双相柱膜蛋白质微反应器及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种可实现反应体系酸碱性置换的双相柱膜蛋白质微反应器，该微反应器以阳离子交换材料和阴离子交换材料作为固定相，将两种固定相顺序填充于同一容器内，可实现膜蛋白质样品原位捕集、pH置换、还原、烷基化、酶解的样品预处理过程。该装置具有回收率高、简单、高效、快速等优点。
【专利说明】双相柱膜蛋白质微反应器及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种双相柱膜蛋白质微反应器，可实现膜蛋白质原位富集、pH置换、还原、烷基化、酶解的样品预处理过程，并且与分离、检测系统联用，即可实现对膜蛋白质酶解产物的分离、鉴定。 【背景技术】
[0002]细胞膜是细胞对外界的屏障和细胞内外物质交换的枢纽，它将细胞与周围环境隔离开，维持细胞内环境的稳定。细胞膜蛋白质组对执行细胞内外物质交换、细胞识别与免疫应答、信号传导和调控以及能量传递等功能起着重要作用。真核生物中1/3的蛋白均整合在膜上。膜蛋白质在药物研究中也起着相当重要的作用，在已知的和正在研究的药物靶标中大约有70%为膜蛋白质。然而，由于膜蛋白质疏水性强,导致其溶解性和酶解效率较差，对目前通用的蛋白质组学技术提出了挑战。
[0003]甲酸是一种很好的膜蛋白质增溶剂，后续的酶解通常采用化学裂解剂溴化氰或酸性胃蛋白酶。然而，溴化氰是一种剧毒试剂，且只能在甲硫氨酸处裂解，产生的肽段较大，不利于质谱检测。胃蛋白酶是一种非特异性的蛋白质水解酶，因此在质谱数据检索时，产生的理论酶切肽段列表太大,对用于数据检索的服务器要求高,数据检索时间过长,数据检索的假阳性率高，严重地影响了膜蛋白质的鉴定。胰蛋白酶专一性强，酶切后得到的肽片段大小适中，分子质量在500-3000Da之间，非常适合质谱的检测范围，是蛋白质鉴定中应用最多的蛋白水解酶。因此，将甲酸的强溶解能力和胰蛋白酶的特异性酶切相结合，对于膜蛋白质分析有着重要意义。
[0004]目前，有文献通过将甲酸溶解后的膜蛋白质溶液，用碳酸氢铵调节pH至pH=8后，进行后续的蛋白质的酶解(Cruz, S.D., Xenarios, 1., Langridge, J., Vilbois, F., Parone,P.A.，Martinou, J.C.，J.Biol.Chem.2003，42，41566 41571.)。这种方法的问题在于:一、操作不方便；二、膜蛋白质的浓度被严重稀释；三、酸、碱性置换过程易造成膜蛋白质的再次析出；四、离心管内进行操作，内壁吸附损失较大；五、无法实现在线分析。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明的目的在于发展一种双相柱膜蛋白质微反应器(图1)，通过该微反应器富集膜蛋白质样品，在不稀释样品的前提下，便捷、高回收率、原位地实现膜蛋白质样品所处环境酸、碱性的置换，确保酸性条件下溶解和碱性条件下酶解的兼容(图
2)。此外，该样品预处理过程均在毛细管柱原位进行，可实现膜蛋白质样品预处理的在线、自动化操作。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0007]双相柱膜蛋白质微反应器:
[0008]包括中空的容器，于中空的容器内顺次填充阴离子交换材料、阳离子交换材料、或顺次填充阳离子交换材料、阴离子交换材料，于中空的容器内部空腔的一端或两端设置有柱塞；所述中空的容器为圆柱、圆锥或圆盘形容器，中空容器的内部空腔径向横截面直径为50u m_5cm0
[0009]容器为:20-1000 ill移液器枪头，l-20ml固相萃取(SPE)管，l_20ml注射器针管，50-500 u m内径毛细管或注射器滤膜腔体。
[0010]柱塞是在微反应器内原位合成的整体柱柱塞或孔径为3nm-20 u m的筛板。
[0011]同一容器内包含阴离子交换材料、阳离子交换材料；
[0012]阳离子交换材料为含有磺酸基团和/或磷酸基团的强阳离子交换材料、或含有羧基基团的弱阳离子交换材料；阴离子交换材料为含有季铵基团的强阴离子交换材料、或含有仲胺和/或叔胺基团的弱阴离子交换材料；材料可以是颗粒材料或者整体材料。
[0013]阳、阴离子交换材料的搭配可以是:强阳离子交换材料和强阴离子材料；强阳离子交换材料和弱阴离子交换材料；弱阳离子交换材料和强阴离子交换材料；弱阳离子交换材料和弱阴离子交换材料。
[0014]所述双相柱膜蛋白质微反应器的应用:
[0015]1)在带有柱塞的横截面直径为50μm_5cm的圆柱、圆锥或圆盘形容器内顺次填充阴、阳离子交换材料或阳、阴离子交换材料；
[0016]2)采用pH为1-7的酸性溶液或pH为大于7-14的溶有质量或体积浓度为I % -30%的表面活性剂或去垢剂的碱性溶液溶解膜蛋白质样品，将样品溶液通过微反应器实现膜蛋白质的原位捕集；
[0017]3)然后，通入pH为大于7-14的碱性溶液或pH为1_7的酸性溶液进行微反应器内溶液体系的PH值的置换；
[0018]4)之后，用还原剂进行蛋白质的还原，随后用烷基化试剂进行蛋白质的烷基化处理，最后在PH为大于7-14的碱性条件下进行蛋白质的酶解或pH为1-7的酸性条件下进行蛋白质的酶解；
[0019]5)酶解完成后，用200-2000mM的盐溶液将膜蛋白质的酶解肽段从微反应器上洗脱下来，收集洗脱液，用液相色谱法分离，质谱、紫外或荧光检测器进行检测。
[0020]pH为1-7的酸性溶液可为甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液；
[0021]表面活性剂为十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、chaps、Rapigest SF、或NP-40d ;去垢剂可为尿素、硫脲、或盐酸胍；
[0022]pH为大于7-14的碱性溶液可为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液；
[0023]溶解蛋白质的溶剂可以是pH为1-7的酸性溶剂，也可以是pH为大于7-14的碱性溶剂；
[0024]如果是酸性条件下捕集，则填装顺序为:载流液流入端为阳离子交换材料，载流液流出端为阴离子交换材料；
[0025]如果是碱性条件下捕集，则填装顺序为:载流液流入端为阴离子交换材料，载流液流出端为阳离子交换材料。
[0026]若在酸性条件下捕集，则用pH为大于7-14的碱性溶液置换pH值，溶液浓度范围在1-1OOmM之间；
[0027]若在碱性条件下捕集，则用pH为1-7的酸性溶液置换pH值，溶液浓度范围在1-1OOmM 之间。
[0028]还原剂为二硫苏糖醇(DTT)、磷酸三氯乙酯(TCEP)或(6-巯基乙醇；浓度为1-200mM。
[0029]烷基化试剂为碘代乙酸或碘乙酰胺；浓度为l_200mM ；
[0030]pH为大于7-14的碱性条件下进行蛋白质的酶解选择胰蛋白酶、内肽酶Arg-C、内肽酶lys-C、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶中的一种或几种；用量为蛋白质样品质量的1/100-1/10 ；
[0031]pH为1-7的酸性条件下进行蛋白质的酶解选择胃蛋白酶或溴化氰试剂；用量为蛋白质样品质量的1/100-1/10。盐溶液为碳酸氢铵溶液、氯化钠溶液、乙酸铵溶液、磷酸盐溶液、或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液。
[0032]膜蛋白质捕集于微反应器后，后续的膜蛋白质的还原、烷基化、酶解过程均在微反应器内原位进行。
[0033]1、双相柱膜蛋白质微反应器的构建:在一根毛细管中，原位合成整体材料作为柱塞，然后顺次填装强阴离子交换材料和强阳离子交换材料作为微反应器的固定相。
[0034]2、酸、碱性的置换:膜蛋白质样品溶解于甲酸溶液，并捕集于双相柱膜蛋白质微反应器后，通入l_50 mM碳酸氢铵缓冲液,可便捷、高回收率地将微反应器溶液体系置换为碱性环境，从而有利于后续膜蛋白质的还原、烷基化及酶解过程。反应体系酸、碱性置换过程简单、快速，同时可保持样品的高回收率。
[0035]本发明具有如下优点:
[0036]1.双相柱膜蛋白质微反应器的制备简单。在同一容器中，顺序填装保留机理具有正交性质的两种离子交换填料或原位顺序合成保留机理具有正交性质的离子交换整体材料，即可制得双相柱膜蛋白质微反应器。
[0037]2.操作方便、快捷。利用在同一容器内填装保留机理具有正交性质的两种离子交换材料，通入相应PH值的缓冲液，即可方便、高回收率地实现蛋白质样品溶解酸、碱性和蛋白质样品处理所需碱、酸性间的置换，并且用PH试纸即可检测置换过程中pH的状态。
[0038]3.高回收率。采用两种保留机理正交的离子交换材料，可保证膜蛋白质样品在pH置换过程中，很好地保留在微反应器中。从而，避免PH值置换过程中，因膜蛋白质保留行为的变化造成的损失(图3)。此外，整个样品预处理过程均在微反应器内原位进行，避免了转移、试管内壁吸附等造成的损失，回收率高(图4)。
[0039]4.利用双相柱膜蛋白质微反应器，在膜蛋白质样品无需稀释的情况下，实现了膜蛋白质的甲酸溶解和胰蛋白酶酶切两种策略的兼容。本发明使用体积分数为90%的甲酸溶解膜蛋白质，稀释至甲酸浓度至1%后，将膜蛋白质样品捕集于双相柱上，通入碳酸氢铵缓冲液，将PH值置换到7-8，满足后续膜蛋白质的还原、烷基化及胰蛋白酶酶切过程所需缓冲条件。
[0040]5.样品预处理时间短。本发明基于微反应器的原位样品预处理，无需其他的转移、冻干等过程，整个样品预处理时间可控制在2-4小时内。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1为双相柱膜蛋白质微反应器示意图。1:载流液流出端；2:亲水性柱塞；3 --强阴离子交换填料；4:强阳离子交换填料；5:载流液流入端；
[0042]图2为双相柱膜蛋白质微反应器的样品预处理流程图。7:膜蛋白质样品；8:甲酸溶解膜蛋白质样品；9:置换pH值于7-8，并完成还原、烷基化及蛋白质的胰蛋白酶酶解过程。
[0043]图3为SDS-PAGE评价双相柱膜蛋白质微反应器，酸性上样、置换pH至碱性过程中的样品保留情况。以酸性、中性、碱性蛋白质BSA、Myo, CytC的混合物作为样品。条带1:Marker ;条带 2:BSA、Myo、Cyt C 三个蛋白质;
[0044]条带3:双相柱膜蛋白质微反应器的上样流出液；条带4:SCX微反应器的上样流出液；条带5:双相柱膜蛋白质微反应器pH置换的流出液；条带6 =SCX微反应器pH置换的流出液。
[0045]图4用反相捕集柱除盐的峰面积评价微反应器样品预处理的回收率。A:自由溶液酶解等浓度的BSA、Myo, Cyt C蛋白溶液，酶解产物的反相除盐峰面积的标准曲线；B:4y g等浓度BSA、Myo、Cyt C蛋白用甲酸溶解，经双相柱膜蛋白质微反应器样品预处理后，所得酶解产物的回收率。
【具体实施方式】
[0046]1.双相柱膜蛋白质微反应器的制备:按图1所示，在200iim 1.d.毛细管中，原位合成亲水性整体柱塞2，步骤如下:(I)毛细管预处理。将毛细管分别用浓度为IM的氢氧化钠溶液、水、浓度为IM的盐酸溶液、水、甲醇冲洗，然后70°C下氮气吹干；然后,将Y-MAPS(Y-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷)的无水甲醇溶液(体积比1:1)灌入毛细管内，用硅胶将两端密封后，在室温下静置反应24h。反应结束后，用无水甲醇将毛细管内残留的Y-MAPS冲洗干净，室温下氮气吹干。(2)亲水性柱塞的制备。称取PEGDA (聚乙二醇二丙烯酸酯)0.1500g, AIBN (偶`氮二异丁氰)0.0015g，正丙醇0.3500g，混匀得到聚合溶液，吹氮气30s，以除去其中的氧气，将预处理过的毛细管一端浸入聚合溶液中，聚合溶液通过毛细虹吸作用吸入预处理过的毛细管中约5cm后，用硅胶将两端密封，放入水浴锅中50°C反应24小时。柱塞合成后，顺序填装2厘米的强阴离子交换填料3 (日本东曹达，TSK-GELSuperQ-5PW，10iim，1000 A)和2厘米的强阳离子交换填料4 (日本东曹达，TSK-GELSP-5Pff,lOum,1000 A)0
[0047]2.评价双相柱膜蛋白质微反应器的样品预处理的效率:以酸、中、碱性三种标准蛋白BSA、Myo、Cyt C的混合物作为样品。用体积分数为90%的甲酸溶液等质量浓度溶解，90°C下热变性IOmin后，将上述溶液稀释至甲酸浓度为1% (体积分数)，以满足强阳离子交换填料的解离条件。随后，将蛋白质样品捕集于微反应器，用5mM碳酸氢铵缓冲液置换pH值于7.5。继而，通入IOOmM 二硫苏糖醇(DTT)溶液，在室温下反应30min进行蛋白质的还原处理后，通入IOmM碘乙酰胺(IAA)溶液，室温下避光反应30min后进行蛋白质的烷基化处理。最后，通入2mg/mL的胰蛋白酶的5mM碳酸氢铵溶液,液封住毛细管两端,37°C酶解1_2小时。酶解结束后，将微反应器用二通与反相分离柱(内径75 ii m 1.d.,长17cm,含2cm的喷针，填料为美国菲罗门，Luna C18(2),5um, 100人)串连，与质谱联用，对酶解肽段进行一维液相分离、质谱鉴定。
[0048]作为对照组，我们用常规自由溶液酶解的方法对上述样品(等质量BSA、Myo、Cyt C的混合物)进行样品预处理。首先，用ImL碳酸氢铵缓冲液(50mM，pH 8)溶解Img BSA,Myo,Cyt C的混合物(三种蛋白按等质量比混合),90°C下热变性IOmin后,加入IOmM 二硫苏糖醇(DTT )溶液，56 °C下，反应2h进行蛋白质的还原处理。随后，通入25mM碘乙酰胺(IAA)溶液，室温下避光反应30min进行蛋白质的烷基化处理。最后，加入25ug的胰蛋白酶(溶于50mM碳酸氢铵溶液，pH 8)进行蛋白质的酶解。37°C酶解12小时后，加入终体积为I %的甲酸溶液终止酶解。
[0049]从双相柱膜蛋白质微反应器和自由溶液的样品预处理结果看，采用以上两种策略，蛋白质的还原、烷基化效率(表1)及酶解效率(表2 )都是相当的。
[0050]3.基于双相柱膜蛋白质微反应器的鼠脑膜蛋白质样品的分析:用体积分数为90%的甲酸溶解鼠脑膜蛋白质样品，90°C下热变性IOmin后，将上述溶液稀释至甲酸浓度为1% (体积分数)，以满足强阳离子交换填料的解离条件。随后，将膜蛋白质样品捕集于微反应器，用5mM碳酸氢铵缓冲液置换pH值于7.5，通入IOOmM DTT溶液进行蛋白质的还原处理，在室温下反应30min后，通入IOmM IAA溶液进行蛋白质的烷基化处理，室温下避光反应30min。随后，通入2mg/mL的胰蛋白酶的5mM碳酸氢铵溶液，液封住毛细管两端，37°C酶解2h。酶解结束后，将微反应器用二通与强阳离子交换捕集柱和反相分离柱(内径75 y m
1.d.，长17cm，含2cm的喷针，填料为美国菲罗门，Luna C18(2),5um, 100人)串连，并与质谱联用，对鼠脑膜蛋白质的酶解肽段进行二维液相分离、质谱鉴定。
[0051]4.数据分析:对采集的谱图进行数据库检索和数据分析。从结果看，鉴定到975个蛋白group,对应于3841条非冗余肽段。其中，416个膜蛋白质,其比例占鉴定到的总蛋白质的43%。此外， 鉴定到103条跨膜肽段。
[0052]表1BSA的双相柱膜蛋白质微反应器较自由溶液的还原、烷基化结果
[0053]
【权利要求】
1.双相柱膜蛋白质微反应器，其特征在于: 包括中空的容器，于中空的容器内顺次填充阴离子交换材料、阳离子交换材料、或顺次填充阳离子交换材料、阴离子交换材料，于中空的容器内部空腔的一端或两端设置有柱塞；所述中空的容器为圆柱、圆锥或圆盘形容器，中空容器的内部空腔径向横截面直径为50u m_5cm0
2.根据权利要求1所述的双相柱膜蛋白质微反应器，其特征在于:容器为:20-1000Ul移液器枪头，l-20ml固相萃取(SPE)管，l-20ml注射器针管，50-500 u m内径毛细管或注射器滤膜腔体。
3.根据权利要求1所述的双相柱膜蛋白质微反应器，其特征在于:柱塞是在微反应器内原位合成的整体柱柱塞或孔径为3nm-20 u m的筛板。
4.根据权利要求1所述的双相柱膜蛋白质微反应器，其特征在于:同一容器内包含阴离子交换材料、阳离子交换材料； 阳离子交换材料为含有磺酸基团和/或磷酸基团的强阳离子交换材料、或含有羧基基团的弱阳离子交换材料；阴离子交换材料为含有季铵基团的强阴离子交换材料、或含有仲胺和/或叔胺基团的弱阴离子交换材料；材料可以是颗粒材料或者整体材料。
5.根据权利要求1或4所述的双相柱膜蛋白质微反应器，其特征在于:阳、阴离子交换材料的搭配可以是:强阳离子交换材料和强阴离子材料；强阳离子交换材料和弱阴离子交换材料；弱阳离子交换材料和强阴离子交换材料；弱阳离子交换材料和弱阴离子交换材料。
6.一种权利要求1所述双相柱膜蛋白质微反应器的应用，其特征在于:` 1)在带有柱塞的横截面直径为SOym-Scm的圆柱、圆锥或圆盘形容器内顺次填充阴、阳离子交换材料或阳、阴离子交换材料； 2)采用pH为1-7的酸性溶液或pH为大于7-14的溶有质量或体积浓度为I% -30%的表面活性剂或去垢剂的碱性溶液溶解膜蛋白质样品，将样品溶液通过微反应器实现膜蛋白质的原位捕集； 3)然后，通入pH为大于7-14的碱性溶液或pH为1-7的酸性溶液进行微反应器内溶液体系的pH值的置换； 4)之后，用还原剂进行蛋白质的还原，随后用烷基化试剂进行蛋白质的烷基化处理，最后在pH为大于7-14的碱性条件下进行蛋白质的酶解或pH为1-7的酸性条件下进行蛋白质的酶解； 5)酶解完成后，用200-2000mM的盐溶液将膜蛋白质的酶解肽段从微反应器上洗脱下来，收集洗脱液，用液相色谱法分离，质谱、紫外或荧光检测器进行检测。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:pH为1-7的酸性溶液可为甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液； 表面活性剂为十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、chaps、Rapigest SF、或NP-40d ;去垢剂可为尿素、硫脲、或盐酸胍； PH为大于7-14的碱性溶液可为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液； 溶解蛋白质的溶剂可以是PH为1-7的酸性溶剂，也可以是pH为大于7-14的碱性溶剂； 如果是酸性条件下捕集，则填装顺序为:载流液流入端为阳离子交换材料，载流液流出端为阴离子交换材料； 如果是碱性条件下捕集，则填装顺序为:载流液流入端为阴离子交换材料，载流液流出端为阳离子交换材料。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:若在酸性条件下捕集，则用pH为大于7-14的碱性溶液置换pH值，溶液浓度范围在1-1OOmM之间； 若在碱性条件下捕集，则用PH为1-7的酸性溶液置换pH值，溶液浓度范围在1-1OOmM之间。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于: 还原剂为二硫苏糖醇(DTT)、磷酸三氯乙酯(TCEP)或(6-巯基乙醇；浓度为l-200mM; 烷基化试剂为碘代乙酸或碘乙酰胺；浓度为l-200mM ； pH为大于7-14的碱性条件下进行蛋白质的酶解选择胰蛋白酶、内肽酶Arg-C、内肽酶lys-C、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶中的一种或几种；用量为蛋白质样品质量的1/100-1/10 ； PH为1-7的酸性条件下进行蛋白质的酶解选择胃蛋白酶或溴化氰试剂；用量为蛋白质样品质量的1/100-1/10 ;盐溶液为碳酸氢铵溶液、氯化钠溶液、乙酸铵溶液、磷酸盐溶液、或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:膜蛋白质捕集于微反应器后，后续的膜蛋白质的还原、烷基化、酶解过程均在微反应器内原位进行。
【文档编号】C07K1/18GK103665098SQ201210349969
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月20日 优先权日:2012年9月20日
【发明者】张丽华, 赵群, 杨开广, 梁玉, 梁振, 张玉奎 申请人:中国科学院大连化学物理研究所