专利名称：肽硫酯的制造方法
技术领域：
本发明涉及肽硫酯的制造方法。
背景技术：
在蛋白质的合成上，已知有生物合成、化学合成、无细胞合成等各种方法。在生物合成方法中，通过利用大肠杆菌等的细 胞内部，将编码所要合成的蛋白质的DNA导入细胞内部来表达而制得蛋白质。在化学合成中，将氨基酸以有机化学方式依序键合来合成目的蛋白质。无细胞合成则利用存在于大肠杆菌等各种细胞内的酶等，以无细胞方式来合成蛋白质。此等方法可依据蛋白质的使用目的、尺寸、或所附加之性质等来适当地分开使用或组
口 o为了合成在氨基酸序列的中间部分均匀地具有糖链或脂质等特定修饰的蛋白质，目前已采用使用预先以糖链或脂质等修饰的氨基酸，对其周边的肽链进行化学合成的方法。作为对肽链进行化学合成的方法主要是采用固相合成法。然而，由固相合成法所得之肽链一般为短链，最长也只是50个残基左右而已。因此，为了合成具有修饰物的长肽链，主要是采用分别制备短肽链后再将它们连接的方法。作为肽链连接方法虽报导有各种方法，但广泛采用的方法之一为自然化学连接法(Native Chemical Ligation,NCL法)。已知的是，即使是无保护的这些肽链,彼此也可进行NCL法，且NCL法已知为用于在连接部位(ligation部位)生成天然酰胺键(肽键)的有用方法(例如专利文献I)。NCL法为在C末端上具有a羧基硫酯部分的第I肽与在N末端上具有半胱氨酸残基的第2肽之间的化学选择反应，半胱氨酸之侧链的硫醇基(SH基，亦称为硫氢基)与硫酯基的羰基碳有选择地进行反应，再经由硫醇交换反应即生成硫酯键初期中间体。此中间体自发性地进行分子内重排(intramolecular rearragement)而在连接部位上提供天然酰胺键合，另一方面使半胱氨酸侧链硫醇再次产生。此方法为能够仅通过使无保护之肽在缓冲溶液中混合而经由肽键将两个肽链连接的方法。NCL法中，即使当例如肽等具有许多官能基之化合物彼此间发生反应，亦可有选择地将其中一者的肽C末端与另一者的肽N末端连接。由此观点而言，为了对蛋白质进行化学合成，重要的是如何来利用NCL法。然而，利用NCL法的问题包括制备C末端上具有a羧基硫酯部分的肽硫酯来作为所需原料。肽硫酯的制备法虽报导有各种方法，但一般可分成基于固相合成法的两种类型。第一种为在树脂上建构肽硫酯的方法。此方法中，可将肽链从建构此肽后之树脂切断而制得肽硫酯(例如Boc固相合成法、Fmoc固相合成法)。第二种为经由与硫酯等同的连接物(linker)将肽链建构于固相上的方法(Safety Catch linker、Fujii法、Dawson法、Mercapto propanol 法、Kawakami 法、Danishefsky 法、Hojo 法、Aimoto 法等)。该方法中，将由连接物进行适当处理所建构的肽链C末端活性化后，对肽链进行硫解(thiolysis)而制得硫酯(非专利文献I)。在这些之外，还报导有在合成由固相合成对侧链进行保护，且仅C末端之羧基为游离的保护肽之后，再以适当的缩合条件进行硫酯化之方法(例如专利文献2)。以上任何方法皆为已确立之方法，并且在过去的各种蛋白质合成中被采用。然而，由于任一种方法皆受限于固相合成法的限制，因此能够合成出来的肽硫酯的尺寸便会受到限制。再者，在使用连接物的方法中，必须对非天然氨基酸衍生物或特别的衍生物进行单独的化学合成，因而其步骤未必称得上是简便。在解决采用固相合成法之硫酯化 的限制的方法上已有内含肽法(Intein法)(非专利文献2)。此为可制得由细胞进行生物合成之多肽片段作为硫酯的方法。在Intein法中，通过利用在特定蛋白质序列中所产生之蛋白质剪接(splicing)功能进行肽链的硫酯化，从而制得多肽链作为硫酯。此方法的有用之处在于可制得长链的肽硫酯。通过将此方法与化学合成法组合，可合成即使是到目前为止被认为是难以合成的大型被修饰蛋白质(非专利文献3)。表达并获得多肽链的方法已有大量研究，充分被确立为生物学上的基本技术。然而，在采用Intein法时，不仅要表达多肽，还要使蛋白质剪接发挥功能，这就需要有作为标的之肽序列，且所表达之内含肽复合蛋白质必须发生折叠而呈现固有的三维结构。因此，依赖于所要表达的多肽序列，未必能制得肽硫酯，通常会伴随着充分条件的优化，作业上的麻烦便会跟随而至。另一方面，作为肽的切断方法，已知有使化合物与肽中之半胱氨酸残基的SH基反应，借此在上述半胱氨酸残基的位置处切断肽链的方法(非专利文献4、5)、或使用连接物切断与固相键合的肽的方法(非专利文献6、7)。此外，已知有使用溴化氰(CNBr)切断甲硫氨酸(methionine)残基的C末端之一侧的肽键的方法。然而，这些方法并非为制得作为硫酯的肽片段的方法。相关技术文献[专利文献I]国际公开W096/34878[专利文献2]国际公开W02007/114454[非专利文献][非专利文献 I] Ingenito et al.，J. Am. Chem. Soc. 1999，121，11369-11374[非专利文献 2] Schwartz et al.，CHEM. C0MMUN.，2003 2087-2090[非专利文献 3]Muir, Annu. Rev. Biochem. 2003. 72 :249-289[非专利文献 4] Stark GR, Methods of Enzymology, 1977,47,129-132.[非专利文献 5]Nakagawa et al. , J. Am. Chem. Soc. 1994,116, 5513-5514[非专利文献 6] Sola et al.，J. Chem. Soc.，Chem. Commun.，1993,1786-1788[非专利文献 7]Pascal et al. , Tetrahedron Letters, 1994, Vol. 35, No. 34,6291-629
发明内容
本发明所要解决的问题在如上述背景技术所示的肽硫酯化法中，可进行硫酯化之肽仅限于固相合成的肽链或作为蛋白质剪接的标的之肽链。此为任何这些方法皆需要有非天然氨基酸衍生物、连接物、特定三维结构等之故。因此，本发明的一个目的在于提供一种将多肽链以化学方式转换成肽硫酯的新颖方法。用以解决问题的方式本发明人考虑到须有将肽序 列中的天然氨基酸残基作为目标，有选择地使肽C末端活性化的方法。只要为此种方法，即使是以生物合成等任何方法所得之肽，亦可有选择地使肽链活性化而进行硫酯化。因此，本发明人着眼于天然氨基酸中作为特殊含硫氨基酸的半胱氨酸残基。尔后发现如下图所示在半胱氨酸残基的硫醇基上导入_C( = X)-R:基，在有机溶剂中使具有以-NH-C ( = Y)NHR3表示之离去基团的化合物与之反应，以在半胱氨酸残基之N末端侧的肽键的羧基上附加-NH-C( = Y)NHR3基，由此将上述肽键切断且C末端之一侧的肽片段被切除。更进一步发现通过下述与硫醇的交换反应即可将所得肽链转换成肽硫酯使硫醇化合物与附加有此-NH-C( = Y)NHR3基的肽链在缓冲溶液中反应，由此使上述硫醇的硫醇基与已键合有-NH-C ( = Y) NHR3基的羰基碳键合，上述-NH-C ( = Y) NHR3基则脱离。作为上述一例，具体而言，首先在半胱氨酸残基的硫醇基上导入硫代甲酸酯(thionoformate)基。然后，在有机溶剂中使此硫代甲酸酯基与N-乙酰胍(N_acetylguanidine)反应，以在半胱氨酸残基的N末端侧发生肽链的切断，即制得C末端附加有N-乙酰胍基的肽链。再者，使此附加有N-乙酰胍基之肽链在缓冲溶液中与硫醇R4-SH反应，即转换为肽硫酯。 又发现由上述所得之对C末端进行N-乙酰胍化反应之肽链及肽硫酯可利用于NCL法中。
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权利要求
1.肽硫酯的制造方法，包括以下步骤(a) (C) (a)步骤在具有半胱氨酸残基的肽链中，使由以下式(I)表示的化合物A与所述半胱氨酸残基的硫醇基反应而使R2脱离，以制造第I中间体
2.如权利要求I所述的方法，其中，X为硫原子。
3.如权利要求I或2所述的方法，其中，R1为-O-C6芳基。
4.如权利要求I至3中任一项所述的方法，其中，R2为卤素原子或者取代或未取代的-S_C6_1(I 芳基。
5.如权利要求I至4中任一项所述的方法，其中，Y为NH基。
6.如权利要求I至5中任一项所述的方法，其中，R3为乙酰基。
7.如权利要求I至6中任一项所述的方法，其中，在所述步骤(c)中，所述硫醇为由以下式(III)表示的硫醇 R4-SH (式 III) 式中，R4为选自取代或未取代之苯甲基、取代或未取代之芳基、及取代或未取代之烷基中的任一种基团。
8.如权利要求I至7中任一项所述的方法，其中，所述肽链为重组蛋白质。
9.如权利要求I至8中任一项所述的方法，其中，所述肽链为含有精制用标记物的重组蛋白质。
10.多肽的制造方法，包括将由权利要求I至9中任一项所述的方法而得到的肽硫酯与N末端上具有半胱氨酸的肽链通过连接法结合的步骤。
11.第2中间体的制造方法，所述第2中间体用于权利要求I至9中任一项所述的肽硫酯的制造方法，所述第2中间体的制造方法包括以下步骤(a)或(b) (a)步骤在具有半胱氨酸残基的肽链中，使由以下式(I)表示的化合物A与所述半胱氨酸残基的硫醇基反应而使R2脱离，以制造第I中间体 X (I)
12.在C末端上具有-NH-C( = Y) NHR3基的肽链，其中，Y为氧原子或NH基，R3为氢原子、酰基或烷氧羰基。
13.多肽的制造方法，包括将权利要求12所述的在C末端上具有-NH-C( = Y) NHR3基的肽链与N末端上具有半胱氨酸的肽链通过连接法结合的步骤。
14.除去附加于重组蛋白质的C末端侧的精制用标记物的方法，包括以下步骤(a) (C) (a)步骤在C末端上含有精制用标记物的重组蛋白质中，使由以下式(I)表示的化合物A与半胱氨酸残基的硫醇基反应而使R2脱离，以制造第I中间体 X (I) 式中，X为硫原子或氧原子，R1及R2为离去基团； (b)步骤在有机溶剂中，使由以下式(II)表示的化合物B与所述第I中间体反应，以在所述半胱氨酸残基与邻接于所述半胱氨酸残基之N末端侧的氨基酸之间形成肽键的羧基上附加-NH-C ( = Y) NHR3基，并切断所述肽键，从而制得作为第2中间体的比被切断的所述肽键更靠近N末端侧的肽片段 Y H2NN—R3H(I I) 式中，Y为氧原子、硫原子或NH基，R3为氢原子、酰基或烷氧羰基；以及 (c)步骤使硫醇与所述第2中间体反应，以使C末端的-NH-C( = Y) NHR3基与硫醇基进行交换，从而对所述第2中间体的C末端进行硫酯化 。
全文摘要
本发明提供了一种将肽链以化学方式转换成肽硫酯的新颖方法。本发明人在肽链中着眼于半胱氨酸残基，结果发现在半胱氨酸残基的硫醇基上导入-C(＝X)-R1基，然后在有机溶剂中使所得肽与具有以-NH-C(＝Y)NHR3表示的离去基团的化合物反应，在半胱氨酸残基的N末端侧肽键的羧基上附加-NH-C(＝Y)NHR3基，由此将上述肽键切断且将C末端侧的肽片段切除。更进一步，当使所得的具有此-NH-C(＝Y)NHR3基的肽链与硫醇在缓冲溶液中反应，则会发生硫醇交换反应，即，硫醇的硫醇基将键合至已键合有-NH-C(＝Y)NHR3基的羰基碳，而使上述-NH-C(＝Y)NHR3基脱离。由此即可转换成肽硫酯。
文档编号C07K7/06GK102803286SQ20108002842
公开日2012年11月28日 申请日期2010年6月21日 优先权日2009年6月26日
发明者梶原康宏, 冈本亮, 坂本泉, 石井一之 申请人:大塚化学株式会社