一种澳洲坚果总rna的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种澳洲坚果总RNA的提取方法，该方法首先以澳洲坚果为供试材料，采集幼嫩叶片，通过预处理、抽提、沉淀、洗涤、去DNA及电泳检测，获得澳洲坚果总RNA。通过本发明的方法获得的澳洲坚果总RNA纯度高、完整性好，缩短了抽提时间，为澳洲坚果的基因克隆和分子水平遗传分析奠定基础。
【专利说明】
一种澳洲坚果总RNA的提取方法
技术领域
[0001]本发明涉及澳洲坚果生物技术领域，具体涉及澳洲坚果总RNA的提取方法。
【背景技术】
[0002]提取木本植物高质量RNA是进行其分子生物学研究的重要环节。目前，常用提取植物总RNA的方法有:改良CTAB法、Trizol法和热硼酸盐法，这三种方法大多适用于草本植物，对于木本植物则适用性不大。澳洲坚果属于山龙眼科，是一种原产于澳洲的树生坚果，享有“干果之王”的美誉。但是澳洲坚果作为一种木本植物，其组织细胞内成分复杂，含有较多的多糖、多酚等次生代谢物质，这些物质的存在对提取完整性好、纯度高的RNA带来困扰。而且，到目前为止本领域中尚未见澳洲坚果总RNA提取方法的相关报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于为了解决探索澳洲坚果分子育种方面的关键技术问题，提供一种澳洲坚果总RNA提取方法。
[0004]本发明实现过程如下:
[0005]—种澳洲坚果总RNA的提取方法，该方法包括以下步骤:
[0006]I)称取澳洲坚果叶片用液氮将其研磨成粉末后转至离心管中，迅速加入预热的2X CTAB于离心管中，在50?75°C的温度条件下进行水浴；
[0007]2)待步骤I)完成后，立即加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)于步骤I)的离心管中，在3?5°C、10000?12000印111的条件下离心12?18111；[11;
[0008]3)将步骤2)的上清液转入新的离心管中，重复步骤2);
[0009]4)将步骤3)的上清液转入新的离心管中，加入LiCl溶液，在-85?-70°C温度条件下沉淀；
[0010]5)待步骤4)完成后，在3?5°C、10000?12000rpm的条件下离心25?40min，弃上清，用乙醇洗涤沉淀，吹干，加入30?50yL DEPC水溶解RNA;
[0011]6)待步骤5)完成后，进行去DNA处理后保存。
[0012]其中，步骤I)中采用新鲜的、幼嫩的澳洲坚果叶片。步骤I)中2X CTAB的配方为:CTAB 2g、NaCl 8.18g、10mL IM Tris-HCl和4mL 0.5M EDTA配制10mL的2XCTAB。步骤I)中加入2XCTAB后先进行剧烈振荡25?40s再进行水浴，水浴时间为5?7min。
[0013]步骤2)中加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)后，先进行剧烈振荡、开盖放气，然后再进行离心处理。
[0014]步骤4)中LiCl的加入浓度为8.0mol/L，沉淀后LiCl的最终浓度为4.0mol/L，沉淀时间为0.9?1.2h。
[0015]步骤5)中用乙醇洗涤沉淀需要在冰上操作；先用500yL75 %乙醇洗涤沉淀I次、再用500yL无水乙醇洗涤沉淀I次;5)中溶解RNA的DEPC水浓度为0.1 %。
[0016]步骤6)中去DNA处理的反应体系:5XgDNA Eraser Buffer 4.0yL、g DNA Eraser2.0yL、总RNA 10yL，补足RNase Free H2O至20yL，反应程序:42°C、2min。
[0017]本发明的有益效果:本发明是在无核糖核酸酶的条件下进行澳洲坚果总RNA的提取。在本领域中，植物组织总RNA的提取易受到多糖、多酚的干扰，而通过本发明的方法获得的澳洲坚果总RNA纯度高、完整性好，缩短抽提时间，为澳洲坚果的基因克隆和分子水平遗传分析开辟一条新的道路。
【具体实施方式】
[0018]为加深对本发明理解，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。在本发明基础上作出的修改或改进，若对本领域技术人员是显而易见的，则属于本发明要求保护的范围。以下内容中如涉及数量或比例，如无特别说明，均表示质量单位或质量比例。
[0019]实施例1:
[0020]该澳洲坚果总RNA的提取方法，采用澳洲坚果为试验材料，通过适宜的预处理、抽提、沉淀、洗涤、去DNA及电泳检测，获得澳洲坚果总RNA。
[0021]步骤1、材料预处理
[0022]选取澳洲坚果品种Own ChoiCe(0.C)为供试材料，采取澳洲坚果幼嫩叶片和成熟叶片，经灭菌ddH20洗涤后，用灭菌滤纸吸干，分别称取叶片0.2g放入研钵中，用液氮将其研磨成粉末后转至2.0mL的离心管中，迅速加入600yL、800yL、I OOOyL预热的2 X CTAB于离心管中，立即剧烈振荡30s，65°C水浴4min、6min、8min。
[0023]步骤2、抽提
[0024]立即加入1/5体积、1/2体积、等体积的氯仿/异戊醇(24:1)于步骤I)的离心管中，4°C、11 ,OOOrpm离心15min，需剧烈振荡、开盖放气。
[0025]步骤3、将步骤2的上清液转入新的2.0mL的离心管中重复步骤2。
[0026]步骤4、沉淀
[0027]将步骤3的上清液转入新的1.5mL的离心管中，加入1/3体积、等体积的LiCl，_80°C冰箱中沉淀30111；[11、111、211。
[0028]步骤5、洗涤
[0029]待步骤4完成后，4 °C、11，OOOrpm离心30min，弃上清，用500yL75 %乙醇洗涤沉淀2次，或用500yL75%乙醇洗涤沉淀I次、再用500yL无水乙醇洗涤沉淀I次；吹干，加入30yLDEPC水溶解RNA。
[0030]步骤6、消除基因组DNA
[0031]待步骤5完成后，进行去DNA处理，电泳检测其完整性，并保存于-80°C备用。消除基因组DNA的体系为:5 XgDNA Eraser Buffer 4.0yL、g DNA Eraser 2.0yL、总RNA 10yL，补足RNase Free H2O至20yL，反应程序:42°C、2min。
[0032]实施例2:
[0033]该澳洲坚果总RNA的提取方法，采用澳洲坚果为试验材料，通过适宜的预处理、抽提、沉淀、洗涤、去DNA及电泳检测，获得澳洲坚果总RNA。
[0034]步骤1、材料预处理
[0035]选取澳洲坚果品种Ikaika(333)为供试材料，采取新鲜的、幼嫩的澳洲坚果叶片，经灭菌ddH20洗涤后，用灭菌滤纸吸干，分别称取叶片0.2g放入研钵中，用液氮将其研磨成粉末后转至2.0mL的离心管中，迅速加入600yL、800yL、100yL预热的2 XCTAB于离心管中，立即剧烈振荡358，60°(^水浴4111；[11、6111；[11、8111；[11。
[0036]步骤2、抽提
[0037]立即加入1/5体积、1/2体积、等体积的氯仿/异戊醇(24:1)于步骤I)的离心管中，5°C、12，OOOrpm离心12min，需剧烈振荡、开盖放气。
[0038]步骤3、将步骤2的上清液转入新的2.0mL的离心管中重复步骤2。
[0039]步骤4、沉淀
[0040]将步骤3的上清液转入新的1.5mL的离心管中，加入1/3体积、等体积的LiCl，-85°C冰箱中沉淀30111；[11、111、211。
[0041 ]步骤5、洗涤
[0042]待步骤4完成后，5 °C、12，OOOrpm离心30min，弃上清，用500yL75 %乙醇洗涤沉淀2次，或用500yL75%乙醇洗涤沉淀I次、再用500yL无水乙醇洗涤沉淀I次；吹干，加入50yLDEPC水溶解RNA。
[0043]步骤6、消除基因组DNA
[0044]待步骤5完成后，进行去DNA处理，电泳检测其完整性，并保存于-80°C备用。消除基因组DNA的体系为:5 XgDNA Eraser Buffer 4.0yL、g DNA Eraser 2.0yL、总RNA 10yL，补足RNase Free H2O至20yL，反应程序:45°C、2min。
[0045]当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
【主权项】
1.一种澳洲坚果总RNA的提取方法，其特征在于包括以下步骤: 1)称取澳洲坚果叶片用液氮将其研磨成粉末后转至离心管中，迅速加入预热的2XCTAB于离心管中，在50?75 °C的温度条件下进行水浴； 2)待步骤I)完成后，立即加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)于步骤I)的离心管中，在3?5°C、10000?12000印111的条件下离心12?18111；[11; 3)将步骤2)的上清液转入新的离心管中，重复步骤2); 4)将步骤3)的上清液转入新的离心管中，加入LiCl溶液，在-85?-70°C温度条件下沉淀； 5)待步骤4)完成后，在3?5°C、10000?12000rpm的条件下离心25?40min，弃上清，用乙醇洗涤沉淀，吹干，加入30?50yL DEPC水溶解RNA； 6)待步骤5)完成后，进行去DNA处理后保存。2.根据权利要求1所述的澳洲坚果总RNA的提取方法，其特征在于:步骤I)中采用新鲜的、幼嫩的澳洲坚果叶片。3.根据权利要求1所述的澳洲坚果总RNA的提取方法，其特征在于:步骤I)中2X CTAB的配方为:CTAB 2g、NaCl 8.18g、10mL IM Tris-HCl和4mL0.5M EDTA配制10mL的2XCTAB。4.根据权利要求1所述的澳洲坚果总RNA的提取方法，其特征在于:步骤I)中加入2XCTAB后先进行剧烈振荡25?40s再进行水浴，水浴时间为5?7min。5.根据权利要求1所述的澳洲坚果总RNA的提取方法，其特征在于:步骤2)中加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)后，先进行剧烈振荡、开盖放气，然后再进行离心处理。6.根据权利要求1所述的澳洲坚果总RNA的提取方法，其特征在于:步骤4)中LiCl的加入浓度为8.0moI/L，沉淀后LiCl的最终浓度为4.0moI/L，沉淀时间为0.9?1.2h。7.根据权利要求1所述的澳洲坚果总RNA的提取方法，其特征在于:步骤5)中用乙醇洗涤沉淀需要在冰上操作；先用500yL75 %乙醇洗涤沉淀I次、再用500yL无水乙醇洗涤沉淀I次;5)中溶解RNA的DEPC水浓度为0.1 %。8.根据权利要求1所述的澳洲坚果总RNA的提取方法，其特征在于:步骤6)中去DNA处理的反应体系:5XgDNA Eraser Buffer 4.0yL、g DNA Eraser2.0yL、总RNA 1yLjhMRNaseFree H2O至20yL，反应程序:42°C、2min。
【文档编号】C12N15/10GK106047867SQ201610693058
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月20日
【发明人】刘荣, 范建新, 刘清国, 韩树全, 王代谷
【申请人】贵州省亚热带作物研究所