具有脑肿瘤靶向和肿瘤组织穿透能力的d构型多肽及其基因递释系统的制作方法
【专利摘要】本发明属药学领域，涉及D构型多肽及其基因递释系统，具体涉及与神经纤毛蛋白NRP-1高结合活性、具有脑肿瘤靶向和肿瘤组织穿透能力的D构型多肽及其修饰的基因递释系统。本发明所述D构型多肽可以介导纳米递释系统向肿瘤靶向递送药物，用于实现向脑原位胶质瘤的靶向治疗。经体内外实验表明，D构型多肽修饰的基因载体，可以显著提高基因转染效率，所述基因载体包载治疗基因pORF-hTRAIL可以显著延长脑胶质瘤原位模型裸鼠的生存期。
【专利说明】具有脑肿瘤靶向和肿瘤组织穿透能力的D构型多肽及其基因递释系统
【技术领域】
[0001]本发明属药学领域，涉及D构型多肽及其基因递释系统，具体涉及与神经纤毛蛋白NRP-1高结合活性、具有脑肿瘤靶向和肿瘤组织穿透能力的D构型多肽及其修饰的基因递释系统。
【背景技术】
[0002]据报道，神经胶质瘤是最为常见的脑部肿瘤之一；由于其恶性程度高、术后易复发和侵袭速度快等特点，导致患者的中位生存期小于16个月。对于成功治疗脑肿瘤而言，药物或治疗基因到达肿瘤部位不仅需要跨越血-脑屏障(BBB)，还需要克服血-脑肿瘤屏障(BBTB)。研究显示，肿瘤细胞上表达的特异性受体是肿瘤靶向递药的有效靶点，经其介导的肿瘤靶向治疗是一种有效克服BBTB的手段；将脑肿瘤靶向配体，如RGD、叶酸、VEGFR等修饰于给药系统表面，有助于将足够的药物或治疗基因递送到脑肿瘤部位。此外，治疗脑肿瘤的另一个关键在于，药物或治疗基因到达脑肿瘤部位后需具备肿瘤深层组织穿透能力，才能有效提高神经胶质瘤的治疗效果。
[0003]目前已知，神经纤毛蛋白-1(NRP-1)是一种跨膜糖蛋白，是Sema3A和VEGF165的共同受体，在肿瘤新生血管生成、肿瘤生长及转移中发挥重要作用。有研究表明NRP-1不仅表达于肿瘤血管内皮细胞，同时在许多肿瘤细胞膜上过度表达，包括神经胶质瘤、肺癌、胰腺癌、前瘤列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤等。研究和开发可靶向NRP-1的配体，协助给药系统穿过BBTB，从而提高药物的脑肿瘤治疗效果，具有现实意义。
[0004]噬菌体展示技术一直以来被认为是筛选靶向肿瘤组织有效配体的重要手段之一；通过该技术筛选出来的多肽已经被成功应用于肿瘤诊断和治疗；其中，C-end rule (CendR)多肽，其序列结构是R/KXXR/K，由Erkki Ruoslahti [PNAS.2009 ；106: (38)】通过噬菌体展示技术得到，研究表明，CendR多肽能够与靶细胞表面NRP-1受体结合，增强肿瘤组织摄取和肿瘤细胞内化程度；且CendR多肽还能够增加血管和肿瘤组织通透性，以提高药物或治疗基因穿透进入肿瘤深层组织的能力。RGERPPR作为L构型CendR多肽，实验证明其能够与NRP-1受体结合,进一步增强肿瘤细胞摄取和内化。
[0005]目前，尚未见有关由含有D(RPPREGR)序列多肽修饰的非病毒基因递释系统及其在体内外转染效率评价以及抗脑胶质瘤作用的报道。本发明拟将L型多肽RGERPPR逆序并以D构型的氨基酸替代后得到d(RPPREGR)，作为穿过BBTB的靶向分子，利用其与NRP-1受体的高亲和力和深层组织穿透性，将基因递释系统靶向递送至脑内，以实现靶向治疗脑原位胶质瘤。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种D构型多肽及其基因递释系统，具体涉及与神经纤毛蛋白NRP-1高结合活性、具有脑肿瘤靶向和肿瘤组织穿透能力的D构型多肽及其修饰的基因递释系统，
[0007]本发明构建了一种D构型多肽，其氨基酸序列为D (RPPREGR)，该多肽与神经纤毛蛋白NRP-1高结合活性、具有脑肿瘤靶向和肿瘤组织穿透能力；本发明提供了由所述D构型多肽修饰的基因递释系统，所述D构型多肽可以介导纳米递释系统向肿瘤靶向递送药物，用于实现向脑原位胶质瘤的靶向治疗。
[0008]本发明将L型多肽RGERPPR逆序并以D构型的氨基酸替代后得到D (RPPREGR)，作为穿过BBTB的靶向分子，利用其与NRP-1受体的高亲和力和深层组织穿透性，将基因递释系统靶向递送至脑内，经体内外实验表明，本发明将D (RPPREGR)修饰到PEG-PEI表面制得RPPREGR-PEG-PEI基因载体，可以显著提高基因转染效率，所述基因载体包载治疗基因pORF-hTRAIL可以显著延长脑胶质瘤原位模型裸鼠的生存期。
[0009]本发明中，所述D (RPPREGR)多肽的N端氨基与含有琥珀酰亚胺-聚乙二醇的阳离子多聚物连接连接，制得非病毒基因载体材料D (RPPREGR)-PEG-X复合物；该复合物可包载报告基因或治疗基因形成非病毒基因递释系统；其中，该复合物中X是聚乙烯亚胺(PEI)、树枝状聚合物(PAMAM)、多聚阳离子氨基酸、壳聚糖或阳离子脂质体；
[0010]制得的基因递释系统分别为:D(RPPREGR) -PEG-PE1、D (RPPREGR) -PEG-PAMAM、D(RPPREGR) -PEG-多聚阳离子氨基酸、D(RPPREGR) -PEG-壳聚糖或 D (RPPREGR)-PEG-阳离子脂质体等基因递释系统，所述的基因递释系统具有脑肿瘤靶向特征，可以提高脑肿瘤体内外基因转染效率，同时可携带治疗基因蓄积于脑肿瘤组织，用于脑肿瘤的治疗。
[0011]本发明所述的D(RPPREGR)-PEG-X复合物可以包载报告基因或治疗基因。
[0012]本发明所述的多肽D(RPPREGR)，还修饰脂质体、纳米粒、聚合物胶束和高分子载体等纳米给药系统以实现肿瘤靶向。
[0013]本发明所述的多肽D (RPPREGR)，还与抗癌化学药物联合使用，通过D (RPPREGR)激活CendR通路，增加肿瘤部位血管和组织通透性，从而促进联合给药中药物穿透肿瘤深层组织的能力。
[0014]具体而言，本发明通过以下技术方案实现:
[0015]采用固相合成法，制备D (RPPREGR)序列的多肽；按下述合成路线，将D (RPPREGR)多肽通过双功能分子 NHS-PEG-Mal 连接到 PEI 上，制得 RPPREGR-PEG-PEI ;RPPREGR_PEG_PEI包载pDNA，经细胞定性和定量转染实验表明，D (RPPREGR)修饰可以显著提高PEG-PEI基因转染效率；药效学实验表明，RPPREGR-PEG-PEI/pORF-hTRAIL可以显著延长脑胶质瘤原位模型裸鼠的生存期。
[0016]
【权利要求】
1.一种D构型多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为D(RPPREGR)，其通过将L型多肽RGERPPR逆序并以D构型的氨基酸替代后制得。
2.按权利要求1所述的D构型多肽，其特征在于，所述多肽其N端氨基与含有琥珀酰亚胺-聚乙二醇的阳离子多聚物连接，得到D (RPPREGR) -PEG-X复合物。
3.按权利要求2所述的D构型多肽，其特征在于，所述的D(RPPREGR)-PEG-X复合物中，X是聚乙烯亚胺(PEI)、树枝状聚合物(PAMAM)、多聚阳离子氨基酸、壳聚糖或阳离子脂质体。
4.按权利要求2或3所述的D构型多肽，其特征在于，所述的D(RPPREGR) -PEG-X复合物包载报告基因或治疗基因，形成非病毒基因递释系统。
5.按权利要求4所述的D构型多肽，其特征在于，所述的非病毒基因递释系统为 D(RPPREGR)-PEG-PE1、D(RPPREGR)-PEG-PAMAM、D(RPPREGR)-PEG-多聚阳离子氨基酸、D (RPPREGR) -PEG-壳聚糖或D (RPPREGR) -PEG-阳离子脂质体基因递释系统。
6.一种D构型多肽修饰的基因递释系统，其特征在于，通过下方法述制备:采用固相合成法，制备D (RPPREGR)序列的多肽；按下述合成路线，将D (RPPREGR)多肽通过双功能分子NHS-PEG-Mal 连接到 PEI 上，制得 RPPREGR-PEG-PEI ;RPPREGR_PEG_PEI 包载 pDNA 制得基因递释系统，
7.按权利要求1所述的D构型多肽，其特征在于，所述多肽D(RPPREGR)，还修饰脂质体、纳米粒、聚合物胶束或高分子载体形成纳米给药系统。
8.按权利要求1所述的D构型多肽，其特征在于，所述多肽D(RPPREGR)，还与抗癌化学药物联合使用，通过D(RPPREGR)激活CendR通路，增加肿瘤部位血管和组织通透性，促进药物穿透肿瘤深层组织的能力。
9.权利要求1所述的D构型多肽在制备脑肿瘤靶向治疗药物中的用途。
10.按权利要求9所述的用途，其中所述的D构型多肽与神经纤毛蛋白NRP-1高结合活性、具有脑肿瘤靶向和肿瘤组织穿透能力。
11.权利要求6的D构型多肽修饰的基因递释系统在制备脑肿瘤靶向治疗药物中的用途，其中，所述的基因递释系统提高脑肿瘤体内外基因转染效率，同时携带治疗基因蓄积于脑肿瘤组织，治疗脑肿瘤。
12.按权利要求9或11的 用途，其特征在于，所述的脑肿瘤是脑原位胶质瘤。
【文档编号】C07K7/06GK104072581SQ201310111290
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年3月29日 优先权日:2013年3月29日
【发明者】刘敏, 王晶, 陆伟跃, 谢操, 雷杨, 谢作旭 申请人:复旦大学