专利名称：一种玉米赤霉烯酮的竞争elisa无毒检测方法
技术领域：
本发明涉及化合物检测领域，具体涉及一种玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法。
背景技术：
玉米赤霉烯酮(Zenralenone, ZEN)是由多种镰刀菌产生的一种类雌激素样的真菌毒素，污染范围广泛，谷实类原料在田间、收获过程、收获后储藏期间以及饲料和食品成品储存、使用等诸多环节，都有可能受到ZEN的污染。ZEN具有较强生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对猪、家禽、反刍动物均影响较大，给畜牧业带来很大经济损失；ZEN还具有细胞毒性、免疫毒性、肝毒性、潜在致癌性等，并且ZEN对高温稳定，不易去除，严重危害人类健康。鉴于玉米赤霉烯酮对人类及其他动物具有较强的毒性作用，2000年JECFA公布了·人类对于ZEN的临时最大摄入量为40 μ g/ kg体重。截至2004年，已有27个国家或地区对ZEN在食品和饲料中的含量进行了限制，而且该数目还在继续增加之中。2006年7月I日欧盟实施的EEC 253/ 2004法规明确细分了不包含玉米的未加工谷物、谷粉、快餐和早餐食品的ZEN最大限量为100、75和50 μ g/ kg，还规定了以加工谷物为主要成分的婴幼儿食品ZEN最大限量为20 μ g/ kg。我国2006年饲料卫生标准规定玉米类饲料中ZEN最大含量为500 μ g/kg，而粮食卫生标准规定ZEN不超过60 μ g/kg。目前，免疫检测方法已成为食品安全快速检测的重要方法之一，在食品安全检测中发挥了重要作用。ZEN是一种小分子毒素，目前用于ZEN残留定量检测的免疫学方法需使用ZEN标准品，ZEN标准品的使用不仅给操作人员带来危害，同时也增加了环境中有毒有害物质的排放，因此，寻求ZEN的替代物用于ZEN的无毒检测具有重要的现实意义。β型抗独特型抗体(β-Anti- idiotype antibody, β-Aid or Ab2 β )具有与初始(半)抗原相同抗原决定簇的“内影像”作用，可以替代小分子物质。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，利用ZEN的β型抗独特型单抗替代ZEN标准品，提供一种玉米赤霉烯酮竞争ELISA无毒检测方法及其应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的
本发明一种玉米赤霉烯酮竞争ELISA无毒检测方法，它是以检测抗原ZEN-BSA包被96孔酶标板，加入ZEN的β型抗独特型单抗(Ab20-1D5)的标准品竞争物或待测样品(疑是有ZEN污染的食品、谷物、饲料等处理试样)，再加入ZEN单克隆抗体(Abl-1G4)，检测抗原ZEN-BSA与游离的Ab2 β -1D5或游离的ZEN竞争结合ZEN单克隆抗体，洗去游离的Ab2 β -1D5与Abl-1G4- Ab2 β -1D5复合物或ZEN与Abl_lG4_ZEN复合物，与包被抗原ZEN-BSA结合的Abl-1G4再与酶标记的二抗结合，经底物显色后终止反应，用酶标仪测定各孔的吸光度(0D)。OD值越大，样品中自由的ZEN含量越少，对照标准品所得的曲线回归方程，计算样品中ZEN的含量。该方法的特征是具有以下检测过程和步骤
I. ZEN单克隆抗体(Abl-1G4)的制备
采用活泼酯法将ZEN与OVA偶联制备免疫抗原，ZEN与BSA偶联制备检测抗原，免疫BALB/c小鼠，细胞融合，经过筛选后获得杂交瘤细胞，通过小鼠体内诱生法大量制备腹水型ZEN单克隆抗体；分泌ZEN单克隆抗体的杂交瘤细胞1G4G10D3于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO :C201237。2. ZEN抗独特型单抗(Ab2P-lD5)的制备
ZEN单克隆抗体与KLH偶联，偶联物免疫BALB/c小鼠，经血清效价和灵敏度检测合格后，再进行偶联物腹腔注射，3天后取小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，用HAT或HT选择培养基培养融合细胞，同时采用间接ELISA和间接竞争ELISA法筛选阳性克隆，得到杂交瘤细胞株1D5 ;通过小鼠体内诱生法大量制备腹水型ZEN抗独特型单抗；杂交瘤细胞株1D5于2012 年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO :C201238。3.腹水型ZEN单克隆抗体、ZEN抗独特型单抗的纯化
腹水经饱和硫酸铵沉淀法初纯后，再用Protein G亲和层析柱进行纯化。(I)饱和硫酸铵粗纯
①从_20°C冰箱中取6.5 mL腹水，4°C缓慢融化，12000r/min离心30min，取上清；
②在冰浴搅拌下，逐滴加入6.5 mL饱和硫酸铵溶液，4°C放置过夜；
③7500r/min离心30min,弃上清,沉淀用6. 5 mL O. IM结合缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH 7. O)溶解，混匀；
将上述抗体溶液装入已处理过的透析袋，在层析柜中，结合缓冲液透析6h以上，每隔2h更换一次透析液。(2)上柱前的处理
抗体用20mM结合缓冲液稀释5倍，用O. 45 μ m滤膜超滤后再上Protein G柱。(3)装柱及过柱
①装柱垂直安置柱体，接好恒流泵管，并用结合缓冲液填充柱子，进行平衡柱子，大约5-10倍柱体积，平衡完毕后将核酸蛋白检测仪调零；
②上样用恒流泵进样，将样品泵入柱子，进样时注意不要有气泡；
③清洗用约10倍柱体积结合缓冲液清洗柱子至核酸蛋白检测仪数值不再变化；
④洗脱用5倍柱体积洗脱缓冲液(O.IM Gly-HCl, pH 2. 7)洗脱，此时的峰为免疫球蛋白峰，收集目的产物，待核酸蛋白检测仪数值开始变化时进行收集，待数值降至最低时停止收集，并在收集过程中不停地加入适量中和液(60-200uL，lM Tris-HCl，pH 9. O) JfpH调至7. O ；
⑤平衡用约10倍柱体积结合缓冲液平衡柱子；
⑥用约5倍柱体积20%乙醇清洗柱子，盖好柱子两头盖子，储存于4°C冰箱；
⑦浓缩收集的抗体用50kD的超滤管，4°C，5000g离心超滤；
⑧用Iml左右的PBS将抗体从超滤管上冲下来，分装保存于-20°C。取少量的样品进行抗体浓度及纯度的测定。(4)纯化抗体浓度的测定
应用BCA 蛋白定量试剂盒测定抗体的浓度。
(5)纯化抗体纯度的鉴定 应用SDS-PAGE鉴定腹水纯化效果。4. ZEN毒素与ZEN抗独特型单抗间相关性的建立
采用间接竞争ELISA分别建立ZEN和Ab2 β -1D5的标准抑制曲线
①包被缓冲液将ZEN-BSA稀释至IPg/mL，100 μ L/孔，37 °C孵育3 h ；
②弃反应液，300μ PBST洗板3次，3 min/次；
③加入200μ 5%脱脂奶粉封闭，37°C孵育I h;④弃反应液，300μ PBST洗板3次，3 min/次；
⑤加入50μ 不同浓度的ZEN标准品(0-50ng)或不同浓度Ab20-1D5 (0-2.48 μδ),同时加入50μ 浓度为O. 025Pg/mL的ZEN单克隆抗体，37°C孵育I h ；
⑥弃反应液，300μ PBST洗板3次，3 min/次；
⑦加入100μ 1:4000稀释的!11^标记羊抗鼠186，371孵育40 min ；
⑧弃反应液，300μ PBST洗板5次，3 min/次；
⑨加入100μ TMB底物，避光显色10 min ；
⑩加入50μ 2Μ硫酸终止反应，酶标仪测定0D450值。依据实验结果绘制ZEN及Aid -1D5的标准抑制曲线及相应的线性回归方程。同时根据抑制率在20%-80%间，在相同抑制率条件下，ZEN与抗ZEN抗独特型单抗间浓度对应关系，绘制替代标准曲线及对应的线性回归方程，作为定量换算公式。5.预包被条的制备
(1)包被用包被缓冲液即ΡΗ9.6的O. 05Μ碳酸钠缓冲液将检测抗原ZEN-BSA稀释至IKg/mL，每孔100 μ L加入到聚苯乙烯微孔板中，37°C孵育3h ；
(2)洗涤倒出微孔板孔中包被缓冲液后，用洗瓶或多通道移液器将200μI洗涤液加入孔中；3 5分钟后再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体；洗涤3飞次；所述洗涤液为 PBS-T 即含 O. 05% 吐温-20 的 O. OlM 磷酸盐缓冲液(KH2PO4 O. 2g，Na2PO4.12H20 2. 9g，NaCl 8g，定容至 1000ml, ρΗ7· 4，再加 O. 5ml 吐温-20)；
(3)封闭在微孔板每孔加入150 200μ L含O. 5% 3% BSA (牛血清白蛋白)的O. OlMPBS (磷酸盐缓冲液，ρΗ7· 4)，37°C封闭O. 5h I. 5h ;
(4)按步骤(2)洗涤微孔3 5次；
(5)加入20%蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3h；
(6)干燥微孔板干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存待用；
6.ZEN的检测
(1)每个板孔内分别加入50μ I系列浓度的ZEN的β型抗独特型单抗(Ab2i3-1D5)标准品液或处理好的食品、谷物、饲料等样品提取液到微孔中，混匀；
(2)加入50μ 浓度为O.025Pg/mL的ZEN单抗(Abl_lG4)到微孔，混合，37°C孵育I
2h ；
(3)洗涤微孔3 5次;
(4)加入100μ 1:4000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，37°C孵育40 min ；
(5)洗涤微孔3 5次；
(6)每个微孔加入IOOyL显色液TMB(3，3'，5，5'-四甲基联苯胺)底物工作液，反应10 20min ；
(7)每个微孔加入50μ L 2Μ H2SO4 (终止液)终止反应，并轻轻振荡混匀；
(8)在15min内用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD(吸光度)值；
(9)将所得标准液和样品吸光度值除以O标准(O浓度的标准液)的吸光度值再乘以100%,以此标准液计算值为纵坐标，ZEN抗独特型单抗浓度(Pg/kg)的半对数为横坐标绘制标准曲线，根据每个样品的Β/Β0值从标准曲线上读出对应的ZEN抗独特型单抗的浓度；再根据质量转换公式[y = 5901. Ix - 4.5101 (r=0. 9862)，y为ZEN浓度(ng/mL) ;x为抗独特型抗体浓度(ng/mL)]计算出对应的ZEN浓度，再乘以相应的稀释倍数，计算出样品中实际的ZEN的浓度。7.食品、谷物和饲料中玉米赤霉烯酮的分离· 食品、谷物和饲料经粉碎后使其90%通过20目网筛。称取5g加到IOOmL具塞锥形瓶中，加入25mL 70%甲醇/水溶液(v:v，70:30)。震荡器提取lOmin，提取液通过快速滤纸过滤。取ImL滤液，加4mL蒸馏水稀释，摇匀，为试样液。保藏信息
杂交瘤细胞株1D5，保藏日期2012年4月5日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号CCTCC NO :C201238。杂交瘤细胞1G4G10D3，保藏日期2012年4月5日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号CCTCC NO :C201237。
图I.ZEN的标准抑制曲线。图2.β-Ald-1D5的标准抑制曲线。图3.ZEN毒素与抗独特型抗体间浓度转换曲线。
具体实施例方式实施例I制备玉米赤霉烯酮单克隆抗体
I.免疫抗原ZEN-OVA、检测抗原ZEN-BSA的制备
采用活泼酯法将ZEN与OVA偶联制备免疫抗原(ZEN-OVA)，ZEN与BSA偶联制备检测抗原(ZEN-BSA)。ZEN 衍生为 ZEN-CMO
(I)称取6. 5mg ZEN，加入Iml吡啶，然后加入13mg O-羧甲基羟胺，室温搅拌反应24h，
最后真空抽干。(2) 4m蒸馏水溶解溶解残留物，用IM NaOH将pH调至8. O。(3)用4ml苯萃取2次，除去未反应的ZEN，然后用IM HCl将pH调至3. O。(4)用8ml乙酸乙酯萃取4次，收集萃取液，真空抽干，残留物即玉米赤霉烯酮羧甲基肟(ZEN-CMO)
ZEN-BSA 合成
Cl)制备活化酯称取3. Omg ZEN-CMO，溶入lmlDMF，然后再加入I. 8mg NHS、1. 8mgEDC,室温搅拌反应过夜，5000rpm离心lOmin，取上清获得A液。
(2)偶联用I. 2ml PBS溶解8. 6mg OVA,将A液缓慢加入OVA溶液，室温搅拌过夜。(3)透析用O. 015M, pH7. 4 PBS透析偶联物，除去为偶联的半抗原共透析3d，每天换3次透析液。透析后5000rpm离心IOmin,取上清,分装保存于_2(TC。ZEN-OVA 合成
Cl)制备活化酯称取2. 7mg ZEN-CMO，溶入Iml DMF，然后再加入I. 6mg NHS、1. 6mgEDC,室温搅拌反应过夜，5000rpm离心lOmin，取上清获得A液。(2)偶联用I. 2ml PBS溶解6. 3mg OVA,将A液缓慢加入OVA溶液，室温搅拌过
夜。 (3)透析用O. 015M，pH7. 4 PBS透析偶联物，除去为偶联的半抗原共透析3d，每天换3次透析液。透析后5000rpm离心IOmin,取上清,分装保存于_2(TC。2. ZEN单抗的制备。取3只6 8周龄健康BALB/c小鼠(购自南方医科大学动物所)，分别编号，每只小鼠每次免疫剂量为100 Pg，免疫原ZEN-OVA与等体积弗氏完全佐剂(初免)或者不完全佐齐U(加强)乳化(O. 2 mL)，背部皮下多点注射，免疫周期为14 d，每次加强免疫后7 d，断尾取血，获得血清，保存于_20°C备用。ZEN-BSA作为包被原，间接ELISA测定抗血清效价，间接竞争ELISA测定抗血清的灵敏度。经3次加强免疫，检测结果表明I号小鼠的灵敏度最高，IC50值为39. 8 ng/mL,选择I号小鼠脾脏作为脾细胞供体，细胞融合前3 d腹腔注射100 μg ZEN-OVA (O. I mL),3 d后取小鼠脾细胞(3. 75 X 108)，在50% PEG 4000作用下与骨髓瘤细胞SP2/0 (购买自中国典型培养物保藏中心)(3. 75 X IO7)进行融合，用HAT或HT选择培养基培养融合细胞，同时采用间接ELISA和间接竞争ELISA法筛选阳性克隆，经过三次克隆化，获得I株稳定分泌高灵敏度抗ZEN单抗的杂交瘤细胞，命名为1G4G10D3，其分泌的抗ZEN单抗命名为单抗1G4G10D3,简称Abl-1G4。通过小鼠体内诱生法制备腹水型单克隆抗体，具体参见文献(刘秀梵，单克隆抗体在农业上的应用，安徽科学技术出版社，1994年11月)。HAT选择培养基含有次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺U密啶脱氧核苷；HT选择培养基含有次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷。实施例2制备玉米赤霉烯酮抗独特型单抗
I.以稳定分泌高灵敏度抗ZEN单抗的杂交瘤细胞1G4G10D3分泌的单抗为免疫原，免疫小鼠，细胞融合，制备玉米赤霉纟布丽抗独特型单抗。(I)免疫原1G4G10D3-KLH偶联物制备
①将25.6 mg EDC加入4 mg/mL IgG溶液(PBS，500 PL)中，室温搅拌反应30 min ；
②将2mg/mL的KLH溶液(PBS，I mL)加入到上述溶液中，4°C搅拌反应12 tTl6 h ；
③最后的反应液用0.01M PBS透析两天，即获得免疫原mAb-KLH偶联物(SP1G4G10D3-KLH偶联物)，分装、冻存于_20°C备用。(2)单抗1G4G10D3的Fab抗体片段制备及鉴定
①饱和硫酸铵沉淀初步纯化ZEN单抗1G4G10D3，然后经ProteinG免疫亲和层析柱进一步纯化；
②在20mM醋酸盐缓冲液(pH4. 5)中，用250 μ 固定化胃蛋白酶消化10 mg纯化的ZEN单抗1G4G10D3，37°C水浴中摇动反应I h ；
③在4°C条件下，消化产物IOOOg离心3min，取上清，然后加入I.5 mL 10 mM Tris-HCl缓冲液(PH7. 5)，离心取上清，合并两次上清；
④所获得的上清通过ProteinG免疫亲和层析柱，收集流出液并浓缩，即获得抗ZEN单抗 1G4G10D3 Fab 片段；
⑤采用BCA试剂盒测定Fab蛋白浓度；用间接ELISA鉴定Fab片段活性，从表I中可以看出Fab的IC50较完整IgG降低了 3倍多，表明抗体片段的灵敏度较高，活性很好；同时用非还原SDS-PAGE鉴定Fab抗体片段，结果显示酶切片段分子量为50 kD，与抗体片段Fab大小吻合。表I ZEN单抗与抗体片段Fab特性对比
权利要求
1.一种玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法，所述方法是以ZEN-BSA、ZEN单克隆抗体和ZEN的β型抗独特型单抗建立的竞争ELISA检测方法，其中，所述ZEN单克隆抗体为Abl-1G4，由杂交瘤细胞1G4G10D3分泌，杂交瘤细胞1G4G10D3于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201237 ;所述ZEN的β型抗独特型单抗为Ab2 β-1D5，由杂交瘤细胞株1D5分泌，杂交瘤细胞株1D5于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO C201238 ； 具体检测方法包括如下步骤 (A)预包被条的制备 (1)包被用包被缓冲液即PH9.6的O. 05M碳酸钠缓冲液将检测抗原ZEN-BSA稀释至IKg/mL，每孔100 μ L加入到聚苯乙烯微孔板中，37°C孵育3h ； (2)洗涤倒出微孔板孔中包被缓冲液后，用洗瓶或多通道移液器将200μI洗涤液加入孔中，3 5min后再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，洗涤3飞次；所述洗涤液为 PBS-T ； (3)封闭在微孔板每孔加入150 200μL含O. 5% 3% BSA的O. OlM PBS，37°C封闭 O. 5h I. 5h ; (4)按步骤(2)洗涤微孔3 5次； (5)加入20%蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3h； (6)干燥微孔板干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存待用； (B)ZEN的检测 (7)每个板孔内分别加入50μ I系列浓度的ZEN的β型抗独特型单抗标准液或处理好的样品提取液到微孔中，混匀； (8)加入50μ 浓度为O.025Pg/mL的ZEN单抗到微孔，混合，37°C孵育I 2h ; (9)洗涤微孔3 5次; (10)加入100PLl :4000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，37 °C孵育40 min ； (11)洗涤微孔3 5次； (12)每个微孔加入100μ L显色液TMB底物工作液，反应10 20min ； (13)每个微孔加入50μ L 2Μ H2SO4终止反应，并轻轻振荡混匀； (14)在15min内用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD值； (15)计算出样品中实际的ZEN的浓度。
2.根据权利要求I所述的玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法，其特征在于所述检测方法用于食品、谷物或饲料中玉米赤霉烯酮污染的检测。
3.根据权利要求2所述的玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法其特征在于食品、谷物或饲料中玉米赤霉烯酮的分离方法为食品、谷物或饲料经粉碎后使其90%通过20目网筛，称取5g加到IOOmL具塞锥形瓶中，加入25mL 70%甲醇/水溶液(v: V，70:30),震荡器提取lOmin，提取液通过快速滤纸过滤，取ImL滤液，加4mL蒸馏水稀释，摇匀，为试样液。
全文摘要
本发明公开了一种玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法。本发明所述方法是利用ZEN-BSA、ZEN单克隆抗体和ZEN的β型抗独特型单抗建立的竞争ELISA方法，以ZEN的β型抗独特型单抗替代ZEN标准品，从而避免了毒素对操作者的危害及向环境中散毒的可能，实现无毒检测；该方法不需使用ZEN标准品，可大大降低成本，可以大规模地对食品、谷物和饲料等污染的玉米赤霉烯酮进行快速、灵敏的检测，因此将具有良好的市场前景。
文档编号C07D313/00GK102841203SQ20121030725
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月27日 优先权日2012年8月27日
发明者王宏, 宋其芳 申请人:暨南大学