具有三个发色团的发光镧系元素螯合物及其用途
【专利摘要】本申请公开了式(I)的具有镧系元素例如铕的发光镧系元素螯合物、以及相应的发光镧系元素螯合配体。本申请还公开了包含与所述发光镧系元素螯合物缀合的生物特异性结合反应物(例如抗体)的能检测的分子、以及进行生物特异性结合测定的方法、这样的能检测的分子在利用特异性发光的时间分辨荧光测定法测定的基于特异性生物亲和性的结合测定中的用途、以及与所述发光镧系元素螯合物缀合的固体载体材料。
【专利说明】具有三个发色团的发光镧系元素螯合物及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及将连接至生物特异性反应物的新型的含有三个发色团的镧系元素螯合物以及其在各种测定(分析，assay)中的用途。
【背景技术】
[0002]使用长寿命发射的发光镧系元素螯合物的时间分辨荧光测定法(TRF)已经被应用于许多特异性结合测定例如免疫测定、DNA杂交测定、受体结合测定、酶法测定、生物成像例如免疫细胞化学测定、免疫组织化学测定或者基于细胞的测定中，以测量非常低浓度的所需的被分析物。此外，镧系元素螯合物已经被用于磁共振成像(MRI)和正电子发射断层成像(PET)中。
[0003]对于TRF应用，最佳的标记物必须满足若干个要求。首先，它必须在基态和激发态两者中都是光化学稳定的，并且它必须是动力学和化学稳定的。激发波长必须是尽可能高的，优选超过300nm。它必须具有有效的阳离子发射，即，高的发光产额(yield)(激发系数X量子产率，ε Φ)。观察到的发光衰减时间必须是长的，并且螯合物必须具有良好的水溶性。为了标记的目的，它必须具有反应性基团以容许与生物特异性结合反应物的共价连接，并且经标记的生物分子的亲和性和非特异性结合性质必须得以保持。
[0004]挑战是制备在一个分子中满足所有要求的螯合物标记物，且因此，通常在适宜的标记物的开发中进行一些折衷。作为其结果，已经进行许多尝试(参见例如BioconjugateChem.，20(2009)404中的综述)以调节适合用于时间分辨荧光测定法应用的螯合物标记物的光物理性质。
[0005]改善发光强度的一种通常采用的方法是制备在结构设计中具有组合的若干个独立的发色团部分的螯合物配体，这提供高的稳定性和发光量子产率。Takalo，H.，etal.，1996，Helv.Chim.Acta.，79，789公布了包含两个和三个单独的4-(苯基乙炔基)吡啶的螯合物。镧系元素螯合物和螯合配体的更新的实例是例如EP1447666、W02010/055207、W02010/006605和W02008/020113中公开的那些。基于对环状氮杂大环(azamacrocycle)(例如D0TA)的螯合物稳定性研究，观察到相对于开链螯合物(例如DPTA)更高的稳定性，且因此，关于公开的具有三个发色团的螯合物的主要焦点在于束缚至不同发色团的氮杂大环。
[0006]最近，对于利用若干个1-羟基-2-吡啶酮和水杨酰胺基团的开链配体，已观察到高的镧系元素螯合物稳定性，尽管这些公开的螯合物通常是八齿的并且不包含用于与镧系元素离子配位的羧酸，但是已经得到了高的发光和稳定性。然而，那些镧系元素螯合物仅仅具有中等的总摩尔吸光系数，即，在4个发色团的情况下低于27，000，而例如，取决于发色团上的取代基，具有仅仅一个苯基乙炔基吡啶子单元的螯合物通常具有25，000-35, OOOcnT1的吸光系数(Latva, M, et al., 1997, J.Luminescence, 75, 149)。
[0007] 关于具有许多发色团的螯合物和配体的众所周知的挑战是找到适宜的结构设计，其提供高的水溶性并同时对任何可能的生物过程是惰性的。已知，发色团的加入降低配体和螯合物在水中的溶解性，增加在标记过程期间生物特异性结合反应物聚集体的形成和被标记的生物分子的非特异性结合性质。聚集体将产生纯化问题并降低被标记的物质的产率。而且，被标记的生物分子的增加的非特异性结合将增强生物特异性测定的背景发光且因此降低测定灵敏度。
【发明内容】
[0008]本发明涉及在发光的镧系元素离子周围具有三个单独的发色团并且给出格外高的信号水平的新型标记物螯合物设计。
[0009]使用本发明的螯合物，可降低标记程度而不损失信号，并且同时较低的标记程度改善生物分子的亲和性并减少在测定期间的非特异性结合。因此，较快的动力学是可能的，并且观察到较低的背景，其也可改善总体测定灵敏度。
[0010]本发明的第一方面涉及式(I)的发光镧系元素螯合物，
[0011]
【权利要求】
1.式(I)的发光镧系元素螯合物，
2.根据权利要求1的发光镧系元素螯合物，其中所述共轭基团由一个、两个或三个排列以彼此共轭的部分组成，各部分选自亚乙烯基(-CH=CH-)，亚乙炔基(-C = C-)，羰基(-C(=0)-),(杂)芳族环或环体系的二基(-Het/Ar-)例如亚苯基、亚联苯基、亚萘基、亚吡啶基、亚吡嗪基、亚嘧啶基、亚哒嗪基、亚呋喃基、亚噻吩基、亚吡咯基、亚咪唑基、亚吡唑基、亚噻唑基、亚异噻唑基、亚噁唑基、亚异噁唑基、亚呋咱基、1，2，4-三唑-3，5-亚基和亚噁二唑基，其各自可为未取代的、R4-单取代的、R4, R5-二取代的、R4, R5, R6-三取代的、R4, R5, R6, R7-四取代的或者R4, R5, R6, R7, R8-五取代的，其中这样的可能的取代基R4、R5> R6>R7 和 R8 各自独立地选自 Ch2-烷基、-(CH2)0^6COOH, -(CH2)ch6COO' -(CH2)0^6SO3H, -(CH2)ch6SO3' -NHC (=0) R10, -NCH3C (=0) R10, -C (=0) NHR10, -C (=0) NCH3Rltl、-NHC (=0) NHRltl、-NHC (=S)NHR10、-C (=0) R10、-F、-C1、-Br、-1、羟基(-OH)、巯基(-SH)、_0R9、-SR9 和亲水性基团，并且其中 R9 选自 _CF3、-Ch2-烷基、-(CH2) hCOOH、- (CH2) ^6COO-, - (CH2) ^6SO3H, - (CH2) ^SCV、-NHC(=0) R10、-NCH3C (=0) R10、-C (=0) NHR10、-C (=0) NCH3R10' -NHC (=0) NHR10、-NHC (=S) NHR10、-C (=0)R10 和亲水性基团，其中 Riq 选自 Ch2-烷基、-(CH2) hCOOH、-(CH2)卜60)0-、-(CH2) ^6SO3H,和-(CH2) ^SO3-以及亲水性基团。
3.根据前述权利要求中任一项的发光镧系元素螯合物，其中GpG2和G3中的至少两个独立地是共轭基团。
4.根据前述权利要求中任一项的发光镧系元素螯合物，其中GpG2和G3各自独立地是共轭基团。
5.根据前述权利要求中任一项的发光镧系元素螯合物，其中所述反应性基团Z包括叠氮基(-N3)、炔基(-C = CH)、烯基(-CH=CH2)、氨基(-NH2)、氨基氧基(-O-NH2)、羧基(-C00H)、醛基(-CH0)、巯基(-SH)、马来酰亚胺基、或者它们的活化的衍生物，包括异氰酸酯基(-NC0)、异硫氰酸酯基(-NCS)、重氮基(-N+N)、溴代乙酰胺基、碘代乙酰胺基、反应性的酯基、吡啶基_2_ 二硫基、或者6-取代的4-氯-1，3, 5- 二嗪-2-基氨基。
6.根据前述权利要求中任一项的发光镧系元素螯合物，其中所述反应性基团Z包含间隔基，所述间隔基是形成间距的二基，所述间隔基由一至五个部分形成，各部分选自:亚苯基、含有1-10个碳原子的亚烷基、亚乙炔基(-C = C-)、醚基(-0-)、硫醚基(-S-)、二硫基(-S-S-)、酰胺基(-C (=0) -NH-、-NH-C (=0) -、-C (=0) -NCH3-和-NCH3-C (=0)-)、硫脲基(-NH-C (=S) -NH-)和三唑基。
7.根据前述权利要求中任一项的发光镧系元素螯合物，其中所述共轭基团独立地选自苯基乙炔基、苯基、噻吩基和呋喃基，其各自可为取代的。
8.根据前述权利要求中任一项的发光镧系元素螯合物，其中所述亲水性基团包括单糖或二糖。
9.根据前述权利要求中任一项的发光镧系元素螯合物，其中所述亲水性基团包含间隔基，所述间隔基是形成间距的二基，所述间隔基由一至五个部分形成，各部分选自:亚苯基、含有1-10个碳原子的亚烷基、亚乙炔基(-C = C-)、醚基(-0-)、硫醚基(-S-)、二硫基(-S-S-)、酰胺基(-C (=0) -NH-、-NH-C (=0) -、-C (=0) -NCH3-和-NCH3-C (=0)-)、硫脲基(-NH-C (=S) -NH-)和三唑基。
10.根据前述权利要求中 任一项的发光镧系元素螯合物， (i)其中G1和G3各自是3，5-双(羧基甲氧基)苯基乙炔基且G2是苯基乙炔基，-A1和-A2各自是-H, R1和R3各自是_H,且R2是反应性基团；或者 (?)其中Gp G2和G3各自是苯基乙炔基，-A1和-A2各自是-H，R1和R3各自是亲水性基团，且R2是反应性基团；或者 (iii)其中G1'G2和G3各自是苯基乙炔基，-A1和-A2中的一个是-H且-A1和-A2中的另一个是包含间隔基的反应性基团，且％、R2和R3各自是亲水性基团；或者 (iv)其中G1和G3各自是4-(羧基甲硫基)苯基乙炔基且G2是苯基乙炔基，-A1和-A2各自是_H, R1和R3各自是_H,且R2是反应性基团；或者 (V)其中G1和G3各自是2，4-双(羧基甲硫基)苯基乙炔基且G2是苯基乙炔基，-A1和-A2各自是-H, R1和R3各自是_H,且R2是反应性基团；或者 (vi)其中G1和G3各自是2，4，6-三(羧基甲氧基)苯基乙炔基且G2是苯基乙炔基，-Ai和-A2各自是-H, R1和R3各自是_H,且R2是反应性基团；或者 (vii)其中G1和G3各自是呋喃-2-基且G2是苯基乙炔基，-A1和-A2各自是-H，R1和R3各自是-H，且R2是反应性基团；或者 (viii)其中G1和G3各自是噻吩-2-基且G2是苯基乙炔基，-A1和-A2各自是-1R1和R3各自是-H，且R2是反应性基团；或者 (ix)其中R1-G1 和 R3-G3 各自是(2，4- 二 (NaOOC-CH2-O-)苯基)乙炔基，G2 是(2- (NaOOC-CH2-O-)苯基)乙炔基，-A1和-A2各自是-H，且R2是反应性基团。
11.根据前述权利要求中任一项的发光镧系元素螯合物，其中所述镧系元素离子Ln3+选自铕(III)、铽(III)、镝(III)和钐(III)，优选铕(III)。
12.能检测的分子，其包含与如权利要求1-11中任一项所定义的式(I)的发光镧系元素螯合物缀合的生物特异性结合反应物。
13.根据权利要求12的能检测的分子，其中所述生物特异性结合反应物选自抗体、抗原、受体配体、特异性结合蛋白、DNA探针、RNA探针、寡肽、寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、经修饰的多核苷酸、蛋白质、寡糖、多糖、磷脂、PNA、类固醇、半抗原、药物、受体结合配体、和凝集素。
14.根据权利要求12或13的能检测的分子，其中所述生物特异性结合反应物是抗体。
15.式(II)的镧系元素螯合配体，
16.进行生物特异性结合测定的方法，所述方法包括以下步骤: a)形成被分析物与通过根据权利要求1-11中任一项的镧系元素螯合物标记的生物特异性结合反应物之间的生物复合物； b)用具有激发波长的辐射激发所述生物复合物，由此形成激发的生物复合物；和 c)检测由所述激发的生物复合物发出的发射辐射。
17.根据权利要求12-14中任一项的能检测的分子在利用特异性发光的时间分辨荧光测定法测定的基于特异性生物亲和性的结合测定中的用途。
18.固体载体材料，其与根据权利要求1-11中任一项的式(I)的发光镧系元素螯合物或者根据权利要求15的式(II)的镧系元素螯合配体缀合。
【文档编号】C07D213/40GK103890137SQ201280051442
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年8月17日 优先权日:2011年8月19日
【发明者】H.塔卡洛, N.梅尔托拉 申请人:Dhr芬兰公司