专利名称：一种双水相气浮溶剂浮选分离/富集痕量氯霉素的方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，涉及一种分离/富集食品中痕量氯霉素的方法，尤其涉及一种双水相气浮溶剂浮选分离/富集痕量氯霉素的方法。
背景技术：
氯霉素(CAP)是由委内瑞拉链丝菌产生的抗生素，氯霉素类抗生素可作用于细菌核糖核蛋白体的50S亚基，而阻挠蛋白质的合成，属抑菌性广谱抗生素。氯霉素对革兰阳性、阴性细菌均有抑制作用，且对后者的作用较强，其中对伤寒杆菌、流感杆菌、副流感杆菌和百日咳杆菌的作用比其他抗生素强，对立克次体感染如斑疹伤寒也有效。如果氯霉素在食用动物中残留，可通过食物链传给人类，对人类的健康造成危害。氯霉素能抑制骨髓造血功能造成过敏反应，引起包括白细胞减少、红细胞减少、血小板减少等在内的再生障碍性贫血，此外还可引起肠道菌群失调及抑制抗体的形成，该药已在国外较多国家禁用。因此， 建立一个有效快速的方法来分离/富集食品中的氯霉素类药物很有必要。样品分析最重要的环节是样品的前处理，它对分析方法的可靠性、准确性有重要影响。由于环境样品具有被测物浓度低、组分复杂、干扰物多，故一般都要经过前处理才能进行分析测定。目前，氯霉素类抗生素残留的前处理方法主要为液-液萃取法、固相萃取法、基质固相分散萃取法、固相微萃取法、超临界萃取法、加压溶剂萃取法、超声波提取法和双水相萃取法。其中最常用的是固相萃取法，但是固相萃取使用有机溶剂，对环境污染较大，并且解吸附过程操作非常耗时。因此，需要建立一种高效、无毒、无污染的绿色分离/富集方法。双水相体系是一类新型萃取分离体系，它是由两种聚合物或一种聚合物和一种盐的水溶液在一定浓度下混合自发形成的两相体系，具有无毒、无污染、萃取条件温和、样品易分离、操作简单等优点。与传统的双水相萃取体系相比，小分子醇-盐双水相体系使用的有机溶剂成本低且易于蒸发回收，分相时间短，萃取过程不易乳化。Sebba于1962年首次提出溶剂浮选(Solvent Sublation,简称SS),是指将一定量非极性、弱极性或混合有机溶剂加在待浮选溶液的表层，直接将目标物浮选至上相。与常规分离方法相比，具有设备简便、操作简单、浓缩分离快、富集倍数高(通常达IO4)、耗能低等特点，尤其适用于处理大量试样和分离富集极稀溶液中的痕量成分。本发明建立了一种全新的样品前处理体系-小分子醇双水相气浮溶剂浮选法(ATSS)，该方法是将小分子醇双水相萃取与气浮溶剂浮选相耦合，将气浮溶剂浮选的气泡传质方式引入到小分子醇双水相体系中而形成的一种新的分离技术。
发明内容
小分子醇双水相气浮溶剂浮选法分离/富集食品中氯霉素(CAP)，是以低成本的小分子醇一正丙醇代替传统的有机溶剂和聚合物作为浮选溶剂，以磷酸氢二钾(K2HPO4)作为盐析剂，利用惰性气体N2对氯霉素进行分离/富集的方法。特指以正丙醇为浮选剂，以无机盐磷酸氢二钾(K2HPO4)作为分相的盐析剂，在惰性气体N2的作用下基于双水相气浮溶剂浮选法(Aqueous two-phase solvent sublation, ATSS)分离/富集食品中痕量氯霉素的方法。本发明的具体内容一种双水相气浮溶剂浮选法分离/富集痕量氯霉素的方法，是以小分子醇为浮选齐U，以无机盐作为分相的盐析剂，以一定流速的氮气浮选一定时间后，移取上层有机相，用高效液相检测法在波长276nm处测定氯霉素含量，其中，所述的小分子醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮中的一种；所述的无机盐为磷酸氢二钾。在本发明的一个较优实施例中，所述的小分子醇为正丙醇。 在本发明的一个较优实施例中，所述的磷酸氢二钾浓度为O. 6^1. Og · mL'优选O. 85g · mL 1O在本发明的一个较优实施例中，所述的氮气流速为l(T50mL · mirT1，优选3OmL · mirT1。在本发明的一个较优实施例中，所述的浮选时间为l(T60min，优选40min。在本发明的一个较优实施例中，所述的正丙醇的体积为I飞mL，优选2mL。本发明集小分子醇双水相萃取优点(样品易分离、操作简单、适用于极性和弱极性及非极性物质的分离/富集等)和气浮浮选优点(高富集倍数、高选择性、有机溶剂用量少、适合大剂量样品分离/富集等)于一体，改变了有机溶剂只能浮选非极性物质的局限性，富集倍数高、选择性好。可以应用于分离/富集样品中的痕量氯霉素。双水相浮选最佳条件的选择一、有机溶剂的选择选择一种合适的有机溶剂是双水相浮选的一个重要因素，小分子醇双水相浮选是将一层小分子醇加在待分离物质试液的表面，该小分子醇应具有能很好地溶解被浮选捕集成分、密度小、粘度小等特点。小分子醇主要是指甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮等。由于甲醇和丙酮毒性大，且甲醇分相困难，所以发明中验证了乙醇、正丙醇、异丙醇三种有机溶剂对CAP浮选率的影响。固定上相体积加入量为3mL，实验结果如图I所示。当K2HPO4的浓度分别为O. 3,0. 4,0. 5g · mL-1时，才能与正丙醇、异丙醇、乙醇形成双水相体系。从图中可以看出，在这三个体系中，随着K2HPO4浓度的增加，CAP的浮选率也增大；当K2HPO4的浓度为O. 90g · mL—1时，CAP的浮选率达到最大值；然后随着K2HPO4浓度继续增加，CAP的浮选率降低。这是因为当K2HPO4的浓度很高时，下相盐溶液的粘度也相应的增大，使得在上升气泡的空气-水界面上的CAP转移能力减弱，从而CAP的浮选率下降。在正丙醇-K2HPO4双水相体系中，CAP的浮选率始终大于异丙醇/乙醇-K2HPO4双水相体系，发明人最终选择正丙醇作为双水相浮选的有机溶剂。二、K2HPO4浓度对CAP浮选率的影响从图I中可以看出，当K2HPO4的浓度小于O. 6g πιΓ1时，CAP的浮选率均小于40%，所以在这部分发明人选择实验K2HPO4的浓度范围为O. 6^1. Og 结果如图2，随着K2HPO4浓度增加，CAP浮选率不断增大，在K2HPO4浓度为O. 75g · mL—1时CAP浮选率大于90% ;在K2HPO4浓度为O. 85g · mL—1时CAP浮选率达到最大值95. 87% ;随后CAP浮选率随K2HPO4浓度增加而降低。发明人选择K2HPO4的浓度为O. 85g · mL-1进行后续实验。三、浮选时间对CAP浮选率的影响浮选时间对CAP浮选率的影响结果见图3，随着浮选时间的增加，CAP的浮选率升高；当浮选时间为50min时，CAP的浮选率最大(95. 82%);浮选时间为60min时，CAP浮选率略有下降。这是由于随着浮选时间的增加，上升的气泡和CAP分子之间有足够的接触时间，这样目标物吸附在气泡表面的几率就会增加，因此通过气泡吸附从下相转移到上相的CAP的量也会增加，即CAP浮选率增加。CAP吸附在气泡表面随气泡移动到界面后小的气泡开始聚集成较大的气泡，当气泡足够大时就会穿过界面到达上相，气泡在上相表层与空气接触后破裂释放出CAP，CAP便会溶解在上相有机溶剂中；但是，有些气泡未穿过界面便会破裂，CAP会重新溶解在下相盐溶液中，同时一部分溶解在上相的CAP会重新穿过界面返回下相盐溶液中。从图3可以看出，长时间的浮选并不会使浮选率一直增加，反而会稍有下降，而且浮选时间越长成本也会增加。因此从浮选率和节约成本考虑，发明人选择40min作为浮 选的最佳时间。四、浮选流速对CAP浮选率的影响浮选流速从l(T50mL · mirT1中选择5个流速进行考察，从图4得出，浮选流速从IOmL · mirT1增长到30mL · mirT1的过程中，CAP浮选率呈上升趋势，并在30mL · mirT1时达到最大值96. 35%。因为浮选流速的增加使得气泡数量增加，即气泡的表面积增大，CAP吸附在气泡上的机会就会相应的增加，这样CAP的浮选率也会提高。然而随着浮选流速继续增大，CAP浮选率反而略有下降。这是因为流速过大时，上下相界面的混乱度就会增大，在浮选上相就会存在一个边缘合并层，使得吸附在气泡表面的目标浮选物不能与上相浮选溶剂接触，而直接从边缘合并层重新返回至下相盐溶液，由此CAP的浮选率会有不同程度的降低，故发明人选择浮选流速最佳为30mL · mirT1。五、CAP浓度对浮选率的影响在其他条件保持不变的情况下，发明人选取ri20ng · mL^CAP来讨论CAP的浓度对浮选率的影响。实验结果如图5所示，不同浓度的CAP浮选后得到的浮选率都保持在93. 32^94. 21%范围内，由此明显可见，CAP的浓度对浮选率几乎没有影响，也就是说CAP的浮选率不会因它本身浓度的改变而变化。在本发明中，发明人固定CAP浓度为40ng · mL—1来讨论其他因素对浮选率的影响。六、正丙醇体积对CAP浮选率的影响有机溶剂的体积变化不仅影响CAP的浮选率，同时对它的分配系数也有很大的影响。由图6可见随着正丙醇体积的增加，CAP的浮选率一直在升高。正丙醇体积由ImL到2mL, CAP浮选率从89. 16%升高到95. 20% ;之后随着正丙醇体积继续增加，CAP的浮选率缓慢升高。与此同时，CAP的分配系数却随着正丙醇体积的增加而减小。正丙醇体积为ImL或2mL时，CAP的分配系数大于500 ;正丙醇体积大于2mL时，CAP分配系数小于350。虽然正丙醇体积增大，浮选至上相中的CAP的量有所增加，但是正丙醇体积的改变远大于上相中CAP的量的改变，所以上相中CAP的浓度减小，而下相中CAP的浓度变化不大，因此反而使得CAP的分配系数减小。考虑到正丙醇体积变化对CAP浮选率和分配系数的影响，发明人选择2mL作为最佳正丙醇体积。
有益效果本发明与小分子醇双水相萃取技术相比，具有富集倍数大，可同时处理大量试样、选择性好、无毒、分离效果好、成本低，且具有设备简单、灵敏度高、测量快速、提取物后处理简便等特点。
图I有机溶剂的选择图2K2HP04浓度对CAP浮选率的影响图3浮选时间对CAP浮选率的影响图4浮选流速对CAP浮选率的影响·
图5CAP浓度对浮选率的影响图6正丙醇体积对CAP浮选率的影响图7浮选实际样品HPLC-UV色谱图(a)未加标的牛肉；(b)加标2ng · mL^CAP标准工作液的牛肉；(c)加标2ng · Hir1CAP标准工作液的牛奶；⑷加标2ng · mL^CAP标准工作液的奶粉
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细说明，以使本领域技术人员更好地理解本发明，但本发明并不局限于以下实施例。实施例实际样品分析(I)在磨口比色管中，加入40ι^·πι ΛΑΡ的标准溶液，溶液体积VCAP:V总=1 50 (V为浮选时溶液总体积)；(2)加入固体磷酸氢二钾(K2HPO4)调节溶液的离子强度，振荡充分溶解，使其浓度为 O. 85g · mL 1 ;(3)将上述溶液转移至浮选池中，加入2mL浮选溶剂正丙醇，N2浮选流速为30mL · mirT1，浮选40min，停止通气静置lOmin，待无气泡时用滴管移取出上层有机相，用高效液相检测法在波长276nm处分析测定其含量。在本发明所确定最优化的实验条件下，对三个实际样品(牛肉，牛奶，奶粉)进行了分析，经检测发现三个实际样品中都未检测出CAP。表I表示实际样品的加标回收率，可以看出回收率为91. 53 103. 95%，相对标准偏差为O. 17 I. 50%，表明此方法回收率是非常令人满意的。表I实际样品中CAP的分析结果
权利要求
1.一种双水相气浮溶剂浮选分离/富集痕量氯霉素的方法，是以小分子醇为浮选剂，以无机盐作为分相的盐析剂，以一定流速的氮气浮选一定时间后，移取上层有机相，用高效液相检测法在波长276 nm处测定氯霉素含量，其特征在于 所述的小分子醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮中的一种；所述的无机盐为磷酸氢二钾。
2.根据权利要求I所述的双水相气浮溶剂浮选分离/富集痕量氯霉素的方法，其特征在于，所述的小分子醇为正丙醇。
3.根据权利要求I所述的双水相气浮溶剂浮选分离/富集痕量氯霉素的方法，其特征在于，所述的磷酸氢二钾浓度为O. 6^1. O g-mL—1，优选O. 85 g-mL'
4.根据权利要求I所述的双水相气浮溶剂浮选分离/富集痕量氯霉素的方法，其特征在于，所述的氮气流速为10 50 mL.mirT1,优选30 mL.mirT1。
5.根据权利要求I所述的双水相气浮溶剂浮选分离/富集痕量氯霉素的方法，其特征在于，所述的浮选时间为l(T60min,优选40min。
6.根据权利要求2所述的双水相气浮溶剂浮选分离/富集痕量氯霉素的方法，其特征在于，所述的正丙醇的体积为I飞mL，优选2mL。
7.权利要求I所述的方法用以分离/富集痕量氯霉素的应用。
全文摘要
本发明公开了一种双水相气浮溶剂浮选分离/富集痕量氯霉素的方法，属于分析化学领域。本发明是以小分子醇为浮选剂，以无机盐作为分相的盐析剂，以一定流速的氮气浮选一定时间后，移取上层有机相，用高效液相检测法在波长276nm处测定氯霉素含量。本发明集小分子醇双水相萃取优点(样品易分离、操作简单、适用于极性和弱极性及非极性物质的分离/富集等)和气浮浮选优点(高富集倍数、高选择性、有机溶剂用量少、适合大剂量样品分离/富集等)于一体，改变了有机溶剂只能浮选非极性物质的局限性，富集倍数高、选择性好。
文档编号C07C233/18GK102895803SQ201210297880
公开日2013年1月30日 申请日期2012年8月21日 优先权日2012年8月21日
发明者李艳芳, 闫永胜 申请人:江苏大学