专利名称：一种玉米中活性次生代谢物-丁布的提取方法
技术领域：
本发明属于植物次生代谢物提取制备技术领域，具体涉及一种玉米中活性次生代谢物-丁布的提取方法。
背景技术：
植物在生态系统中占有重要的地位，同时也是次生代谢产物的天然宝库。植物与植物、植物与微生物、植物与动物之间普遍存在着通过次生代谢物为媒介的化学关系[i]。大量研究表明，植物产生的次生代谢物质具有化学防御功能[a]，因此寻找植物源抗菌或杀虫化合物一直是国际植物保护、新农药研发中关注的热点。异羟肟酸(2，4_二羟基-2H_1，4-苯并噁嗪-30H)-酮)及其衍生物是广泛存在于玉米(Zea mays L.)等禾本科作物中的一类重要的次生代谢物。丁布(DIMB0A，2，4_ 二羟基-7-甲氧基-1，4-苯并口噁嗪-3-酮)是玉米中含量最丰富的一类异羟肟酸[5=￡]。丁布在正常植物体内以β -D-葡萄糖苷无毒形式存在，由于机械损伤或害虫、病菌侵入造成细胞膜系统的破坏和内含物混合，在分布于细胞壁上的葡糖苷酶的作用下，丁布糖苷水解， 释放出有活性的丁布。自1959年Wahlroos等指出在玉米抗性中起主要作用的是2，4-二羟基-7-甲氧基-1，4-苯并恶嗪-3-酮以来，人们对其研究日渐深入，目前研究已经证实丁布具有抗病，抗虫及化感作用，在玉米、小麦等禾本科作物中广泛存在，引起了昆虫学家、化学家、病理学家和育种学家的广泛关注。因此，建立一个高效、简便、安全经济的丁布提取方法，是全面彻底研究丁布在作物化学防御中所起作用的重要前提。丁布的提取方法最早是由Wahlr00S等于1959年提出的[5]。其具体提取步骤为 称取在温室自然光照条件下培养10天的玉米绿色幼苗地上部分400g，榨汁处理，室温静置 30分钟。随后离心40min(离心力为10000g)。转移上清液，用乙醚萃取2次。收集合并乙醚相，无水硫酸钠脱水后，减压浓缩后。剩余固体利用甲醇-乙醚溶解，加入过量乙醚重结晶；随后再将晶体溶于环己烷，加入过量乙醚重结晶。1962年，Hamilton等从玉米中提取丁布方法如下ω 取3. 6kg黑暗条件下培养5d的玉米黄花苗，加入足量乙醇后勻浆。过滤，滤液在37°C下减压浓缩。再将浓缩液pH调至4，用等体积乙醚萃取3次。合并乙醚相， 减压浓缩至500ml。再用100ml 8%碳酸氢钠溶液萃取2次，合并碳酸氢钠溶液，将pH调至 4，再用等体积乙醚萃取3次，合并乙醚相，在1°C下过无水硫酸钠，减压浓缩至干。所得物质用5ml乙醚洗涤2次，溶解于少量热丙酮中，加入过量石油醚多次重结晶。1967年，Klim 在Wahlroos和Hamilton建立方法基础之上做了改进，具体步骤如下[ ]黑暗条件下培养的玉米黄花苗，加入2倍体积的蒸馏水勻浆。纱布过滤，室温静置lh，快速升温至65°C，在迅速用冰水浴降温。滤纸过滤，滤液用过量乙醚萃取多次，收集合并乙醚相，无水硫酸镁脱水处理后，浓缩至干。所得残留物质用少量三氯甲烷/乙醇(95 5, V V)冲洗2次，剩余固体用丙酮丙酮溶解，加入正己烷多次重结晶。1978年，woodward等在Klun等前人工作基础上，建立了如下提取方法在恒温、黑暗条件下培养7d的玉米黄化苗(238g)，加入 480ml水后勻浆，勻浆物室温条件下静置50min，纱布过滤，快速升温至65°C，再迅速冷却至10 15°C，过滤，滤液用乙醚萃取，于真空条件下干燥，所得物质置于-20°C的冰箱中冷冻固化5d，用0. 2ml的三氯甲烷/甲醇(95 5, V V)冲洗2次，剩余固体用Iml丙酮清洗 (溶于丙酮中，加入正己烷)，用活性炭脱色，产生白色针状结晶，即为丁布[2]。上述几种丁布提取方法过程大同小异，均存在提取步骤繁琐，耗费大量较高毒性溶剂等缺点。研究表明，奎尼酸和吲哚是合成丁布生物合成的前体，丁布的合成与暗光条件有关[2’Μ]，黑暗条件下生长的玉米幼苗中丁布含量大约是自然光照下生长的2倍[11]，玉米黄化幼苗是提取获得丁布的首选材料。Wahlr00s等于1959年建立的方法，选用自然光培养的正常玉米苗为提取材料，正常玉米苗中DIMBOA含量低于暗光培养的黄花苗，且色素杂质含量较高，给DIMBOA的分离提纯带来了困难。Hamilton建立的方法，虽然其提取材料采用了玉米黄花苗，但在后续的提取过程中，多次大量使用乙醚作为提取溶剂，液液萃取过程中极容易产生乳化现象，在增加分离难度的同时，也严重降低了丁布的收率。加之乙醚毒性较大，给实验操作者的健康带来危险。研究报道证明，丁布在水环境下很不稳定，极容易分解为相应的缩环苯并噁唑啉酮化合物)——门布(MBOA)[§]。Klun和Woodward等建立的方法， 均采用纯水作为提取溶剂，在加入过量蒸馏水后勻浆，并在室温下静置较长时间，随即将水提取液迅速升温。上述操作会均会使释放到水环境中的丁布因降解最终造成丁布收率损失。2000年，Larsen等提出一种利用固相萃取技术来提取丁布的方法[11]。具体方案是在黑暗条件下种植黄化苗，收获地上部分，置于-20°C冰箱中冷藏，取出冷冻苗化冻，称取一定量的化冻苗，放在组织捣碎机中，加入一定量的水进行搅拌，所得混合物用纱布过滤，滤液静置lh，加入非离子型高分子吸附剂(AmberliteXAD-7)搅拌lh，过滤，用水冲洗吸附剂2 次，再用丙酮(色谱纯)冲洗2次，所得丙酮溶液在真空条件下干燥，残留物用二氯甲烷溶解，置于-20°C冰箱中Mh，沉淀过滤，用等体积冰镇的二氯甲烷与正己烷混合液清洗，产生一种丁布晶体。该方法同样采用过量纯水作为提取溶剂，室温静置lh。和Klim及Woodward 建立方法相同，该提取步骤会因为丁布分解造成损失。虽然后续作者采用向水勻浆物中添加大量Amberlite XAD-7吸附剂，通过固相萃取的方法获得的丁布纯度较高，但其操作的技术性要求较高，操作过程繁琐，耗时较长，耗用溶剂量大，同时使用大量吸附剂，使该方法的成本大大提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种玉米中活性次生代谢物-丁布的提取方法。一种玉米中活性次生代谢物-丁布的提取方法，按照如下步骤进行(1)将玉米种子在黑暗条件下培养，2-15天后收获玉米黄化苗800-1200g，取地上部分，置于_20°C保存备用；(2)将乙酸乙酯和环己烷按照体积比(0.01-99) 1混合，制成有机相，-20°c保存的玉米黄化苗解冻，加入有机相1500-2500mL，高速勻浆3-lOmin，室温下静置0. 5-2h ；(3)将勻浆物用纱布过滤后再用滤纸过滤，滤液转移至分液漏斗，室温静置 0. 5_2h，待有机相和水相分层，弃去水相；(4)将有机相过无水硫酸钠干燥，转入浓缩瓶，40°C减压浓缩至干；(5)将浓缩瓶置于_20°C冰箱低温贮藏10_14h，待瓶壁上丁布粗晶析出完全，用l-30mL乙酸乙酯洗涤转移晶体，溶解于l-30mL40°C的丙酮中，加入正己烷，2次重结晶后， 得到粉红色丁布晶体。所述玉米种子黑暗培养条件为温度25士2°C，湿度80%，黑暗条件，培养基质为蛭石。所述玉米种子为农大364、中单观、平玉5或农大108。本发明的有益效果1、操作步骤简单，直接采用乙酸乙酯环己烷混合提取剂提取， 浓缩干燥后，两次重结晶即可得到高纯度的丁布晶体；且方法简便易操作；不要求操作者具有过高的专业技能。2、提取过程中，直接以乙酸乙酯环己烷混合剂为提取剂，替换了具有高毒性的乙醚，最大程度的减少了提取过程对操作者健康的不利影响。3、提取过程中，直接以乙酸乙酯环己烷混合剂为提取剂，取消了现有方法中采用水做提取剂，在保证提取效率的同时，最大程度的减少了丁布在水溶液中的降解。4、与现有方法相比，本方法减少了有机溶剂的使用量，降低了方法成本，实用性强。
具体实施例方式下面以具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1玉米中活性次生代谢物-丁布的提取方法，按照如下步骤进行(1)将农大364玉米种子在温度25士2°C，湿度80%，蛭石培养基质，黑暗条件下培养，6天后收获玉米黄化苗lOOOg，取地上部分，置于-20°C保存备用；(2)将乙酸乙酯和环己烷按照体积比0.02 1混合，制成有机相，将-20°C保存的玉米黄化苗解冻，加入2500mL，高速勻浆3min，室温下静置0. 5h ；(3)将勻浆物用纱布过滤后再用滤纸过滤，滤液转移至分液漏斗，室温静置0. 5h， 待有机相和水相分层，弃去水相；(4)将有机相过无水硫酸钠干燥，转入浓缩瓶，40°C减压浓缩至干；(5)将浓缩瓶置于_20°C冰箱低温贮藏10h，待瓶壁上丁布粗晶析出完全，用8ml乙酸乙酯洗涤转移晶体，溶解于8ml 40°C的丙酮中。合并后，加入正己烷重结晶，2次重结晶后，得到粉红色丁布晶体0. 48g，纯度为93%。实施例2玉米中活性次生代谢物-丁布的提取方法，按照如下步骤进行(1)将中单28玉米种子在温度25士2°C，湿度80%，蛭石培养基质，黑暗条件下培养，7天后收获玉米黄化苗800g，取地上部分，置于-20°C保存备用；( 将乙酸乙酯和环己烷按照体积比1 1混合，制成有机相，-20°C保存的玉米黄化苗解冻，加入有机相1500mL，高速勻浆5min，室温下静置Ih ；(3)将勻浆物用纱布过滤后再用滤纸过滤，滤液转移至分液漏斗，室温静置lh，待有机相和水相分层，弃去水相；(4)将有机相过无水硫酸钠干燥，转入浓缩瓶，40°C减压浓缩至干；(5)将浓缩瓶置于_20°C冰箱低温贮藏12h，待瓶壁上丁布粗晶析出完全，用3ml乙酸乙酯洗涤转移晶体，溶解于:3ml 40°C的丙酮中。合并后，加入正己烷重结晶，2次重结晶后，得到粉红色丁布晶体0. 36g，纯度为91 %。
实施例3玉米中活性次生代谢物-丁布的提取方法，按照如下步骤进行(1)将平玉5玉米种子在温度25士2°C，湿度80 %，蛭石培养基质，黑暗条件下培养，8天后收获玉米黄化苗llOOg，取地上部分，置于-20°C保存备用；( 将乙酸乙酯和环己烷按照体积比10 1混合，制成有机相，-20°C保存的玉米黄化苗解冻，加入有机相2200mL，高速勻浆8min，室温下静置池；(3)将勻浆物用纱布过滤后再用滤纸过滤，滤液转移至分液漏斗，室温静置池，待有机相和水相分层，弃去水相；(4)将有机相过无水硫酸钠干燥，转入浓缩瓶，40°C减压浓缩至干；(5)将浓缩瓶置于-20°C冰箱低温贮藏12h，待瓶壁上丁布粗晶析出完全，用20mL 乙酸乙酯洗涤转移晶体，溶解于20mL 40°C的丙酮中，合并后，加入正己烷重结晶，2次重结晶后，得到粉红色丁布晶体0. 41g，纯度为90%。实施例4玉米中活性次生代谢物-丁布的提取方法，按照如下步骤进行(1)将农大108玉米种子在温度25士2°C，湿度80%，蛭石培养基质，黑暗条件下培养，9天后收获玉米黄化苗1200g，取地上部分，置于-20°C保存备用；( 将乙酸乙酯和环己烷按照体积比99 1混合，制成有机相，-20°C保存的玉米黄化苗解冻，加入有机相2500mL，高速勻浆lOmin，室温下静置池；(3)将勻浆物用纱布过滤后再用滤纸过滤，滤液转移至分液漏斗，室温静置池，待有机相和水相分层，弃去水相；(4)将有机相过无水硫酸钠干燥，转入浓缩瓶，40°C减压浓缩至干；(5)将浓缩瓶置于-20°C冰箱低温贮藏14h，待瓶壁上丁布粗晶析出完全，用30mL 乙酸乙酯洗涤转移晶体，溶解于30mL 40°C的丙酮中，合并后，加入正己烷重结晶，2次重结晶后，得到粉红色丁布晶体0. 46g，纯度为91 %。参考文献1. Baldwin, I. Τ. ；Schultz, J. C. , Rapid changes in tree leaf chemistry induced by damage :evidence for communication between plants. Science 1983,221, (4607)，277.2.Alborn,H. ；Turlings,Τ. ； Jones, Τ. ；Stenhagen,G. ；Loughrin,J. ；Tumlinson, J. , An elicitor of plant volatiles from beet armyworm oral secretion. Sciencel997，276， (5314),945.3. Tipton, C. L. ；Klun, J. A. ；Husted, R. R. ；Pierson, Μ. D. , Cyclic Hydroxamic Acids and Related Compounds from Maize Isolation and Characterization. Biochemistry 1967，6， (9)，2866-2870.4. Cuevas, L. ；Niemeyer, H. Μ. ；Jonsson, L. , Partial purification and characterization of a hydroxamic acid glucoside[beta]-d-glucosidase from maize. Phyytochemistry 1992，31，(8)，2609—2612. 5. ffahlroos, 0 . ；Virtanen, A . I . , The precursors of 6-Methoxy-benzoxazolinone in Maize and Wheat Plants, their Isolation and Someof their Properties. ActaChem. Scand 1959，13，(9),1906-1908.6. Hamilton，R. H. ；Bandurski , R. S. ；Reusch, W. H.，Isolation and Characterization of a Cyclic Hydroxamate from Zea mays. Cereal Chem 1962，39， 107-113.7. Klun, J. ；Tipton，C. ；Brindley, Τ.，2，4_Dihydroxy-7_methoxy-1， 4-benzoxazin-3-one (DIMBOA), an active agent in the resistance of maize to the European corn borer.J. Econ. Entomol 1967，60，(6)，1529-1533.8. Woodward, M. D. ；Corcuera，L J. ；Helgeson，J. P. ；Upper，C. D.，Decomposition of 2，4-Dhydroxy-7-methoxy-2H-l,4-benzoxazin-3(4H)-onein Aqueous Solutions. Plant Physiol. 1978,61,796-802.9. Glawischnig，E. ；Eisenreich，W. ；Bacher, Α. ；Frey, Μ. ；Gierl，Α.， Biosynthetic origin of oxygen atoms in dimboa from maize :NMR studies with 1802*1.Phytochemistry 1997，45， (4),715-718.10. Ahman, I. ；Johansson, Μ. , Effect of light on DIMBOA-glucoside concentration in wheat(Triticum aestivum L.). Ann. Appl. Biol. 1994,124,569-574.11. Larsen,E. ；Christensen,L. P. , Simple Method for Large Scale Isolation of the Cyclic Arylhydroxamic Acid DIMBOA from Maize(Zea mays L.). J. Agric. Food Chem. 2000,48，(6),2556-2558.
权利要求
1.一种玉米中活性次生代谢物-丁布的提取方法，其特征在于，按照如下步骤进行(1)将玉米种子在黑暗条件下培养，2-15天后收获玉米黄化苗800-1200g，取地上部分，置于-20°C保存备用；(2)将乙酸乙酯和环己烷按照体积比(0.01-99) 1混合，制成有机相，-20°C保存的玉米黄化苗解冻，加入有机相1500-2500mL，高速勻浆3-lOmin，室温下静置0. 5-2h ；(3)将勻浆物用纱布过滤后再用滤纸过滤，滤液转移至分液漏斗，室温静置0.5-池，待有机相和水相分层，弃去水相；(4)将有机相相过无水硫酸钠干燥，转入浓缩瓶，40°C减压浓缩至干；(5)将浓缩瓶置于_20°C冰箱低温贮藏10-14h，待瓶壁上丁布粗晶析出完全，用l-30mL 乙酸乙酯洗涤转移晶体，溶解于l_30mL 40°C的丙酮中，加入正己烷，2次重结晶后，得到粉红色丁布晶体。
2.根据权利要求1所述一种玉米中活性次生代谢物-丁布的提取方法，其特征在于，所述玉米种子黑暗培养条件为温度25士2°C，湿度80%，黑暗条件，培养基质为蛭石。
3.根据权利要求1所述一种玉米中活性次生代谢物-丁布的提取方法，其特征在于，所述玉米种子为农大364、中单观、平玉5或农大108。
全文摘要
本发明公开了属于植物次生代谢物提取制备技术领域的一种玉米中活性次生代谢物-丁布的提取方法。该方法利用玉米黄化苗，通过乙酸乙酯环己烷混合提取液提取，浓缩干燥，两次重结晶即可得到高纯度的丁布晶体。本发明的方法操作简单、在满足较高收率，高纯度丁布晶体的同时，实现了节省溶剂，降低成本和实验操作危害的目标。
文档编号C07D265/36GK102250034SQ201110126290
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月16日 优先权日2011年5月16日
发明者刘新刚, 孔志强, 徐军, 李晶, 李远播, 田迎迎, 董丰收, 路彩虹, 郑永权, 郭力群 申请人:中国农业科学院植物保护研究所