ， TLC检测(石油醚乙酸乙酯 =3 : 1， Rf = 0. 3)，三天后将反应液加入20mL乙酸乙酯，稀盐酸洗涤3次后减压除去有 机溶剂，所得固体直接用柱层析纯化，得乳白色粉末2. llg(收69. 4% )。
力画R (d6-DMSO， 500MHz ， ppm) S :1.12(t，J = 7Hz， 12H) ， 1. 85-1. 91 (m， 2H)， 2. 24-2. 26 (m， 4H) ， 3. 31—3. 44. (m， 12H) ， 6. 10—6. 15 (m， 4H) ， 6. 23 (s， 2H) ， 6. 55 (d， J = 2. 5Hz， 2H) ， 6. 98-7. 02 (m， 2H) ， 7. 21 (d， J = 9. 5Hz， 1H) ， 7. 76-7. 79 (m， 1H) ， 7. 90 (dd， Jl = 7. 5Hz， J2 = 2Hz 1H) ，8. 10(d， J = 7. 5Hz， 1H) ，8. 53(s， 1H); 13C NMR(d6-DMS0， 500MHz ，卯m) S : 12. 6， 14. 3， 30. 1， 31. 9， 34. 2， 37. 3， 40. 1， 46. 2， 95. 3， 103. 5， 106. 2， 111. 3， 119. 5， 122. 7， 123. 8， 127. 9， 128. 2， 130. 6， 132. 5， 148. 1， 155. 4， 157. 3， 165. 2， 167. 9， 169. 5.
实施例2 为比较碱性荧光染料罗丹明与酸性荧光染料荧光素连接后荧光性能的变化，对实 施例l所得到的含有罗丹明和荧光素基团的双发色荧光探针进行了紫外-可见光谱和荧光 光谱检测。在pH = 4时，该探针表现的荧光性能和罗丹明B相近，最大发射波长为561nm， 荧光量子产率比罗丹明B低，(K仅有0.41 ;在pH二 IO时该探针的荧光性能与荧光素相近， 最大发射波长为520nm。荧光光谱说明，将不同pH值条件下进行荧光检测的罗丹明、荧光 素结构桥连在一起后，两个发色团体并没有改变原有的荧光性能，在酸或碱的条件荧光光 谱仍会有明显的差别。pH = 4时，双发色荧光探针分子中罗丹明结构为醌式结构，有荧光， 荧光素部分开环，无荧光产生，双发色荧光探针溶液呈粉红色，表现为罗丹明部分的荧光性 质，吸收和发射波长略有蓝移；pH = 10时，由于双发色荧光探针分子中荧光素部分在碱性 条件下形成螺式结构而产生黄绿色荧光，吸收和发射波长略微红移。利用其荧光性能随环 境PH值变化而显著改变的这个特点，可以来检测细胞生理范围pH值变化。
权利要求
一种含有罗丹明和荧光素基团的双发色荧光探针，其特征在于所述双发色荧光探针如下所示其中R1、R2、R3、R4各自为氢、不含活泼氢的取代或未取代烷基或芳基中之一种，R5、R6、R7、R8各自为氢、卤素、不含活泼氢的取代或未取代烷基或芳基中之一种。n是介于1到9之间的自然数，An-选自氯离子、溴离子、高氯酸根或硫酸根中的一种。F2009102448219C00011.tif
2. 根据权利要求1所述一种双发色团荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤用氯化亚砜将罗丹明衍生物酰氯化，即得到罗丹明酰氯粗产品；加入有机溶剂使罗丹明酰氯溶解完全，在室温下缓慢加入二胺类物质，得到一端氨基被酰化的罗丹明酰胺，减压除去溶剂后将其与5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯共同溶解在N， N- 二甲基甲酰胺中，冰浴下滴加N-乙基二异丙胺，室温反应，TLC检测，后用无机酸调pH值为中性，柱层析纯化得目标产物，即含有罗丹明和荧光素基团的双发色荧光探针。
3. 根据权利要求2所述的双发色团荧光探针的制备方法，其特征在于所述的干燥有机溶剂为乙腈、二氯甲烷、二甲基亚砜、N， N-二甲基甲酰胺或者四氢呋喃。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的酸包括无机酸如盐酸、氢溴酸、高氯酸或硫酸。
5. 根据权利要求1所述含有罗丹明和荧光素基团的双发色荧光探针，其特征在于该探针能在不同pH值条件下进行双吸收、双发射的荧光检测，可用来检测细胞生理范围pH值变化。针如下所示
全文摘要
本发明公开了一种含有罗丹明和荧光素基团的双发色荧光探针及制备方法。其表达式如右(I)化学结构式所示。该双发色团荧光探针的合成方法为通过以2-位带有羧基的罗丹明类分子与二氯亚砜等氯化试剂反应得到的罗丹明酰氯，与不同链长的二胺形成单酰胺产物后再与羧基荧光素琥珀酰亚胺活性酯反应，将两种荧光探针桥链在一起，得到在不同pH值条件下进行荧光检测的双吸收、双发射荧光探针。该探针适应较宽pH范围的荧光分析，可用来检测细胞生理范围pH值变化。
文档编号C07D493/00GK101735802SQ20091024482
公开日2010年6月16日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者刘冬青, 刘静, 温景云, 陈星 , 颜范勇 申请人:天津工业大学