新型死亡受体激动性多价抗体及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一类新型抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的受体DR（deathreceptor）胞外区的抗体。该类死亡受体激动性多价抗体可以识别DR4、DR5的相同或相似的表位，形成多价抗体，诱导表达DR4和/或DR5的肿瘤细胞发生凋亡。通过人的p53结构域连接，形成四价抗体，该四价抗体包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序如SEQIDNO.1所示，轻链可变区氨基酸序如SEQIDNO.2所示。该类激动性抗体诱导同时表达DR4、DR5的肿瘤凋亡的能力明显强于只针对DR4或DR5的激动性抗体。本发明还提供了该类死亡受体激动性抗体在制备抗肿瘤药物方面的应用。
【专利说明】新型死亡受体激动性多价抗体及其在制备抗肿瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一类新型死亡受体的激动性多价抗体，该类抗体可以诱导表达0财和/^01?的肿瘤细胞发生凋亡，可用于制备抗肿瘤药物。
【背景技术】
[0002]肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(1111110111601-0818 ^801:01-1-0181:6(1 8^0^1:0818111(1110111? 11职11(1，I狀]；0是# 11丫等于1995年发现的I'研7超家族新成员。实验证实I'狀]X对几乎所有系统恶性肿瘤的大部分细胞系均有杀伤作用，而对正常组织无杀伤作用(他七10(1, 1999，5: 157-63),因此以I'狀I[受体为靶点的肿瘤治疗已成为研究的热点。
[0003]11^11的诱导肿瘤细胞凋亡的生物学效应主要是通与细胞膜上的相应受体:0尺4(0681:11 1-6061)1:01-4) ? 01？5 (0681:11 1-6061)1:01-5)结合而产生的。当 I狀]X 与冊4 或 0尺5结合后，0财与005可以形成同源/异源三聚体，通过其含有的胞内死亡结构域((1681:11(101118111, 00)传导凋亡信息至胞质内，激活(^81)2186系统最终引起细胞凋亡(3(3161106.1997:276:111 - 113.1臟皿1七^ 2000； 12:611 - 620.0611 81^1.2004； 16: 139 -144.?0
[0004]有些研究小组研发出死亡受体激动性抗体,这些抗体与0财或005特异性结合后，模拟I'狀I[的作用，诱导肿瘤细胞凋亡(恥七16土 2001； 7:954 - 960.1 01111 011001 25:1390 - 1395.?0由于抗体的分子量较大，在体内半衰期比I狀II长，因此研制死亡受体的激动性抗体代替I'狀II，成为开发药物的主要方向。
[0005]理论上，激活0财和0阳的激动性抗体具有以下优点:对于同时表达0财和0阳的肿瘤，其诱导肿瘤细胞凋亡的能力明显强于只针对0财或0阳的激动性抗体；对于只表达0尺4或085的肿瘤，也只需一种抗体药物，便于临床应用。然而目前虽然已有多个实验室报道获得了 0财或085的激动性抗体，但是没有实验室报道制备出具有同时激活0财和0尺5能力的激动性抗体。这个现象说明按照传统思路，制备同时激活0财和0阳的激动性抗体可行性不强。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于提供一类新型的能同时激活0`财和0阳的死亡受体激动性多价抗体，及其在制备抗肿瘤药物方面的应用。
[0007]新型死亡受体激动性多价抗体，识别0财、01？5的相同或相似的表位，形成多价抗体，可以诱导表达0财和/或0阳的肿瘤细胞发生凋亡。
[0008]新型死亡受体激动性多价抗体，识别0财、0阳的相同或相似的表位，通过基因工程的方法形成多价抗体，从而可以诱导表达0财和/或085的肿瘤细胞发生凋亡。
[0009]新型死亡受体激动性多价抗体，识别0财、01？5的相同或相似的表位，通过人的？53结构域连接，形成四价抗体，从而可以同时诱导表达0财和/或0阳的肿瘤细胞发生凋亡，该四价抗体包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序如SEQ ID N0.1所示，轻链可变区氨基酸序如SEQ ID N0.2所示。
[0010]上述的新型死亡受体激动性多价抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0011]在本发明中，采用基因工程等现代生物技术，利用人的B细胞，采用噬菌体展示技术，获得一株识别人DR4和DR5的相同或相似表位的单链抗体，将其多聚化，形成多价抗体。该类多价抗体可以在体外强烈诱导肿瘤细胞凋亡。因此该类抗体可以用于新型抗肿瘤药物的研发。现有的死亡受体激动性抗体均为只激活DR4或DR5 (如中国专利申请号:200680009970.1 ；200410070093.1 ;200580018426.9)。
[0012]本发明还涉及了新型死亡受体激动性多价抗体的制备方法，它主要包括以下步骤:利用健康人的B细胞建立抗体库，利用噬菌体展示技术淘筛识别DR4、DR5相同或相似的表位的抗体，得到单链抗体。将其构建为多价抗体。表达、纯化后，发现其中一个多价抗体具有使表达DR4和/或DR5的肿瘤细胞凋亡的能力。
[0013]本发明与国内外只针对DR4或DR5的类似专利相比，该类激动性抗体识别DR4和DR5的共同或相似表位，将其制成多价抗体，可以使表达DR4和/或DR5的肿瘤细胞凋亡。该类激动性抗体促进肿瘤细胞凋亡的能力强于只能激活DR4或DR5传统的激动性抗体；这些结果均为本领域技术人员所想象不到。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1显示癌细胞Jurkat转染DR4前后表达DR4、DR5情况:转染前DR4低表达，DR5高表达；转染后DR4明显升高，DR5表达基本不变；
图2显示2.5mg/L死亡受体激动性四价抗体作用于转染DR4前、后Jurkat细胞20h作用结果:该抗体可以使转染前主要表达DR5的Jurkat食管癌细胞发生凋亡，还可以使转染后同时高表达DR4和DR5的Jurkat食管癌细胞的进一步升高；
图3显示细胞EC970转染DR5前后表达DR4、DR5情况:转染前DR5低表达，DR4高表达；转染后DR5明显升高，DR4表达基本不变；
图4显示2.5mg/L死亡受体激动性四价抗体作用于转染DR4前、后EC970细胞20h作用结果:该抗体可以使转染前主要表达DR4的EC970食管癌细胞发生凋亡，还可以使转染后同时高表达DR4和DR5的EC970食管癌细胞的进一步升高。
【具体实施方式】
[0015]以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
[0016]实施例1死亡受体单链抗体的制备
采集50个健康成年人的外周单个核血细胞，提取总RNA。根据《重组抗体》(沈倍奋，科学出版社)方案，以cDNA为模板，扩增全套VH和VL基因，将扩增得到的重、轻链产物进行重叠延伸PCR扩增出ScFv片段。ScFv片段和载体pcantab_5E经Sfi 1、Not I酶切后，T4连接酶连接，电转化入E.coli XLl-Blue感受态细胞，制备噬菌体抗体库。用死亡受体抗原包被 96 孔板(第 I 轮 DR4、DR5 各 100 μ g/ml;第 2 轮先 DR4 30 μ g/ml，再 DR5 30 μ g/ml ;第3 轮先 DR4 10yg/ml$DR5 10 μ g/ml ;第 4 轮先 DR4 lyg/ml$DR5 I μ g/ml。)，1%BSA封闭后每孔加50 μ I噬菌体抗体库，37°C放置2 h，用TBST洗涤(第I轮10遍，后几轮20遍)。将得到的噬菌粒送上海英骏生物公司测序。
[0017] cDNA第一链人重链恒定区引物
IgM (F): TGG AAG AGG CAC GTT CTT TTC TTT
(1)重链正向引物
H-1(F): CAG CCG GCC ATG GCC SAG GTC CAG CTG GTR CAG TCT GG
H-2b (F): CAG CCG GCC ATG GCC CAG RTC ACC TTG AAG GAG TCT GG
H-3b (F): CAG CCG GCC ATG GCC SAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG
H-3c(F): CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG GTG GAG WCY GG
H-4b (F): CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG GG
H-4c (F): CAG CCG GCC ATG GCC CAG STG CAG CTG CAG GAG TCS GG
H-5(F): CAG CCG GCC ATG GCC GAR GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG
H-6 (F): CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG
H-7 (F): CAG CCG GCC ATG GCC CAG RTG CAG CTG GTG CAR TCT GG
HuVH1:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC SAG GTC CAG CTG GTR CAG
TCT GG (Sfi I )
HuVH2b:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG RTC ACC TTG AAG GAGTCT GG (Sfi I )
HuVH3b:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC SAG GTG CAG CTG GTG GAGTCT GG (Sfi I )
HuVH3c:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG GTG GAGWCY GG (Sfi I )
HuVH4b:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTA CAG CAGTGG GG (Sfi I )
HuVH4c:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG STG CAG CTG CAG GAGTCS GG (Sfi I )
HuVH5:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAR GTG CAG CTG GTG CAGTCT GG (Sfi I )
HuVH6:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTA CAG CTG CAG CAGTCA GG (Sfi I )
HuVH7:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG RTG CAG CTG GTG CARTCT GG (Sfi I )
(2)重链反向引物
H-8(R): TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC
H-9(R): TGA AGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC
H-1O(R): TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC
H-extension(R)1\2: ggagccgccgccgcc(agaaccaccaccacc)2 TGA GGA GAC GGT GACCAG GGT GCC
H-extension(R)3: ggagccgccgccgcc(agaaccaccaccacc)2 TGA AGA GAC GGT GAC CATTGT CCC
【权利要求】
1.新型死亡受体激动性多价抗体，其特征在于:识别0财、01？5的相同或相似的表位，形成多价抗体，可以诱导表达0财和/^01?的肿瘤细胞发生凋亡。
2.如权利要求1所述的新型死亡受体激动性多价抗体，其特征在于:识别0财、01？5的相同或相似的表位，通过基因工程的方法形成多价抗体，从而可以诱导表达0财和/或冊5的肿瘤细胞发生凋亡。
3.如权利要求2所述的新型死亡受体激动性多价抗体，其特征在于:识别0财、01？5的相同或相似的表位，通过人的？53结构域连接，形成四价抗体，从而可以同时诱导表达0财和/或0阳的肿瘤细胞发生凋亡，该四价抗体包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序如3即10勵.1所示，轻链可变区氨基酸序如3即10勵.2所示。
4.如权利要求1至3任一所述的新型死亡受体激动性多价抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
【文档编号】C07K16/28GK103833853SQ201310725221
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】马远方, 刘峰涛, 柴立辉, 张军, 刘广超, 李淑莲 申请人:河南大学