专利名称：一种5-羟甲基糠醛完全抗原的合成方法
技术领域：
本发明涉及5-羟甲基糠醛完全抗原，特别是涉及一种5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术：
5-羟甲基糠醛(又名5-羟甲基-2-糠醛、羟甲基糠醛、5-羟甲基呋喃甲醛或5-羟甲基-2-呋喃甲醛)，英文名5-hydrOXymethyl-2-furfural或5-HMF，为针状结晶、暗黄色液体或粉末，甘菊花味，有吸湿性，易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等；可溶于乙醚、苯、氯仿等；微溶于四氯化物；难溶于石油醚，是一种重要的化工原料。其分子中有一个醛基和一个羟甲基，可以通过加氢、氧化脱氧、酯化、卤化、聚合、水解以及其它化学反应，用于合成许多有用化学物和新型高分子材料，包括医药、树脂类塑料等。然而，据有关文献报道5-羟甲基糠醛对人体横纹肌和内脏有损害，同时也是导致神经性疾病的主要因素，其在食品药品中的大量存在会严重危害人体健康，世界卫生组织已经对蜂蜜中5-羟甲基糠醛的含量加以控制，中国药典也对葛根素葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛的含量有非常严格的控制。因此，通过检测进而控制食品药品中5-羟甲基糠醛的含量具有重要的现实意义。目前，国内外有关检测5-羟甲基糠醛的方法主要有比色法、紫外法以及高效液相色谱法(HPLC)。比色法中由于5-羟甲基糠醛并非葡萄糖注射液变色的唯一因素，该法专属性和准确性较差；紫外法对被测样品的浓度，各个国家有不同的要求，没有统一的标准，很难确定最终的检测结果；使用高效液相色谱法，虽然可以非常准确的测出样品中5-羟甲基糠醛的含量，但是，此法需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，对被检材料要求较高，样品预处理及操作过程复杂，费时又费力，已经不能满足现代检测对方便、快速、准确的要求。目前，国内尚无使用免疫快速检测法检测食品药品中5-羟甲基糠醛含量的报道，为了弥补这一空白，为今后人们在免疫检测方面的研究提供材料，设计了以5-羟甲基糠醛为半抗原的合成可用于免疫检测用的5-羟甲基糠醛完全抗原。
发明内容
针对现有仪器检测技术的缺点和不足，本发明的目的是提供一种5-羟甲基糠醛完全抗原的制备方法，所制备的产品可用于食品药品中5-羟甲基糠醛含量的免疫检测，为后续研究、开发及应用提供必需的人工抗原。本发明是以5-羟甲基糠醛为半抗原，用戊二醛为连接臂将半抗原与牛血清白蛋白结合在一起，制备5-羟甲基糠醛的人工抗原，即5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白。本发明的目的通过如下技术方案实现。—种5-羟甲基糠醛完全抗原的合成方法，包括如下步骤(I)A液的配制将5-羟甲基糠醛溶解于戊二醛水溶液中，配成5-羟甲基糠醛质量浓度为0. lg/L 5g/L的混合液，在10°C 60°C条件下反应0. Ih 3h，制备A液；(2)B液的配制将牛血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，配成牛血清白蛋白浓度为 0. lg/L 10g/L 的 B 液；(3)人工抗原的合成在搅拌条件下，将B液滴加到A液中，在温度为10°C 60°C条件下反应0. Ih 证，得到人工抗原混合液；(4)透析将人工抗原混合液装入能透过分子量为IkDa IOOkDa的透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析1天 5天；透析结束后，干燥，得到5-羟甲基糠醛完全抗原。为进一步实现本发明，所述的戊二醛水溶液的浓度优选0. Imol/L 1. 0mol/L,pH2 7。所述步骤⑵和步骤(4)的磷酸盐优选磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和磷酸二氢钾中的一种或两种。所述步骤(2)和步骤(4)所述的磷酸盐缓冲液的浓度优选0. 07 0. 25mol/L,pH为 7. 0 7. 9。所述搅拌优选磁力搅拌或电动搅拌。所述干燥优选冷冻干燥或真空干燥。与现有技术相比，本发明具有以下优点产率高采用戊二醛作为5-羟甲基糠醛与牛血清白蛋白结合的连接臂，克服了5-羟甲基糠醛与牛血清白蛋白直接偶联速度慢、效率低的缺点，极大提高了 5-羟甲基糠醛与牛血清白蛋白的偶联速度和效率，使5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原的产率提
尚ο稳定性好采用戊二醛作为5-羟甲基糠醛与牛血清白蛋白结合的连接臂，最大程度地保护了 5-羟甲基糠醛分子中的活性基团醛基(-CH0)，保留了 5-羟甲基糠醛的生物活性，从而提高了 5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原的稳定性。可用于食品及药品中5-羟甲基糠醛含量的免疫检测采用戊二醛法合成的5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原，最大程度地保留了 5-羟甲基糠醛的生物活性，所以能与5-羟甲基糠醛相应的抗体很好的进行特异性结合，可以作为ELISA免疫检测中包被抗原的使用，也可以用于5-羟甲基糠醛快速检测试纸条中T线的包被材料，故可用于食品及药品中5-羟甲基糠醛含量的快速免疫检测，具有很好的应用前景。
图1为实施例1中5-羟甲基糠醛完全抗原制备前后的紫外扫描图。图2为实施例2中5-羟甲基糠醛完全抗原制备前后的紫外扫描图。图3为实施例3中5-羟甲基糠醛完全抗原制备前后的紫外扫描图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。实施例1将15mg的5_羟甲基糠醛溶解于5mL，浓度为1. Omol/L, pH为2的戊二醛水溶液中，配制成5-羟甲基糠醛质量浓度为3. Og/L的混合液，在30°C下反应1.证，制备A液；将20mg的牛血清白蛋白溶解于5mL，浓度为0. 2mol/L,pH为7. 4的磷酸盐缓冲液
4(0. 2mol/L的磷酸二氢钠与0. 2mol/L的磷酸氢二钠水溶液按体积比81 19配置)中，配制成牛血清白蛋白质量浓度为4. Og/L的B溶液，放置于4°C冰箱中保存；在磁力搅拌器的充分搅拌A液的同时，将B液缓慢滴加到A液中，使两者充分反应，在10°C下反应5h，反应完成后，即得到人工抗原混合液；将人工抗原混合液装入能透过分子量为50kDa的透析袋中，用浓度为0. 2mol/L,pH为7. 4的磷酸盐缓冲液(0. 2mol/L的磷酸二氢钠与0. 2mol/L的磷酸氢二钠水溶液按体积比81 19配置)透析1天，每隔1 更换一次磷酸盐缓冲液；透析结束后，将人工抗原混合液进行冷冻干燥，即得到人工抗原5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白产品。5-羟甲基糠醛人工抗原的鉴定采用紫外分光光度计测定其紫外扫描图谱。本实施例中5-羟甲基糠醛完全抗原制备前后的紫外扫描图如附图1所示。从图中可以看出牛血清白蛋白在^Onm左右出现吸收峰，5-羟甲基糠醛在^Onm左右出现吸收峰，另外在280nm左右出现一更强吸收峰，峰值比牛血清白蛋白比5-羟甲基糠醛的吸收峰要高，认为这是5-羟甲基糠醛与牛血清白蛋白成功偶联后峰相互迭加的结果，说明已成功合成5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原。产率的计算产率是评价一个反应合成效率的一个重要的指标，产率高说明此化学反应合成效率高，反之则称合成效率低。产率=实际得到的产物的质量(g) X 100%/理论上产物的质量(g)。经检测，本实施例计算得产率为78.3%，说明本法合成5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原的效率较高。稳定性试验将本法制备的5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原溶液置于4°C冰箱中1-3个月，观察其是否出现沉淀或絮状物。3个月后，观察其溶液状态，依然为澄清的溶液，说明本法合成的5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原具有很好的稳定性。本实施例制备的5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原不仅产率高，稳定性好，而且保留了 5-羟甲基糠醛的生物活性，能与5-羟甲基糠醛相应的抗体很好的进行特异性结合，可以作为ELISA免疫检测中包被抗原的使用，也可以用于5-羟甲基糠醛快速检测试纸条中T线的包被材料，故可用于食品及药品中5-羟甲基糠醛含量的快速免疫检测，具有很好的应用情景。实施例2将IOmg的5-羟甲基糠醛溶解于10mL，浓度为0. lmol/L, pH为5的戊二醛水溶液中，配制成5-羟甲基糠醛质量浓度为0. lg/L的混合液，在10°C下反应0. lh，制备A液；将IOmg的牛血清白蛋白溶解于10mL，浓度为0. 07mol/L,pH为7. 0的磷酸盐缓冲液(0. 07mol/L的磷酸氢二钠与0. 07mol/L的磷酸二氢钾水溶液按体积比3 2配置)，配制成牛血清白蛋白质量浓度为0. lg/L的B溶液，放置于4°C冰箱中保存；在电动搅拌器的充分搅拌A液的同时，将B液缓慢滴加到A液中，使两者充分反应，在30°C下反应3h，反应完成后，即得到人工抗原混合液；将人工抗原混合液装入能透过分子量为IOkDa的透析袋中，用浓度为0. 07mol/L,pH为7. 0的磷酸盐缓冲液(0. 07mol/L的磷酸氢二钠与0. 07mol/L的磷酸二氢钾水溶液按体积比3 2配置)透析3天，每隔1 更换一次磷酸盐缓冲液；透析结束后，将人工抗原混合液进行真空干燥，即得到人工抗原5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白产品。本实施例5-羟甲基糠醛完全抗原制备前后的紫外扫描图如附图2所示。从图中可以看出牛血清白蛋白在^Onm左右出现吸收峰，5-羟甲基糠醛在^Onm左右出现吸收峰， 另外在^Onm左右发现一更强吸收峰，峰值比牛血清白蛋白比5-羟甲基糠醛的吸收峰要高，认为这是5-羟甲基糠醛与牛血清白蛋白成功偶联后峰相互迭加的结果，说明已成功合成HMF-BSA完全抗原。本实施例计算得5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白人工抗原的产率为74. 5%。实施例3将25mg的5_羟甲基糠醛溶解于5mL，浓度为0. 5mol/L, pH为7的戊二醛水溶液中，配制成5-羟甲基糠醛质量浓度为5. Og/L的混合液，在60°C下反应池，制备A液；将IOOmg的牛血清白蛋白溶解于10mL，浓度为0. 25mol/L, pH为7. 9的磷酸缓盐冲液(0. 25mol/L的磷酸氢二钠水溶液)，配制成牛血清白蛋白质量浓度为10. Og/L的B溶液，放置于4°C冰箱中保存；在磁力搅拌器的充分搅拌A液的同时，将B液缓慢滴加到A液中，使两者充分反应，在60°C下反应0. Ih,反应完成后，即得到人工抗原混合液；将人工抗原混合液装入能透过分子量为IOOkDa的透析袋中，用浓度为0. 25mol/ L, pH为7. 9的磷酸缓盐冲液(0. 25mol/L的磷酸氢二钠水溶液)透析5天，每隔1 更换一次磷酸盐缓冲液；透析结束后，将人工抗原混合液进行真空干燥，即得到人工抗原5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白产品。本实施例5-羟甲基糠醛完全抗原制备前后的紫外扫描图如附图3所示。从图中可以看出牛血清白蛋白在^Onm左右出现吸收峰，5-羟甲基糠醛在^Onm左右出现吸收峰，另外在^Onm左右发现一更强吸收峰，峰值比牛血清白蛋白比5-羟甲基糠醛的吸收峰要高， 认为这是BSA与HMF成功偶联后峰相互迭加的结果，说明已成功合成5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白完全抗原。本实施例计算得5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白人工抗原的产率为84. 5%。将本发明制备的5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白应用于制备可以检测食品药品中 5-羟甲基糠醛的免疫层析试纸条，具体步骤如下①制备羟甲基糠醛多克隆抗体。步骤一将Img 5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白溶解于Iml质量分数为0. 9%的NaCl溶液中，再与Iml弗氏完全佐剂充分乳化后，按照每千克实验动物家兔注射0. 5mg羟甲基糠醛-牛血清白蛋白的剂量进行兔背部皮下多点注射； 步骤二 间隔14天后，将Img羟甲基糠醛-牛血清白蛋白溶解于Iml质量分数为0.9%的 NaCl溶液中，再与Iml的弗氏不完全佐剂充分乳化后，按照每千克实验动物家兔注射0. 5mg 羟甲基糠醛-牛血清白蛋白的剂量进行兔背部皮下多点注射，然后每隔14天重复步骤二 1 次，共重复3次。最后一次免疫十天后，对兔子进行颈静脉取血，分离血清，用饱和硫酸铵法沉淀抗体，并用亲和层析法纯化分离羟甲基糠醛抗体。用间接酶联免疫吸附法(ELISA)法检测出多抗的效价为1 1观000。②荧光胶乳标记羟甲基糠醛抗体和兔IgG。荧光胶乳标记羟甲基糠醛抗体和兔免疫球蛋白G (兔IgG)。取0. Iml质量浓度为10%的荧光胶乳微球(颜色为黄色，粒径为 0. 5 μ m，激发波长为600歷)，用0. 9ml, 0. Imol/LpH 6的MES缓冲液将荧光胶乳微球的浓度调整为1 %，然后顺序加入5mgEDC和5mg Sulfo-N HS活化，室温下温和搅拌30min，活化结束后，溶液在IOOOrpm转速下离心30min，沉淀用0. Imo 1/L pH 6的PBS缓冲液溶解，经超声重悬后，分别加入40 μ 1质量浓度为10mg/ml兔IgG (ZI103-1兔IgG，上海信然生物技术有限公司)和步骤①制备的羟甲基糠醛多克隆抗体，经振荡器均勻混合后，室温下温和搅拌反应3h，反应结束后，溶液在IOOOrpm转速下离心30min，沉淀用溶解有0. 05 % Tween 20 的PBS缓冲液(0. Imo 1/L pH 7. 0)重复清洗三次以除去未标记上的蛋白，IOOOrpm转速下离心30min，沉淀用0. lmol/L，pH 7. 4同时溶解有牛血清白蛋白和0. 05% Na3N的PBS缓冲液重新溶解，经超声重悬后，放置于4°C冰箱中待用，此时经过荧光胶乳标记的羟甲基糠醛抗体和兔IgG的终浓度为0. 3mg/ml。③制备荧光胶乳垫。用0. lmol/L，pH 7. 4同时溶解有牛血清白蛋白和0. 05% Na3N的PBS缓冲液将步骤②制备的荧光标记的羟甲基糠醛多克隆抗体和兔IgG同时稀释 100倍，按质量比为1 500的比例均勻混合，将其混合液均勻喷涂至聚酯纤维膜(SB06上海金标生物有限公司)上，将聚酯纤维膜置于室温下干燥36h，备用。④制备包被膜。用0. lmol/L,pH为7. 4的PBS缓冲液将羟甲基糠醛-牛血清白蛋白质量浓度调整为2mg/ml，羊抗兔IgG(上海信然生物技术有限公司)的质量浓度调整为 0. 25mg/ml，将羟甲基糠醛完全抗原和羊抗兔IgG分别均勻喷涂于硝酸纤维素膜上的不同区域，形成条带状的检测区和质控区，其中检测区和质控区间隔5mm，将包被膜放置于50°C 烘箱中干燥36h，备用。⑤制备免疫层析试纸条。以聚乙烯塑料板为支持底板，按从左到右的顺序，顺次将样品垫搭接于荧光胶乳垫上距离荧光胶乳垫左边边缘2mm处，荧光胶乳垫搭接于包被膜 (检测区在左，质控区在右)上距离包被膜左边边缘2mm处，吸水纸搭接于包被膜上距离包被膜右边边缘2mm处，并切割成0. 4cm宽，7. 7cm长的试纸条。将制备的免疫层析试纸条用于检测食品及药品中5-羟甲基糠醛的含量，结果表明，此免疫层析试纸条的测定结果与液相色谱法的测定结果接近，时间仅为5min，说明本法合成的5-羟甲基糠醛完全抗原可用于食品及药品中5-羟甲基糠醛的快速免疫检测。
权利要求
1.一种5-羟甲基糠醛完全抗原的合成方法，其特征在于包括如下步骤(1)A液的配制将5-羟甲基糠醛溶解于戊二醛水溶液中，配成5-羟甲基糠醛质量浓度为0. lg/L 5g/L的混合液，在10°C 60°C条件下反应0. Ih 3h，制备A液；(2)B液的配制将牛血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，配成牛血清白蛋白浓度为0. lg/L 10g/L 的 B 液；(3)人工抗原的合成在搅拌条件下，将B液滴加到A液中，在温度为10°C 60°C条件下反应0. Ih 证，得到人工抗原混合液；(4)透析将人工抗原混合液装入能透过分子量为IkDa IOOkDa的透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析1天 5天；透析结束后，干燥，得到5-羟甲基糠醛完全抗原。
2.根据权利要求1所述的一种5-羟甲基糠醛完全抗原的合成方法，其特征在于所述的戊二醛水溶液的浓度为0. lmol/L 1. Omol/L, pH为2 7。
3.根据权利要求1所述的一种5-羟甲基糠醛完全抗原的合成方法，其特征在于所述步骤( 和步骤的磷酸盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和磷酸二氢钾中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述的一种5-羟甲基糠醛完全抗原的合成方法，其特征在于步骤(2)和步骤(4)所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0. 07 0. 25mol/L, pH为7. 0 7. 9。
5.根据权利要求1所述的一种5-羟甲基糠醛完全抗原的合成方法，其特征在于所述搅拌为磁力搅拌或电动搅拌。
6.根据权利要求1所述的一种5-羟甲基糠醛完全抗原的合成方法，其特征在于所述干燥为冷冻干燥或真空干燥。
全文摘要
本发明涉及一种5-羟甲基糠醛完全抗原的合成方法，该方法将5-羟甲基糠醛溶解于戊二醛水溶液中，配成5-羟甲基糠醛质量浓度为0.1g/L～5g/L的混合液，在10℃～60℃条件下反应0.1h～3h，制备A液；将牛血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，配成牛血清白蛋白浓度为0.1g/L～10g/L的B液；在搅拌条件下，将B液滴加到A液中，在温度为10℃～60℃条件下反应0.1h～5h，得到人工抗原混合液。本发明以5-羟甲基糠醛为半抗原，用戊二醛为连接臂将半抗原和牛血清白蛋白结合在一起，制备5-羟甲基糠醛-牛血清白蛋白，合成步骤简洁，有效，可用于食品及药品中5-羟甲基糠醛的快速检测。
文档编号C07K14/765GK102382189SQ201110228269
公开日2012年3月21日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年8月10日
发明者于淑娟, 俞思明, 吴鑫兰, 管永光 申请人:华南理工大学