蛋白质层析纯化填料的清洁方法
【专利摘要】本发明属于蛋白质的分离纯化领域，涉及蛋白质层析纯化填料的清洁方法，其是用清洁有效量的质量体积比浓度为0.02%-2%的苯扎溴铵水溶液清洁所述的蛋白质层析纯化填料，并优选用质量体积比浓度为0.05%-0.5%的苯扎溴铵水溶液清洁所述的蛋白质层析纯化填料。利用该方法清洁蛋白质层析纯化填料，可以在保证甚至提高清洁效果的基础上大幅度的降低清洁过程对蛋白质层析纯化填料结合能力的破坏，从而延长蛋白质层析纯化填料的使用寿命。
【专利说明】蛋白质层析纯化填料的清洁方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质层析纯化填料的清洁方法。
【背景技术】
[0002]层析(chromatography),也称为色谱，是分离纯化蛋白质最重要的手段。根据分离纯化原理的不同，蛋白质层析种类可以分为离子交换层析(ion exchangechromatography, IEC)、凝胶层析(gel filtration chromatography, GFC)或分子排阻层析(size exclusion chromatography, SEC)、疏水层析(hydrophobic interactionchromatography, HIC)与亲和层析(affinity chromatography, AC)等主要类别。
[0003]由于层析过程中引入的微生物、热原(内毒素)等物质会污染层析获得的蛋白质，破坏、降解蛋白质或影响蛋白质作为药物使用时的安全性；而蛋白质本身又很容易污染微生物、热原(内毒素)等物质引起层析系统的污染，进而污染后续层析处理的蛋白质，所以在每次层析填料使用后，下次层析填料使用前都优选对层析填料进行清洁处理，而在药用蛋白质的生产中在层析填料的每次使用后更是必须进行清洁处理。
[0004]蛋白质层析填料的清洁通常使用强酸(如0.1-lmol/L盐酸或醋酸)、强碱(如0.2-2mol/L氢氧化钠)、高浓度盐(如l_5mol/L NaCl)、有机溶剂(如5-50%(v/v)乙醇)等清洁剂中的一种，也可以组合使用或顺序使用它们中的几种。但一方面这种使用不一定完全清除层析填料污染的杂质，另一方面这种使用还有可能破坏层析填料，从而影响层析填料的寿命和/或结合能力。这一点对亲和层析填料的影响尤其明显，更尤其对以蛋白质为配基的亲和层析填料影响非常明显。
[0005]当亲和层析填料中的配基为蛋白质，例如抗体时，由于蛋白质遇强酸、强碱、强有机溶剂、高浓度盐时极容易变`性，而亲和层析纯化的原理利用的又是亲和层析填料配基与目标蛋白质之间基于各自构型与活性的高度特异性结合，所以以蛋白质为配基的亲和层析填料不能用常规的强酸、强碱、强有机溶剂、高浓度盐处理，这也就造成了这类填料清洁处理的困难。基于这一问题，在治疗用单克隆抗体类药物的层析纯化过程中，使用了修饰蛋白A (Protein A)配基的MabSelect系列填料,其可以耐受0.1_0.5mol/L氢氧化钠短时的清洁处理。但使用该系列填料层析纯化单克隆抗体却大大增加了层析纯化的成本，且层析填料耐强碱处理的能力也只是得到了有限的提高。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种蛋白质层析纯化填料的清洁方法，以在保证甚至提高清洁效果的基础上大幅度的降低清洁过程对蛋白质层析纯化填料结合能力的破坏，从而延长蛋白质层析纯化填料的使用寿命。
[0007]为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供蛋白质层析纯化填料的清洁方法，其是用清洁有效量的质量体积比浓度为0.02%-2%的苯扎溴铵(苯扎溴铵也称为“新洁尔灭”)水溶液清洁所述的蛋白质层析纯化填料。[0008] 本发明所述的蛋白质层析纯化填料可以是任何类型可以用于纯化蛋白质的层析填料，优选离子交换层析填料、凝胶或分子排阻层析填料、疏水层析填料和亲和层析填料，更优选亲和层析填料，并最优选以蛋白质为配基的亲和层析填料。
[0009]本发明所述的蛋白质可以是任何天然的或重组的蛋白质；可以是结构蛋白质，也可以是功能蛋白质；可以是药用的蛋白质，也可以是非药用的蛋白质，但优选药用的蛋白质。
[0010]本发明所述的蛋白质层析纯化填料的清洁方法可以是在位清洁，也可以是拆卸层析纯化填料后的离线清洁，但优选在位清洁。在位清洁时可以用质量体积比浓度为0.02%-2%的苯扎溴铵水溶液连续冲洗层析填料，冲洗体积优选3-200个柱体积；也可以在将清洁液充满所述的蛋白质层析纯化填料后，密闭装填所述的蛋白质层析纯化填料的蛋白质层析纯化柱一段时间以达到清洁作用，密闭层析柱的时间优选在0.5-10小时之间；还可以综合以上两种方法，以既可减少清洁液连续冲洗所述的蛋白质层析纯化填料的体积，也可缩短密闭层析柱后的清洁时间。
[0011]本发明清洁所述的蛋白质层析纯化填料的苯扎溴铵的浓度可以通过测试下文所述的蛋白质层析纯化填料的清洁效果，以及清洁前后蛋白质层析纯化填料的结合能力的变化确定，同时还要考虑苯扎溴铵在水中的溶解性、苯扎溴铵在清洁后是否会有残留。由此确定的苯扎溴铵的质量体积比浓度为0.02%-2%，更优选质量体积比浓度为0.05%-0.5%。
[0012]本发明的蛋白质层析纯化填料的清洁效果可以通过多种方法确定，例如从每次清洁完成后下次平衡层析柱时收集的层析柱流出液中取样进行无菌试验或内毒素检测试验。无菌试验或内毒素检测试验的方法可分别参照《中华人民共和国药典2010年版(三部)》附录XII A “无菌检查法”与附录XII E “细菌内毒素检查法”。
[0013]本发明的蛋白质层析纯化填料的结合能力的变化可以通过多种方法测定，例如可以分别测定蛋白质层析纯化前填料中配基的密度，以及蛋白质层析纯化结束并进行蛋白质层析纯化填料的清洁后填料中配基的密度，由此计算得到配基密度变化的百分率，即得到蛋白质层析纯化填料结合能力变化的百分率。但这种方法比较繁琐，更简便的方法是测定每次清洁前后蛋白质层析纯化填料饱和吸附量的变化，由此计算得到蛋白质层析纯化填料饱和吸附量变化的百分率，即得到蛋白质层析纯化填料结合能力变化的百分率。而蛋白质层析纯化填料饱和吸附量的测定方法则属于本领域技术人员的公知常识，在此不再赘述。
[0014]在一种优选的实施方案中，本发明提供蛋白质层析纯化填料的清洁方法，其使用质量体积比浓度0.05%-0.5%的苯扎溴铵水溶液清洁所述的蛋白质层析纯化填料。
[0015]在一种优选的实施方案中，本发明提供蛋白质层析纯化填料的清洁方法，其使用3-200个柱体积的苯扎溴铵水溶液清洁所述的蛋白质层析纯化填料。
[0016]在一种优选的实施方案中，本发明提供蛋白质层析纯化填料的清洁方法，其是用所述的苯扎溴铵水溶液连续冲洗所述的蛋白质层析纯化填料3-200个柱体积以达到清洁作用。
[0017]在一种优选的实施方案中，本发明提供蛋白质层析纯化填料的清洁方法，其是将所述的苯扎溴铵水溶液充满所述的蛋白质层析纯化填料后，密闭装填所述的蛋白质层析纯化填料的蛋白质层析纯化柱0.5-10小时以达到清洁作用。
[0018]在一种优选的实施方案中，本发明提供蛋白质层析纯化填料的清洁方法，其中所述的蛋白质层析纯化填料是亲和层析纯化填料。
[0019]在一种优选的实施方案中，本发明提供蛋白质层析纯化填料的清洁方法，其中所述亲和层析纯化填料是Sepharose4FF。
[0020]在一种优选的实施方案中，本发明提供蛋白质层析纯化填料的清洁方法，其中所述亲和层析纯化填料上偶联的配基为蛋白质。
[0021 ] 在一种优选的实施方案中，本发明提供蛋白质层析纯化填料的清洁方法，其中所述亲和层析纯化填料上偶联的配基为抗体。
[0022]在一种优选的实施方案中，本发明提供蛋白质层析纯化填料的清洁方法，其中所述亲和层析纯化填料上偶联的配基为蛋白A (Protein A)或蛋白G (Protein G)。
[0023]在一种优选的实施方案中，本发明提供蛋白质层析纯化填料的清洁方法，其中所述的蛋白质层析纯化填料纯化的蛋白质是干扰素或干扰素的抗体。
[0024]本发明中使用的术语“蛋白质层析纯化”是指利用色谱或层析的原理对蛋白质进行分离纯化的过程，一般是将蛋白质层析纯化填料装填到专门的层析柱中进行。一个蛋白质层析纯化流程一般包括平衡、上样、冲洗、洗脱、清洁、再生等操作。其中平衡操作是将蛋白质层析纯化填料内部的环境转换到与上样蛋白质所处的环境一致的操作；上样操作是让蛋白质通过蛋白质层析纯化填料，从而让蛋白质层析纯化填料对不同的蛋白质起到选择性吸附作用的操作；冲洗操作是在蛋白质上样后继续用溶液处理蛋白质层析填料，直至蛋白质纯化填料的流出液中不含蛋白质组分，溶液组成与平衡用溶液的组成相同的操作；洗脱操作是从蛋白质层析纯化填料上分开或一次洗下各种吸附蛋白质的操作；再生操作是让蛋白质层析填料恢复蛋白质吸附能力的操作。
[0025]本发明中使用的术语“填料”是指对蛋白质进行层析分离纯化所使用的材料，也称为胶、凝胶或介质，结构组成上包括基质(matrix)、配基(ligand)或功能基团(functionalgroup)、手臂(arm)等。
[0026]本发明中使用的术语“清洁”是指在蛋白质层析纯化填料每次纯化蛋白质后去除其中死结合或残留的杂质，尤其是微生物、热原(内毒素)类杂质的过程。
[0027]本发明中使用的术语“清洁液”是指对所述的蛋白质层析纯化填料起到清洁作用的清洁剂的溶液。例如在现有技术中可以是强酸(如0.1-lmol/L盐酸或醋酸)、强碱(如0.2-2mol/L氢氧化钠)、高浓度盐(如l_5mol/L NaCl)、有机溶剂(如5-50%(v/v)乙醇)等，在本发明中是苯扎溴铵的水溶液。
[0028]本发明中使用的术语“清洁有效量”是指能较为彻底的清除掉蛋白质层析纯化填料上死结合或残留的杂质所需的清洁液的体积。
[0029]本发明中使用的术语“在位清洁”是指不将蛋白质层析纯化填料从所在的层析柱上拆卸下来，而直接用清洁液在层析柱上清洁所述的蛋白质层析纯化填料的过程。
[0030]本发明中使用的术语“柱体积”是指将蛋白质层析纯化填料装填到层析柱上后，在实际层析操作中蛋白质层析纯化填料所占有的体积。
[0031]应当指出，上述解释的本发明中使用的一些术语的含义及上述未解释的本发明中使用的其它术语的含义均是本领域技术人员公知的。之所以对本发明中使用的这些术语的含义作出解释，是为了便于审查员，及本发明相关的技术人员、市场销售人员、法律人员理解本发明，因此这些对本发明中使用的术语的含义的解释不应当理解为对本发明的限制。【具体实施方式】
[0032]通过如下的实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式并不局限于如下的实施例。 [0033]实施例1:不同清洁液对偶联单克隆抗体配基的亲和层析填料的清洁对比试验(一)
[0034]用NHS活化的S印harose4FF填料(货号17-0906-01或17-0906-02)装填四根内径为IOmm的层析柱,每根装填Iml填料。然后根据填料制造商GEHealthcare在产品说明书中提供的偶联条件将商品化的干扰素α的单克隆抗体(PBL公司制造，北京市吉泰新绎生物科技有限公司代理销售，货号21100-2)分别偶联到已装填四根层析柱的NHS活化的Sepharose4FF 填料上。
[0035]对各层析柱分别用50mmol/L PB, 0.2mol/L NaCl，pH7.0溶液平衡，以上常规实验室环境下制备与保存，而未经无菌操作、处理与保存的浓度为lmg/ml的干扰素a Ib样品(按《中华人民共和国药典2010年版(三部)》附录IV C规定的“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法”法测定纯度大于95%;按《中华人民共和国药典2010年版(三部)》附录XII A规定的“无菌检查法”测定其中菌落数大于80000CFU/ml ;按《中华人民共和国药典2010年版(三部)》附录XII E规定的“细菌内毒素检查法”测定其中内毒素含量大于10000Eu/ml，同样的检测项目在下文的测试中方法相同)，直至检测器检测到上样流穿液中出现蛋白质时停止上样(最直接的指标是上样流穿液的紫外吸收值开始明显增加)。根据上样流速、上样时间与上样浓度计算干扰素alb样品的总上样量。上样结束并经与平衡溶液相同的溶液冲洗后分别用100mmol/L甘氨酸-盐酸,0.2mol/L NaCl, pH3.0溶液洗脱上样的干扰素a lb。洗脱结束后对各层析柱分别用0.02% (m/v)苯扎溴铵水溶液连续冲洗200个柱体积，用20%(v/v)乙醇水溶液、0.2mol/L醋酸水溶液、0.2mol/L氢氧化钠水溶液连续冲洗10个柱体积(要求这些溶液中热原(内毒素)含量小于0.5Eu/ml，菌落数小于lCFU/ml)，然后再对各层析柱分别用除菌除热原(内毒素)的纯化水(要求其中热原(内毒素)含量小于0.5Eu/ml，菌落数小于lCFU/ml)冲洗3个柱体积。冲洗临结束前收集层析柱流出液样品进行内毒素含量测定，得清洁后流出液内毒素含量；并对用苯扎溴铵清洁的层析柱收集流出液样品进行苯扎溴铵的高效液相色谱法含量测定(按照《中国现代应用药学杂志》2008年第25卷第8期第707-708页发表的文章“HPLC测定消毒液中苯扎溴铵”中报道的方法进行测定，具体条件为:Agilent XDB-C18 柱(4.6mmX 150mm, 5 μ m)，以 0.02mol/L 庚烷磺酸钠溶液(含 0.1%三乙胺，用磷酸调节pH至3.45±0.1)-乙腈(35: 65)为流动相,流速1.0ml/min,进样体积5 μ 1，检测波长262nm，柱温30°C。结果苯扎溴铵浓度在2.5~50 μ g/ml内线性关系良好(r=0.9999);此方法经方法学验证检测限小于0.00025mg/ml)。以上平衡、上样、冲洗、洗脱、清洁等层析操作的线性流速均为150cm/h。
[0036]重复前段所述的操作9次，按同样的方法取样进行测定与计算。
[0037]以下表1列出了各层析柱10次操作的情况与操作中取样检测、计算的结果。
[0038]表1不同清洁液对偶联单克隆抗体配基的亲和层析填料的清洁对比试验结果(一)
[0039]
【权利要求】
1.一种蛋白质层析纯化填料的清洁方法，其特征是用清洁有效量的质量体积比浓度为0.02%-2%的苯扎溴铵水溶液清洁所述的蛋白质层析纯化填料。
2.根据权利要求1所述的清洁方法，其特征是所述的苯扎溴铵水溶液的质量体积比浓度为 0.05%-0.5%。
3.根据权利要求1所述的清洁方法，其特征是用所述的苯扎溴铵水溶液连续冲洗所述的蛋白质层析纯化填料3-200个柱体积以达到清洁作用。
4.根据权利要求1所述的清洁方法，其特征是在将所述的苯扎溴铵水溶液充满所述的蛋白质层析纯化填料后，密闭装填所述的蛋白质层析纯化填料的蛋白质层析纯化柱0.5-10小时以达到清洁作用。
5.根据权利要求1所述的清洁方法，其特征是所述的蛋白质层析纯化填料是亲和层析纯化填料。
6.根据权利要求5所述的清洁方法，其特征是所述的亲和层析纯化填料是Sepharose4FF。
7.根据权利要求5所述的清洁方法，其特征是所述的亲和层析纯化填料上偶联的配基为蛋白质。
8.根据权利要求7所述的清洁方法，其特征是所述的亲和层析纯化填料上偶联的配基为抗体。
9.根据权利要求7所述的清洁方法，其特征是所述的亲和层析纯化填料上偶联的配基为蛋白A或蛋白G。
10.根据权利要求1-9之一所述的清洁方法，其特征是所述的蛋白质层析纯化填料纯化的蛋白质是干扰素或干扰素的抗体。
【文档编号】C07K1/22GK103554217SQ201310547434
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】周敏毅, 杨大军, 余军阳, 韩志刚, 杜伊达, 程永庆 申请人:北京三元基因工程有限公司