专利名称：使用固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法
技术领域：
本发明涉及多肽药物合成技术领域，具体涉及一种固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法。
背景技术：
普兰林肽(Pramlitide,结构见式1,2-7 ; 二硫键)是一种人工合成的胰淀素(Amylin，淀粉不溶素)类似物，其结构特征为胰淀素第25位(丙氨酸)、第28位(丝氨酸)和第29位(丝氨酸)的氨基酸分别用脯氨酸替代。它充分保留了内源性胰淀 素的生理作用，克服了人胰淀素在溶液中不稳定、易水解、易凝集的物理特性。临床研究表明，普兰林肽可抑制胰高糖素的释放，延缓胃排空及抑制摄食；与胰岛素联合应用，能有效地控制血糖、减轻体重、减少胰岛素用量。普兰林肽最早由美国Amylin Pharmaceuticals公司研制,于2005年3月16号获得美国FDA批准，适用于使用胰岛素但无法达到预期疗效的I型和II型糖
尿病患者的辅助治疗。
1 I5 I101520
H-Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Glo-Arg-Ley-AIa-Asn-Fhe-Ieu-Val-His-Ser-Ser-
25303Sρ,
Asn-Asn Phe-G1y-Pro-lfe-Leu-Pro Pro*Thr-Asn V3l Gly*Ser Asii-Thr-Tyr-NH2
式⑴已知普兰林肽的合成可以通过固相合成法(W0-A-93/10146，US-A-5424394，CN102206266A, CN101747426A)，将C端酪氨酸的羧基以共价键的形式固定在不溶性树脂上，再以此氨基酸的氨基为起点，依次缩合氨基酸，延长肽链，在树脂上完成肽链的合成后，氧化第2位和第7位半胱氨酸的巯基形成分子内二硫键，再将该肽链从树脂上切割下来并脱除侧链保护基，最终制备得到普兰林肽。很显然，对于含有37个氨基酸的普兰林肽来说，这一合成途径需要重复几十步偶联和脱保护步骤，合成路线冗长，操作工艺繁琐；且随着肽链的延长和可能存在的二级结构的影响，缩合效率越来越差，导致杂质变多且难以分离，目标产物收率极低,成本很高,不适合工业化生产。使用固相和液相结合的片段缩合技术，适合于合成含有较长氨基酸序列的多肽，其优点在于副产物较少且易于纯化，产物纯度高。然而，片段缩合策略有时会受阻于(i)有增加消旋的危险；(ii)大的保护片段溶解度差；(iii)片段间的低缩合率并伴有副反应发生的危险。为了消除或减少消旋，一般选择Gly或Ρι·ο作为片段的C端残基，如果不能实现这一点，则选择Ala或Arg作为C端残基，因为它们不易消旋。在应用片段缩合策略时，对目标序列进行合理的分段可以大大改善结果。除了合理选择C端残基，尽量减少消旋的风险，还应考虑在固相上合成的片段的纯度要高，溶解性要好；参与缩合的片段的C端和N端残基的空间位阻要小，以提高片段间的缩合率。普兰林肽由37个氨基酸残基组成，因而存在许多种可能的片段和缩合顺序，例如CN101824086A 采用 1-8 (片段 1),9-19 (片段 2)，20_28 (片段 3)，29_37 (片段 4)四个片段，以(4+ (3+2))+1的顺序缩合的方法；CN102164608A (同族专利US2010/0081788A1)报道的方法与之类似，采用1-8 (片段1)，9-19 (片段2)，20-29 (片段3)，30_37 (片段4)四个片段，从C端到N端((4+3)+2)+1顺序依次缩合；CN101790535A(同族专利W02009/00366A1)报道了采用1-12 (片段1)，13-24 (片段2)，25-37 (片段3)三个片段从C端到N端顺序缩合的方法；CN102180943A则采用1-16 (片段1)，17_28 (片段2)，29_37 (片段3)三个片段从C端到N端依次缩合的方法。以上片段缩合合成策略中，前两种方法中第19位Ser (C端)和第20位Ser (N端)以及第四种方法中第16位Leu (C端)和第17位Val (N端)均不是理想的断点，因为在实际操作中这些片段间的缩合效率不高；第三种方法虽然断点选择较为合适，但片段3在固相合成上纯度不佳，将影响片段缩合反应效率。鉴于普兰林肽重要的药学应用价值，有必要提供更有效的普兰林肽合成方案，能 够克服以上方法的缺陷并适合工业规模的生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新的普兰林肽的制备方法，该方法能够克服现有制备方法的不足与缺陷，并适合工业化生产。本发明中普兰林肽的制备方法，采用的是固相合成片段和片段液相缩合的组合技术。首先利用固相化学在树脂载体上合成普兰林肽的4个侧链保护的中间体片段肽片段a(1-12)，片段b (13-20)，片段c (21-28)，片段d (29-37)，然后在液相中将侧链保护的中间体片段肽缩合，最后脱除氨基端及侧链保护基得到普兰林肽。本方法中选择了适宜的4个片段肽，通过常规固相合成法均可以高效率、高产率、高纯度的获得各个片段肽；各个片段肽在液相缩合体系中溶解度高，且参与缩合的片段的C端和N端空间位阻小，缩合产率高，产物易于纯化。具体而言，本发明提供的普兰林肽制备方法，包括以下步骤(I) 利用固相化学方法，以氨基树脂为载体，合成侦U链保护的肽中间体片段a =AA29-AA37-氨基树脂，片段a的实例
2937
Fr ioc-Pro-Thr(P)-Asn{Tft)-Vaf-Gly-Ser{lBu)-Asn(Trl)-Thf(tBuI-Tyr(IBυ)- Μ· 脂;氨基树脂的实例为9-FmoC-氨基咕吨_3_氧基聚苯乙烯树脂[9-Fmoc-Aminoxanthen -3 - yloxy -polystyrene (Sieber Amide 树月旨)]或9-Fmoc-氨基咕吨-3-氧基乙酸甲基树脂(9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-acetamidomethylResin)。(2)利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段b :AA21-AA28-二苯甲基树脂,片段b的实例21 28 (
Fmoc- Asr (Tr{)-Asii{Trl)-Phe-Gly-Pro-|}e-Leu-Pro·:.木111 —. 树胎(3)利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段c :AA13-AA2(I-二苯甲基树脂,片段c的实例
1320
Fnioc-Aia-Asn(Trt)-Phe-Leu-VaI-Hisdrt}-Ser(fBuI-Ser(P)-: -: $ Φ MWlM(4)利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体，然后形成2，7 二硫桥键，得到肽中间体片段d =AA1-AA12-三苯甲基树脂，片段d的实例
1 [...........................................................................................................................I12 .…
K-LystBoc}-Cys-Asn(Trt|-T{ir(P}-Aia-Thr(P)-Cys-Aia-Thr(tBu}-Gin(TrtJ-Arg(Pbf)-Leu-￡ $ 中'M; iNf 脂片段a、c、d中P表示伪脯氨酸保护基(ΨΜε’ Me Pro)或tBu保护基，优选伪脯氨酸保护基(ΨΜε’ Me Pro);片段d中的K表示Fmoc保护基或者Boc保护基，优选Boc保护基。合成2，7 二硫桥键的环化试剂的实例是用I2，溶剂为DMF，环化时间为l_4h，环化温度为15-25°C。步骤⑵、⑶、⑷中的三苯甲基树脂实例为2-氯-三苯甲基氯树脂(CTC树脂)，氯化三苯甲基树脂，4-甲基氯化三苯甲基树脂或4-甲氧基氯化三苯甲基树脂。片段合成采用常规固相合成肽的方法(SPPS)。例如，步骤(1)-(4)中可以采用在树脂上依肽序逐步偶联保护氨基酸，偶联体系为DIEA与H0Bt，H0At或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合与HBTU，HATU, PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上的组合组成的偶联体系。(5)将侧链保护的肽中间体片段a、b、C、d从树脂上裂解下来，在溶液中进行缩合反应，得到侧链保护肽(d-c-b-a)；液相缩合的方法可以参考Shumpei Sakakibara的文献Chemical Synthesis ofProteins in Solution (Biopolymers(Peptide Science),. 1999; 51(4) : 279-296),例如所用的溶剂可以为NMP或DMF，偶联体系为DCC与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合，或者DIEA与H0Bt，H0At或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合与HBTU, HATU, PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上的组合组成的缩合体系。(6)脱除侧链保护肽(d-c-b-a)的氨基端保护基和侧链保护基，得到普兰林肽粗肽；(7)经纯化后得到普兰林肽。本发明中所使用的术语“伪脯氨酸(Pseudoprolines)”是指脯氨酰环中CyH2基被氧或硫原子所取代的脯氨酸类似物(CN101472939A)。伪脯氨酸是丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸与醛或者酮环化缩合而成。本发明实施例中用到的丝氨酸和苏氨酸的伪脯氨酸二肽结构如下
权利要求
1.一种利用固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法，普兰林肽结构式如式I所示，
2.根据权利要求I所述的方法，步骤(I)中所用的氨基树脂为9-Fmoc-氨基咕吨-3-氧基聚苯乙烯树脂[9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-polystyrene (Sieber Amide树脂)]或9-Fmoc-氨基咕吨-3-氧基乙酸甲基树脂(9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy_acetamidomethyl Resin),优选 Sieber Amide 树月旨。
3.根据权利要求I所述的方法，步骤(2)-(4)中所用的三苯甲基树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂(CTC树脂)，氯化三苯甲基树脂，4-甲基氯化三苯甲基树脂或4-甲氧基氯化三苯甲基树脂，优选CTC树脂。
4.根据权利要求I所述的方法，步骤(1)-(4)采用在树脂上依肽序逐步偶联保护氨基酸，偶联体系为DIEA与H0Bt，H0At或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合与HBTU，HATU, PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上的组合组成的偶联体系。
5.根据权利要求I所述的方法，步骤(4)合成2，7两个半胱氨酸的二硫桥键的环化试剂是I2，溶剂为DMF，环化时间为l_4h，环化温度为15-25°C。
6.根据权利要求I所述的方法，步骤(5)中所用的溶剂为NMP或DMF，缩合体系为DCC与H0Bt，H0At或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合，或者DIEA与H0Bt，H0At或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合与HBTU，HATU,PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上的组合组成的缩合体系。
7.根据权利要求I所述的方法，步骤(5)- )中脱除氨基端Fmoc保护基的方法在含有哌啶的DMF或NMP的溶液中进行。
8.根据权利要求I所述的方法，步骤(5)包括(5. 1)将片段a从树脂上裂解下来，脱除氨基端保护基；将片段b从树脂上裂解下来，二者在溶液中缩合，得到片段(b-a)； (5. 2)脱除片段(b-a)的氨基端保护基，与从树脂上裂解下来的c片段在溶液中缩合，得到片段(c-b-a); (5. 3)脱除片段(c-b-a)的氨基端保护基，与从树脂上裂解下来的d片段在溶液中缩合，得到侧链保护肽(d-c-b-a)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中 片段(b_a)是
10.根据权利要求I所述的方法，其中 片段a是
全文摘要
本发明涉及利用固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法，所述方法包括利用固相化学分别合成1-12，13-20，21-28和29-37四个肽中间体片段，然后利用液相化学缩合得到普兰林肽。通过本发明路线制备普兰林肽，操作步骤简短，后处理简单，副产物少，产率高，污染小，适合大规模的工业化生产。
文档编号C07K14/00GK102816213SQ20121017139
公开日2012年12月12日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者苏贤斌, 缪李鹏, 毛怡春, 王蔡典, 董海军 申请人:南京工业大学, 南京英沛生物技术有限公司