专利名称：一种去除喷司他丁发酵液中杂质的方法
技术领域：
本发明涉及一种去除喷司他丁发酵液中杂质的方法。
背景技术：
BtwJftkT (Pentostatin) T 1974^ Woo 等从 Streptomyces antiboticus 液中分离得到，是一种极强的腺苷脱氨酶(ADA)抑制剂。喷司他丁与ADA的亲和力很高，可与ADA紧密结合，抑制ADA的活性，而使细胞脱氧腺苷三磷酸(dATP)水平增高，dATP通过抑制核糖核苷酸还原酶阻断DNA合成。另外，喷司他丁还能抑制RNA合成并增强对DNA的损伤。1998年2月美国FDA正式批准了注射用喷司他丁(商品名Nipent)上市，主要用于干细胞白血病(Hairy cell leukemia,HCL)以及慢性淋巴细胞白血病(Chroniclymphocytic leukemia, CLL)禾口章样霄菌病(Mycosis fungoides)的治疗。但是，现有技术对于喷司他丁的分离纯化工艺，国内外的研究并不多，USP5463035 中报道的喷司他丁的预处理方法是将发酵液高速离心，滤液用氢氧化钠等碱性溶液调PH 到8. 7，置于< 15°C环境中数小时或数天(视体积大小而定)，过滤，滤液调pH至6. 0，再经 Dowex-50树脂进一步除杂。此法虽然也能取得一定的效果，但操作步骤繁琐，有机溶媒使用量大，环境污染严重，非常不利于工业化生产。喷司他丁的发酵液由于杂质较多，滤液混浊，目前现有技术中还没有一种简单、有效的方法能够将发酵液的杂质去除，并将发酵液中喷司他丁的纯度提到较高的水平，该现状亟待解决。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了现有的预处理喷司他丁发酵液预处理方法存在操作步骤繁琐，有机溶媒使用量大，环境污染严重的缺陷，提供了一种操作方便、工艺步骤简单、不要特别加入有机溶剂，能够有效去除喷司他丁发酵液中杂质的方法。本发明的去除喷司他丁发酵液中杂质的方法包括如下步骤将经离心的喷司他丁发酵液的上清液，过截流分子量为5000 20000的超滤膜，之后将超滤液过截流分子量为 500 2000的纳滤膜，再将纳滤液过截流分子量为100 200的纳滤膜，得滤液即可。本发明中，所述的喷司他丁发酵液为本领域常规制备喷司他丁的微生物菌发酵液，一般由Sti^ptomyces antiboticus按本领域常规方法发酵培养获得。所述的 Streptomyces antiboticus具体菌种没有特殊限定，常规能够生产喷司他丁的菌种均可使用，如 Streptomyces antiboticus NRRL3238 等。其中，所述的 Streptomyces antiboticus 经培养发酵获得含喷司他丁发酵液具体菌种不受限定是鉴于目前产生喷司他丁的菌种均为Mi^ptomyces antiboticusNRRL3238经自然分离或系列诱变产生，不同的具体菌株虽然在喷司他丁产量、杂质的比例上有所不同，但发酵液的主要成分相对固定，故本发明同样适用于其他产生喷司他丁的菌种。本发明中，所述的截流分子量为5000 20000的超滤膜较佳的为截流分子量为8000的超滤膜。本发明中，所述的过截流分子量为5000 20000的超滤膜的条件为本领域常规条件，为获得更好的效果，进一步地优选下述条件pH值较佳的为3 6 ；和/或温度较佳的为 30 °C 40 0C ；禾口 /或操作压力较佳的为0. IMpa 0. 3Mpa。本发明中，所述的超滤膜较佳的为中空纤维膜。本发明中，所述的截流分子量为500 2000的纳滤膜较佳的为截流分子量为 500 1000的纳滤膜，更佳的为截流分子量为500的纳滤膜。本发明中，所述的过截流分子量为500 2000的纳滤膜的条件为本领域常规条件，为获得更好的效果，进一步地优选下述条件PH值较佳的为3 6 ；和/或温度较佳的为 40°C 60°C ；和/或操作压力较佳的为0. 2Mpa 0. 4Mpa。本发明中，所述的截流分子量为100 200的纳滤膜较佳的为截流分子量为 150 200的纳滤膜，更佳的为截流分子量为150的纳滤膜。本发明中，所述的过截流分子量为100 200的纳滤膜的条件为本领域常规条件， 为获得更好的效果，进一步地优选下述条件PH值较佳的为8 9 ；和/或温度较佳的为 40°C 60°C ；和/或操作压力较佳的为0. 2Mpa 0. 4Mpa。本发明中，所述的纳滤膜较佳的为醋酸纤维素膜。本发明中，所述的pH值的调节剂为本领域常规所用pH调节剂，当调节pH为酸性时，PH调节剂较佳的为盐酸；当调节pH为碱性时，pH调节剂较佳的为氢氧化钠。所述的pH 值的调节剂的使用浓度较佳的为lmol/L。本发明所用试剂和原料除特殊说明外均市售可得。在符合本领域常识的基础上，本发明中上述的各技术特征优选条件可以任意组合得到较佳实例。本发明的积极进步效果在于本发明的去除喷司他丁发酵液中杂质的方法操作方便、工艺步骤简单、不要特别加入有机溶剂，分离效果良好、处理得到的喷司他丁预处理液中的喷司他丁 HPLC纯度可达50%以上，适合工业化生产。
具体实施例方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述实施例中，检测喷司他丁的高效液相色谱(HPLC)检测条件为色谱柱为 Agilent C18 (5 μ m，250 X 4. 6mm)，流动相为甲醇乙腈乙酸铵水溶液(IOmmo 1/L)体积比为2. 5 2.5 95，柱温40°C，流速为lmL/min，检测波长观011111，进样量为10yL。下述实施例中，各滤膜的来源为上海亚东核级树脂有限公司，超滤膜为中空纤维膜，纳滤膜为醋酸纤维素膜。制备实施例制备喷司他丁发酵液，使用的菌种为Mi^ptomyces antiboticus NRRL3238(来源美国农业研究菌种保藏中心)。具体发酵培养条件为1、斜面培养培养10天
培养基(g/L):葡萄糖10、酵母膏20、琼脂25、自来水，消毒前pH7. 2;2、种子培养，2天，摇床转速250rpm培养基(g/L)葡萄20、豆粕粉20、氯化钠5、碳酸钙2. 5、自来水，消毒前pH 7. 5 ；3、发酵培养121°C灭菌20min，接种量10%，摇瓶装量100mL/750mL，置于30°C恒温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵5天后，得到喷司他丁发酵液；培养基(g/L):葡萄糖50、豆粕粉20、氯化钠5、碳酸钙2. 5、自来水，消毒前pH 7. 2。实施例1将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，lmol/L盐酸调pH至3. 0，采用截流分子量为20000的中空纤维超滤膜在30°C、0. 3Mpa时过滤上清液，平均膜通量为49. 5L/h，超滤膜的收率为98. 3%，浓缩倍数约为1. 5倍，去除了上清液中可溶性蛋白，高聚物，培养基，菌丝体等杂质，滤出液澄清度较好；再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至5. 0，再用截流分子量为500的纳滤膜在40°C、0. 3Mpa时过滤，平均膜通量为30. 7L/h，浓缩倍数约为 2倍，收集滤出液，收率约为82. 1 %，并且除去了部分多糖，多肽、色素等杂质；将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至8.0，再用截流分子量为150的纳滤膜在 40°C、0. 2Mpa时过滤，平均膜通量为19. 5L/h，浓缩倍数约为3倍，收率约为89. 3%，除去了溶液中小分子盐类，色素等极性杂质，得到澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为
50.4%。实施例2将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用lmol/L盐酸调pH至4. 0再用截流分子量为5000的中空纤维超滤膜在35°C、0. 2Mpa时过滤上清液，平均膜通量为45. 8L/h，超滤膜的收率为94.8%，浓缩倍数约为1.5倍，去除了上清液中可溶性蛋白，高聚物，培养基， 菌丝体等杂质，滤出液澄清度较好；再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至6. 0，再用截流分子量为500的纳滤膜在45°C、0. 25Mpa时过滤，平均膜通量为30. 5L/h，浓缩倍数约为 2倍，收集滤出液，收率约为82. 8%，并且除去了部分多糖，多肽、色素等杂质；将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至8.0，再用截流分子量为150的纳滤膜在 55°C、0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为17. 9L/h，浓缩倍数约为3倍，收率约为91. 5%，除去了溶液中小分子盐类，色素等极性杂质，得到澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为
51.7%。实施例3将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用lmol/L盐酸调pH至5. 0，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在30°C、0. 3Mpa时过滤上清液，平均膜通量为47. 6L/h，超滤膜的收率为96.4%，浓缩倍数约为1.5倍，去除了上清液中可溶性蛋白，高聚物，培养基， 菌丝体等杂质，滤出液澄清度较好；再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至4. 5，再用截流分子量为500的纳滤膜在60°C、0. 35Mpa时过滤，平均膜通量为26. 4L/h，浓缩倍数约为 2倍，收集滤出液，收率约为79. 5%，并且除去了部分多糖，多肽、色素等杂质；
将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至8.0，再用截流分子量为150的纳滤膜在 45°C、0. 3Mpa时过滤，平均膜通量为19. lL/h，浓缩倍数约为3倍，收率约为88. 1%，除去了溶液中小分子盐类，色素等极性杂质，得到澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为 52. 1%。实施例4将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用lmol/L盐酸调pH至6. 0，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在40°C、0. 15Mpa时过滤上清液，平均膜通量为46. 2L/h， 超滤膜的收率为95. 3%，浓缩倍数约为1. 5倍，去除了上清液中可溶性蛋白，高聚物，培养基，菌丝体等杂质，滤出液澄清度较好；再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用lmol/L盐酸调pH至3. 0，再用截流分子量为1000的纳滤膜在40°C、0. 2Mpa时过滤，平均膜通量为27. 9L/h，浓缩倍数约为2 倍，收集滤出液，收率约为81.4%，并且除去了部分多糖，多肽、色素等杂质；将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至8. 5，再用截流分子量为150的纳滤膜在 60°C、0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为18. 4L/h，浓缩倍数约为3倍，收率约为90. 7%，除去了溶液中小分子盐类，色素等极性杂质，得到澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为 54. 3%。实施例5将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用lmol/L盐酸调pH至4. 5，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在35°C、0. IMpa时过滤上清液，平均膜通量为49. 3L/h，超滤膜的收率为97. 7%，浓缩倍数约为1. 5倍，去除了上清液中可溶性蛋白，高聚物，培养基， 菌丝体等杂质，滤出液澄清度较好；再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至3. 5，再用截流分子量为800的纳滤膜在50°C、0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为27. lL/h，浓缩倍数约为 2倍，收集滤出液，收率约为80. 5%，并且除去了部分多糖，多肽、色素等杂质；将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至8. 5，再用截流分子量为150的纳滤膜在 50°C、0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为17. 8L/h，浓缩倍数约为3倍，收率约为91. 2%，除去了溶液中小分子盐类，色素等极性杂质，得到澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为 54. 2%。实施例6将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用lmol/L盐酸调pH至5. 5，再用截流分子量为5000的中空纤维超滤膜在30°C、0. 25Mpa时过滤上清液，平均膜通量为46. lL/h， 超滤膜的收率为95.4%，浓缩倍数约为1.5倍，去除了上清液中可溶性蛋白，高聚物，培养基，菌丝体等杂质，滤出液澄清度较好；再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至4. 0，再用截流分子量为500的纳滤膜在55°C、0. 2Mpa时过滤，平均膜通量为26. 7L/h，浓缩倍数约为 2倍，收集滤出液，收率约为79. 6%，并且除去了部分多糖，多肽、色素等杂质；将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至8. 5，再用截流分子量为200的纳滤膜在 40°C、0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为19. 8L/h，浓缩倍数约为3倍，收率约为88. 7%，除去了溶液中小分子盐类，色素等极性杂质，得到澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为55. 3%。实施例7将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用lmol/L盐酸调pH至6. 0，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在30°C、0. 2Mpa时过滤上清液，平均膜通量为46. lL/h，超滤膜的收率为95.4%，浓缩倍数约为1.5倍，去除了上清液中可溶性蛋白，高聚物，培养基， 菌丝体等杂质，滤出液澄清度较好；再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至4. 0，再用截流分子量为500的纳滤膜在45°C、0. 35Mpa时过滤，平均膜通量为26. 7L/h，浓缩倍数约为 2倍，收集滤出液，收率约为79. 6%，并且除去了部分多糖，多肽、色素等杂质；将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至9.0，再用截流分子量为150的纳滤膜在 50°C、0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为19. 8L/h，浓缩倍数约为3倍，收率约为88. 7%，除去了溶液中小分子盐类，色素等极性杂质，得到澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为 55. 3%。对比例1将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用lmol/L盐酸调pH至4. 0，再用截流分子量为50000的中空纤维超滤膜在30°C、0. 15Mpa时过滤上清液，平均膜通量为54. IL/ h，超滤膜的收率为96. 4%，浓缩倍数约为1. 5倍；然后依次用截流分子量为500的纳滤膜在40°C、0. 3Mpa和截流分子量为150的纳滤膜在50°C、0. 3Mpa除杂，得到较澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为43. 2%。对比例2将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用lmol/L盐酸调pH至5. 0，再用截流分子量为100000的中空纤维超滤膜在30°C、0. 15Mpa时过滤上清液，平均膜通量为59. 4L/ h，超滤膜的收率为99. 2%，浓缩倍数约为1. 5倍；然后依次用截流分子量为500的纳滤膜在45°C、0. 2Mpa和截流分子量为150的纳滤膜在60°C、0. 4Mpa除杂，得到较澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为38. 2%。结论由对比例1、2可以看出，超滤膜截流分子量太大会显著影响喷司他丁滤液的纯度，增加了后期分离纯化的难度。对比例3将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用lmol/L盐酸调pH至6. 0，再用截流分子量为5000的中空纤维超滤膜在30°C、0. 15Mpa时过滤上清液，再用截流分子量为300 的纳滤膜在40°C、0. 2Mpa进一步提纯，得到较澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为 41. 2%。结论可见，不在本发明纳滤膜截流分子量范围内，纳滤液中喷司他丁的纯度增加了后期分离纯化的难度。实施例8将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用lmol/L盐酸调pH至9，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在35°C、0. IMpa时过滤上清液，平均膜通量为41. 3L/h，超滤膜的收率为85.7% ；再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至10，再用截流分子量为800的纳滤膜在50°C、0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为23. lL/h，收率约为 70. 5% ；将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至10，再用截流分子量为150的纳滤膜在50°C、 0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为16. 7L/h，收率约为81. 1 %，HPLC检测其纯度为51. 2%。实施例9将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用lmol/L盐酸调pH至1.0，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在35°C、0. IMpa时过滤上清液，平均膜通量为48. 5L/h，超滤膜的收率为84. ；再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至2. 5，再用截流分子量为800的纳滤膜在50°C、0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为26. lL/h，收率约为 72. 1% ；将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至8，再用截流分子量为150的纳滤膜在50°C、 0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为16. 3L/h，收率约为81.1%。实施例10将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用lmol/L盐酸调pH至10，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在35°C、0. IMpa时过滤上清液，平均膜通量为37. 3L/h，超滤膜的收率为67.8% ；再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至13，再用截流分子量为800的纳滤膜在50°C、0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为20. lL/h，收率约为 63. 5% ；将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至9，再用截流分子量为150的纳滤膜在50°C、 0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为15. 7L/h，收率约为77. 4%, HPLC检测其纯度为42. 2%。实施例11将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用lmol/L盐酸调pH至4. 0，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在45°C、0. IMpa时过滤上清液，平均膜通量为43. lL/h，超滤膜的收率为88.7% ；再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至3. 0，再用截流分子量为800的纳滤膜在70°C、0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为26. 4L/h，收率约为 72. 5% ；将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至8. 5，再用截流分子量为150的纳滤膜在 75°C、0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为16. 7L/h，收率约为79. 2%，HPLC检测其纯度为52. 2%。实施例12将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用lmol/L盐酸调pH至4. 0，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在15°C、0. IMpa时过滤上清液，平均膜通量为33. lL/h，超滤膜的收率为87. ；再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至3. 0，再用截流分子量为800的纳滤膜在20°C、0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为21. 4L/h，收率约为 77. 5% ；将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至8. 5，再用截流分子量为150的纳滤膜在25°C、0. 4Mpa时过滤，平均膜通量为13. 7L/h，收率约为71. 2%，HPLC检测其纯度为53. 4%。
权利要求
1.一种去除喷司他丁发酵液中杂质的方法，其包括如下步骤将经离心的喷司他丁发酵液的上清液，过截流分子量为5000 20000的超滤膜，之后将超滤液过截流分子量为 500 2000的纳滤膜，再将纳滤液过截流分子量为100 200的纳滤膜，得滤液即可。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的喷司他丁发酵液由Sti^ptomyces antiboticus按本领域常规方法发酵培养获得。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的Sti^ptomycesantiboticus为 Streptomyces antiboticus NRRL3238。
4.如权利要求1 3任一项所述的方法，其特征在于所述的截流分子量为5000 20000的超滤膜为截流分子量为8000的超滤膜。
5.如权利要求1 4任一项所述的方法，其特征在于所述的过截流分子量为5000 20000的超滤膜的条件为pH值为3 6 ；和/或温度为30°C 40°C ；和/或操作压力为 0. IMpa 0. 3Mpa。
6.如权利要求1 5任一项所述的方法，其特征在于所述的截流分子量为500 2000 的纳滤膜为截流分子量为500 1000的纳滤膜，较佳的为截流分子量为500的纳滤膜；和 /或所述的截流分子量为100 200的纳滤膜为截流分子量为150 200的纳滤膜，较佳的为截流分子量为150的纳滤膜。
7.如权利要求1 6任一项所述的方法，其特征在于所述的过截流分子量为500 2000的纳滤膜的条件为pH值为3 6 ；和/或温度为40°C 60°C ；和/或操作压力为 0. 2Mpa 0. 4Mpa。
8.如权利要求1 7任一项所述的方法，其特征在于所述的过截流分子量为100 200的纳滤膜的条件为pH值为8 9 ；和/或温度为40°C 60°C ；和/或操作压力为 0. 2Mpa 0. 4Mpa。
9.如权利要求1 8任一项所述的方法，其特征在于所述的超滤膜为中空纤维膜；所述的纳滤膜为醋酸纤维素膜。
10.如权利要求1 9任一项所述的方法，其特征在于所述的PH值的调节剂当调节 PH为酸性时，pH调节剂为盐酸；当调节pH为碱性时，pH调节剂为氢氧化钠；所述的pH值的调节剂的使用浓度为lmol/L。
全文摘要
本发明公开了一种去除喷司他丁发酵液中杂质的方法包括如下步骤将经离心的喷司他丁发酵液的上清液，过截流分子量为5000～20000的超滤膜，之后将超滤液过截流分子量为500～2000的纳滤膜，再将纳滤液过截流分子量为100～200的纳滤膜，得滤液即可。该方法操作方便、工艺步骤简单、不要特别加入有机溶剂，分离效果良好，适合工业化生产。
文档编号C07H19/23GK102453065SQ201010526100
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者刘文静, 卢亮, 李继安 申请人:上海医药工业研究院