专利名称：含双链rna的局部活性组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及到可局部应用的药物组合物，其含有失配的双链核糖核酸(dsRNA)和因与表面活性剂结合成三元复合物而稳定的失配dsRNA的生物活性片断。本组合物具有层稳定性及具有抗病毒局部活性并可作其它药用。
非离子表面活性剂(表面活性剂)已证明有杀精子活性，并且是各种柜台上(非处方)避孕乳膏和泡沫剂中的活性成份。在高浓度时。表面活性剂对细胞表现有明显的毒性作用，这限制了它们的潜在应用;但这些浓度对于有效地抗疱疹病毒是必要的，因为它们可造成这种病毒膜的破裂。已有报道，表面活性剂可灭活一些种类的人体免疫缺陷病毒(HIV)，至少在体外是如此。
另一类在体内抗病毒，癌症和炎症细胞的活性大分子是相对无毒的dsRNA，它们在体温(37℃)生物性质是不稳定的，这限制了对它们的应用及掌握。例如，在液态，一些dsRNA一定要在4℃小心贮存从而防止它们的分子破裂。由于这些原因，dsRNA服用时，要注射进病人的血流中。本发明人现通过在生理可用载体中将表面活性剂和dsRNA混合起来可产生许多出乎意料的性质。这些特性包括(a)dsRNA抗受温度影响的酶破裂的稳定性，(b)协同生物活性，结合物与每一单一化合物比较确实拓展了抗微生物谱，(c)由于横跨膜穿过在带负电荷dsRNA核心分子周围形成的三元或四元复合物容易，使局部细胞吸收更易，从而导致细胞内生物活性物质浓度更高。最重要的是，结合物对HIV及一些其它性交传染的疾病(包括疱疹病毒家族成员)显示出高度专一生物活性。因此，本发明人引出了一系列新的三元复合物(双链互补失配的RNA加表面活性剂，它在dsRNA周围形成分子团)，它们具有新的生物物理和生物学性质。单独复合物，或带有辅助淋巴因子和/或逆向转录酶抑制剂的产物在所有各种病原体入口产生了更高的宿主保护能力。本发明的这些和其它性质在下面做更详细介绍。使用的表面活性剂可是天然阴离子，阳离子或非离子表面活性剂。一般来说，在局部应用中的这些制剂的有效性应归属于它们溶解各种含脂质膜的能力，因此可根据它们的这种能力来作杀精子剂及用来溶解疱疹病毒-1和-2的病毒粒子结构，见Asculai等人的美国专利，号4，507，281，这里引用的专利用作参考。
更具体来讲，已发现在阴道避孕药中非离子表面活性剂已大量用作杀精子剂，一种具体叫壬苯聚醇-9的非离子表面活性剂已广泛用于避孕乳膏和泡沫剂中。可是，在应用这些表面活性剂时必须小心，因为它们对正常细胞能造成毒性(Asculai等人，《AntimicrobialAgentsandChemo.》，13卷，686页，1978)。Rapp等人观察到人体α干扰素(一种蛋白质)与壬苯聚醇-9的协同作用，即专一抑制HS-2型(Rapp等人，《AntimicrobialAgentsandChemo.》，28卷，449页，1985)。Hicks等人(Lancet，2卷，十二月，21/28，1442页，1985)还谈到用壬苯聚醇-9的浓缩物(单独使用)在体外对HTLV-Ⅲ(HIV，形成的HIV病毒)的灭活，壬苯聚醇-9浓度为0.05%或更高。Hicks还观察到，当壬苯聚醇-9浓度高于1%时，对正常淋巴因子的毒性作用。应注意到由于壬苯聚醇-9在商业上可用杀精子浓度范围是1%-5%(Voeller，Lancet，1卷，1153页，1986，5，17)，则当壬苯聚醇-9进攻游离的HIV的淋巴细胞中的HIV时，它也可损害正常的生殖泌尿细胞。爱滋病疫苗可望在未来几年中有所进展(见Fauei，Proe.Natl.Acad.Sci.USA，83卷，9278页，1986)，控制传播的各种步骤应迅速实施。Fauci指出“如果志愿者证明是安全和有效的主要的问题集中在谁来试验这种疫苗，即使在男性同性恋者中，这项研究也是困难的”。这强调了拓展重要性，即马上采取一些局部有效的步骤以减少在性接触中病毒和其它微生物传染的风险，从而防止它们进一步传播给大众。例如，Fauci估计单在美国这种潜在的带菌者有150，000人(HIV)。
治疗病毒疾病的局部应用组合物见专利文献。治疗疱疹单一传染病的组合物含有人体干扰素，抗病毒非离子表面活性剂(壬苯氧基聚乙氧乙醇)和载体，见Asculai等人的美国专利4，507，281。诱导干扰素的多聚核苷酸，如dsRNA多核肌苷酸多聚核糖胞苷酸(polyribocytidylicacid)，或多聚I.C，在Field等人的美国专利4，283，393中有介绍，其中干扰素诱导物(多聚I.C)与水溶性聚合物均一混合以治疗对干扰素治疗敏感的、由病毒感染的皮肤，眼睛和粘膜组织。Levy在美国专利4，024，241中谈到抗核酸酶的polyI.C的亲水复合物，它与多聚-1-赖氨酸和羟甲基纤维素复合。多聚I.C简单的混合物可制成水溶液，软膏，乳膏或液体制剂，见Lampson等人的美国专利4，124，702。
多聚I.C的毒性在文献中有报道(Adamson，Nataoe，卷223，1969，8，16)，由于这个原因，多聚I.C的治疗用途已很大程度上摈弃了。相反，用于本发明药物组合物的失配dsRNA毒性相对是低的或是没有的。本发明在这里进一步谈到失配dsRNA的降解产物(碎片)，由于它可长期贮存，故它能长期保留生物活性并在一些条件下比母化合物更有活性。
综上所述，应注意到存在的HIV病毒至少有两种不同的命名;LAV是由法国巴黎的巴斯德研究所分离出的HIV病毒，HILV-Ⅲ是由美国MarylandBetheda的国家卫生研究所分离出的HIV病毒。在本文中，时常提到的病毒通指或特指HIV或HILV-Ⅲ或LAV(无意区别它们)。进一步来讲。本发明说明书和权项中的术语“HIV”包括所有其它病毒，这些病毒可对人产生HIV传染病，病人包括血清阳性无症状的带菌者，带有综合症的爱滋病患者，ARC和患免疫缺陷疾病综合症患者和爱滋病患者，它们已从人群中隔离和没隔离。
在1987，3，11公布的欧洲专利0，213，921中，专利标题为“用双链RNA治疗病毒感染疾病，该发明谈到专门用Ampligen作原型dsRNA来抑制在人体细胞培养中的HIV。
阳离子表面活性剂是更好的表面活性剂;但非离子和阴离子表面活性剂也可使用。适宜的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸钠和烷苯基硫酸钠。适宜的阳离子表面活性剂包括季铵洗涤剂，如十六烷基吡啶翁氯化物和苯并烷氧翁氯化物(benzoalkoniumchlorides)。与阳离子和阴离子表面活性剂相反，非离子表面活性剂不含离子基团并不带分子电荷;它们通常靠它们的整个分子显示表面活性。
然而，几乎所有疏水化合物在结构上都有带游离氢的羧基，羟基、酰胺和氨基，游离氢连在氮上，该疏水化合物与环氧乙烷反应形成非离子洗涤剂。在本发明中，介绍了失配dsRNA与表面活化剂复合的新的三元复合物;dsRNA也有疏水性，它导致两条互补链中的核苷酸碱基形成紧密的双螺旋结构。在本发明中，能形成三元复合物，即RNA链“1”加互补RNA链“2”加表面活性剂生成三元(或三员)复合物，它具有完全新的生物物理和有治疗作用的主要生物性质。
图1表示单独的失配dsRNA，两个RNA链的二元复合物表示在dsRNA体表面上带有整个负电荷。
图2表示本发明的失配dsRNA三元复合物(两条互补的但失配的RNA链由阳离子表面活性剂包围)，带有带正电的阳离子表面活性剂颗粒朝着带负电的dsRNA表面，表面没极性的残基朝着远离dsRNA体一边。
表面活性剂的相对浓度(此例中为阳离子)将控制生成的复合物相对极性，极性可根据不同的治疗用途变化。通过提供过量的表面活性剂，一旦三元复合物形成，则复合物的沉淀也就形成了，并能达到作局部应用的理想性质。
本发明关键之一是在dsRNA或周围形成分子团(与中性，阳离子，阴离子表面活性剂)以便强化新的治疗特性一也就是高(局部的)生物活性。分子团定义为将带有双官能度分子加到另外的水溶性(水相容)底物(如dsRNA)中形成的结构。本发明中的双官能度是指分子一端是极性的(如，与水互溶的是极性的)，另一端是非极性的(如，更亲和脂质的一象细胞膜的基本组分)。生成理想的三元复合物(即生成分子团)是指复合物具有两个以上优点从而有更好的治疗活性，这些优点帮助复合物更快地通过靶细胞的细胞膜(癌细胞，病毒感染细胞，免疫细胞等)。
性质1使横跨膜转移容易的关键特性是要使三元复合物(分子团)达到理想的表面负荷(与没复合的(二元的)dsRNA比较)并提高疏水性，这将使到达细胞膜并与细胞膜有效的融合容易并促进吸收。
性质2下面介绍的三元复合物的具体性质(包括，但不限于分子团复合物)将使细胞吸收更容易，它是通过细胞吞实噬作用附加的性质使分子团形成最大程度产生。吞噬作用这里是指细胞的外突(术语叫胞饮空泡等)自然地吞食dsRNA的三元(或四元)复合物颗粒。由此促进它们转移到内细胞(相对外细胞)腔隙的过程，它是在人体上产生最大生物活性的必要步骤。吞噬作用过程也可存在于生物破裂的dsRNA，如，失配的dsRNA。
表面活性剂的克分子份数(相对浓度)将控制生成的复合物相对极性，复合物极性可根据不同治疗用途改变。通过加过量表面活性剂，一旦三元复合物形成，复合物的沉淀就生成，并能达到用于局部用途的理想性质。
描述本发明应用的具体例子是阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵(缩写为CTAB)与dsRNA之间形成的三元复合物。由于它的极性残基的基本性质，它将以这样的方式朝向dsRNA，该方式指dsRNA在带正电荷洗涤剂(带有酸基)周围提供负电荷(见图表)。任何碱性(阳离子)洗涤剂可替代CTAB并生成分子团，它比将dsRNA放在简单脂质结构(如脂质体)中更稳定，生物活性更高，因为在这种简单脂质结构中ds RNA是由很弱的疏水键连接在一起的。由于这种结果，在调节分子团时，洗涤剂极性应使ds RNA表面的负电荷尽量减少，这样大量无极性三元复合物通过细胞膜将会容易。分子团聂入的其它特性可通过提供对靶细胞的附加特性来实现，如形成四元复合物，其中第四个成份提供专一向性或对一些细胞种类有吸引，例如，通过结合HIV蛋白质，gp120，将生成的复合物射向T4淋巴细胞，如果初始目标要处理或预防逆病毒的话。
以三元复合物，尤其以分子团为代表的dsRNA不仅稳定，而且保护了对热不稳定的dsRNA，如上解释，它促进了dsRNA吸收并增强了失配dsRNA的作用。提供的分子团结构改善了药物与细胞表面的连接。分子团上净表面电荷对大多数细胞更具吸引力并/或更相溶。相反“裸露的”失配dsRNA有高的负电荷并自然受细胞排斥。dsRNA三元复合物分子团通过电荷吸引为细胞所接纳。第二，分子团结构使dsRNA形成微粒复合物，接着提供了如上面详细解释的吞噬作用的机制。无论载体/三元复合物什么时侯形成，都不可避免地形成失配dsRNA的独特生物活性片断，并且这些生物活性片段是理想的。这原因是这一核糖核苷酸酶，这些片段为什么形成的化学原因是广泛处在的，并且无论复合物形成什么，片段都或多或少地形成。形成具有这些生物活性片段的分子团的能力提供了扩大本发明用途的一个关键实施方案。
当药物制剂(乳膏，洗剂等)放在药房架上等着调配时，不可避免地有生物物理性质的变化。贮存可在-4℃，7℃或室温(通常为20℃)。
抛开负电特征，这些变化已在本发明前存在，即在更好的实施方案中，产物由失配的dsRNA核开始，目标是由起始物生成三元或四元复合物。具体来讲，这意味着大分子RNA不可避免的衰变将放出生物活性残基，分子量低的物质，它们与表面活性剂复合生成与类似理想的药物性质有轻微不同的分子团复合物。
整个过程中，该产物不断表示有生物治疗活性，即使RNA核的数目继续减少，因为当RNA核被消化时，dsRNA母体的生物活性碎片将不断增加。因此，生物效果在整个时间持续或略微增加，因为dsRNA的强生物活性碎片不断释放。因此，这里用的“稳定”意指产品在整个过程中保留治疗活性。
本发明应用的非离子表面活性剂可至少归纳为三类(1)醚连接的(如分子的亲水和疏水部之间)如聚氧乙烯乙醇，脂肪酸的聚氧乙烯酯，聚氧乙烯烷基苯酚或硫醇或烷基胺;(2)由酯或醚-酯连接的;(3)由酰胺连接的。离子洗涤剂也可使用，见本发明在其它应用中的介绍，尤其在形成新的分子团中，它可导致快速产生细胞内dsRNA和其生物活性片段的高浓度。醚和酰胺连接的表面活性剂在本发明中是更好的实施例，例子有壬苯聚醇-9;曲通-100(对-二异丁基苯氧基聚乙氧乙醇);聚氧乙烯油醚(也称Brij97);Onyx-OL(也称Onyx-OL345)。在发明的下面描述中，使用的表面活性剂量在0.01%-20%，虽然更好的范围是在12%(重量)以下，最终组成随相关失配dsRNA的含量、治疗对象和特定的给药方式而变化(如，在某种程度上衣原体比HSV-2更能够抗三元复合物)。失配的dsRNA含量范围最好占组合物重量的0.01%至10%或更多依赖具体组成(例，dsRNA溶解度在悬浮液不是限制因素)和产物打算处理的条件。当使用dsRNA碎片时，浓度上限可仍高，因为任何溶解度限制已解除了。无论组合物中dsRNA对表面活性剂的相对量是多少，药物组合物的平衡通常可简单由惰性，生理相容，药物可用的载体组成。
本发明现从历史角度介绍一下本领域(卡特等人，J.Biol.Resp.Modifiers，4卷，P495-613，这里用作参考)。dsRNA在临床上作为潜在抗癌的抗病毒药过去被大大忽略了，这是因为首次临床试验dsRNA-多聚肌苷酸多聚胞苷酸(多聚I.C或rIn·rCn)产生了更多临床毒性和缺乏效果所致。然而，本发明前面谈到的失配dsRNA双螺线很少造成导致恶病质的肿瘤坏死因子(TNF)(一种高毒性淋巴因子(蛋白质)的诱导。从而提高了治疗活性也降低了毒性。dsRNA确实比干扰素抗各种肿瘤和各种病毒(包括HIV)更有活性(卡特等人，Lancet，1987，6，6，这里用作参考)。然而，药物“组成”和失配dsRNA的贮存，即具有最佳治疗效果的dsRNA形式与它体内作用时间已表明是一麻烦的问题，而本发明克服了这一障碍。数据表明，一旦失配dsRNA置于水溶液中，它就一定要在4小时内注射进患者或动物中，否则就失效。这种“失效快速用途”步骤是肯定的，因为在4℃左右的药物不断地进行降解，部分是由于各种核糖核酸酶的广泛存在，如，使dsRNA降解为失配dsRNA的酶尤其敏感。这些酶本身是到处存在的，在玻璃皿的无菌水里，可检测手上的汗中就存在这种酶。按照本发明介绍的操作法可以将失配的dsRNA产物冷冻干燥(真空冷冻干燥)成粉末加以安全地保护。
本发明在室温通过形成具有高稳定性的新型三元复合物已有效地克服了长期贮存障碍。失配的dsRNA对核苷酸酶的进攻是脆弱的，但周围通过与表面活性剂复合(形成三元复合物，使dsRNA的降解产物保留了活性，并且通常比母化合物活性更高，见下面介绍。
在本发明人最近公布的另一篇文章中(Brodsky，卡特等人，J.Biol.Res.Mod，4卷，P669，1985);尤其见P673图1，本发明人注意到(a)核糖核酸酶抑制剂可加到管中，在管中，失配的ds RNA处于易变的/不稳定状态，(b)体内ds RNA稳定性是非常短暂的，它是由分钟计算的，即注射的ds RNA T1/2(半衰期)(例，r In·r(C U)n也称为Ampligen ，HEM研究用的商标公司)，人体血清中的T1/2估计为20分钟±15分钟。不同人的水解酶含量是不同的，这在前面关于这问题的研究中已提到本发明对群体(大约115个人)dsRNA代谢的时间研究表明他们都有快速降解dsRNA的足够酶水平(内或外核苷酸酶)。
本发明是局部应用的药物的化合物，用于治疗对用失配dsRNA治疗敏感的疾病，如病毒传染病，皮癌等，其中dsRNA以生物活性形式局部应用。在双链RNA的三元复合物中，失配的dsRNA表现正常的热变性，这里定义的失配dsRNA与阴离子，非离子或阳离子表面活性剂或洗涤剂复合。通常活性成份与表面活性剂形成分子团，也可以母化合物(失配的dsRNA)或母化合物的生物活性碎片存在。
用本发明局部使用组合物治疗的疾病包括那些对失配dsRNA治疗敏感的和那些以失配dsRNA为唯一给药途径的疾病。这些疾病包括，但不限于(1)人体逆病毒传染病(包括HIV)，(2)疱疹病毒家族，如单一疱疹和大叶藻疱疹;(3)巨细胞病毒或CMV(有时分类为疱疹病毒)，(4)局部皮癌并且不带病毒病因体，(5)敏感的，由性接触传播的病毒疾病和性传染病，包括衣原体(上列许多疾病是性接触传染的)，(6)性传染病，其中正选病毒药对于另一种性病治疗是首选或次选的，而该性病本身对用失配dsRNA治疗是不敏感的或不能控制的，那么该性病可用另一治疗方式治疗(如并发淋病患者用四环素治疗)。
本发明组合物包括药物制剂，如液体溶液如，等渗眼药水，等渗滴鼻剂，喷雾剂，洗剂，乳膏，泡沫剂，胶丸和粘液剂，粘液剂包括对生殖泌尿系统有良好耐受的润滑剂和/或对生殖泌尿系统有良好耐受的杀精子剂;固体和半固体制剂有软膏，眼用软膏或乳膏，乳膏，油膏，栓剂(直肠和阴道)，棒状剂如用于治疗单一疱疹疾病的唇膏，眼插入物(eyeinsrts)。
“失配dsRNA是指那些失配dsRNA双链之间的氢键(碱基层)是相对无损伤的，即，在29个连续碱基平均断裂少于1个。失配是指由于链的内陷(或外突)使RNA双螺旋的正常几何结构打断，链内陷(或外突)表示核糖核酸酶的消化造成的dsRNA易断点。由此可理解术语“失配dsRNA”。
ds RNA可是多聚肌苷酸与多聚胞苷酸复合物，该复合物含尿嘧啶碱基或胍碱基的比例为由1∶5到1∶30(多聚I.多聚(C4-29X＞U或G)。
ds RNA的通式为r In.(C12U)n。其它ds RNA的适宜例子见下面。
在较好的失配ds RNA中，r In·(C12′U)n′，一个区域含6至12碱基对的连续链，也就是该链为整个RNA螺旋链的一半。这即可以生物触发淋巴因子的释放，也可促使细胞内辅助因子生成含天然抗病毒的酶。含尿嘧啶基的失配区域定期加入到多聚嘧啶链中以加速ds RNA水解，从而防止了毒性。
用于本发明较好的失配ds RNA产生于选自多聚(Cn′G)的(其中n 4到29的整数)的其聚核苷酸，它是多聚核糖核酸与多聚核糖胞苷酸形成复合物的失配类似物，它是通过修饰r In·r Cn，沿多聚核糖胞苷酸链加进不配对碱基(尿嘧啶和胍)形成的。另外，ds RNA也可以从多聚(I)，多聚(C)ds RNA中衍生得到，它是通过修饰多聚核糖核酸(r In)的核糖基骨架形成的，例，2′-氧-甲基核糖基。在这些r In·r Cn的失配类似物中，较好一类是通式为r In·r(C11-14U)n和r In·r(C29′G)n，见Carfer和Ts′o的美国专利4，130，641和4，024，222，这里用作参考。因此，根据本发明，通常提到的ds RNA都适合于使用。
用于本发明的失配dsRNA的例子还有poly(I)·poly(C4，U)
poly(I)·poly(C7，U)poly(I)·poly(C13，U)poly(I)·poly(C22，U)poly(I)·poly(C20，G)poly(I)·poly(C29，G)和poly(I)·poly(Cp)23G＞p本发明可通过向三元复合物中加进另一种淋巴细胞活素来实施-这一添加物的目的在于进一步调节可与局部使用双链RNA反应的细胞数目及其特性。例如，向三元复合物中加入白细胞介素将带来T-淋巴细胞的进一步吸收，如图与双链RNA产生协同治疗作用。附加用途的类似原理可来自与其它淋巴细胞活素的结合，如干扰素和肿瘤坏死因子等，但不仅限于此。这些淋巴细胞活素在局部癌症和某些病毒传染病治疗上可能具有特殊用途。在某些情况下，也可以加进偶氮二胸苷或gangclovir等特定的病毒抑制剂。
为了证实产生的四元络合物的潜力，本发明人制备了含有5，000-20，000单位IL-2和10毫克双链RNAD药用洗液(在本文中称作A)。将该洗液的浓缩部分立即施用到(无毛)小鼠的已被人黑素瘤(皮肤癌)细胞感染的区域上。未处理的如皮下注射的肿瘤细胞生长，其结果是实际上该动物被肿瘤块损害表面。但是，接受了IL-2/dsRNA/表面活性剂洗液的动物比它们的未处理对应物显示出迅速的肿瘤消退和旺盛生长。
通过使用能够测定具体的免疫活性相关细胞数的流动血细胞计数技术，分析免疫细胞的脾下繁殖，本发明人也能够证明此复合物团的增效作用。与未处理的相比，其增长是NK(自然杀伤)细胞一单独使用dsRNA时的63%对与白细胞介素-2结合使用时的87%[用于流动血细胞计数器的抗体标记物是ASGMI];LAK(淋巴因子活性杀伤剂)细胞一单独使用dsRNA时为228%与白细胞介素-2结合使用时为412%(用于流动血细胞计算器的抗体标记物是Thy1，2)T淋巴细胞一单独使用dsRNA时无明显增长，而与白细胞介素-2结合使用时为263%[用于流动血细胞计数的抗体标记物是L3T4]。作为阴性对照，本发明人发现没有一种局部使用的洗液能影响在脾中测得的T8(抑制)淋巴细胞的数目。
如此所述，淋巴细胞活素包括干扰素(最好是α-干扰素)、白细胞介素[尤其是白细胞介素-2(IL-2)和重组白细胞介素-2(rIL-2)]和肿瘤坏死因子(TNF)。还包括淋巴细胞活素活化的杀伤(LAK)细胞，它是对淋巴细胞活素的暴露应答而于动物内产生的。在配制过程中除淋巴细胞活素外可能包括逆转录酶抑制剂，如3′-3′-脱氧胸苷(AZT)，或以其代替淋巴细胞活素。
当使用干扰素(α)作为淋巴细胞活素时，其剂量为所用的病人体液量的每毫升0.01至100，000 IRU。当淋巴细胞活素是IL-2(最好是r IL-2)时，服用的剂量范围从约每千克病人体重102IL-2单位直至接近该病人的毒性不可接受水平值，它可能高达106IL-2单位。但是，最有效的毒性反应剂量范围是从每千克体重约103至104IL-2。
常服用的dsRNA的量范围从每毫升病人体液0.1至1，000微克dsRNA。术语体液意指血清，盐，维生素等溶液，它在抗体中循环且浸润组织。当服用两种试剂(dsRNA和一种淋巴细胞活素和/或逆转录酶抑制剂)时，它们通常是作为一种混合物被服用，但可以单独服用，同时或依次进行。
dsRNA和淋巴细胞活素的“结合”服法包括提供作为治疗混合物一起服用的两种试剂，还包括两种药剂单独但同时服用的步骤。“结合”服法也包括一种药物的单独服用，即先给服用其中一种，紧接着再服用另一种。
本发明人曾观察到一种预先未测得的生物化学异常，其中，一种与机体抗癌症和病毒疾病防疫机制相关的关键酶(RNaseL)是以一种加速的和明显的未控制方式起作用。以上这些观察结果以及其它的观察结果在本发明人1987年7月17日递交的系列申请(序列号为074，649)中已有所述，其题目为“双链RNA对与非控肿瘤细胞和病毒生长周期相关的异常代谢途径的校正”，其公开在此作为参考文献使用。在单独实验中，本人比较了这两种不同细胞(带有异常RnaseL的细胞)低抗病毒攻击的相对能力。发现在那些具有异常RNaseL活性(它如此迅速地产生NCP)的细胞中子代逆病毒的滴度(产量)明显增高。
如上所述，在本发明人1987年7月17的美国专利申请中已报道，双链RNA(尤其是失配dsRNA)使RNaseL的催化和降解产物恢复到了正常状态。而且，被双链RNA所恢复的正常状态恢复率可通过预先暴露于淋巴细胞活素而提高。
在下面所述的实验中，首先从冻干粉末中重建dsRNA，然后与各种表面活性剂(重点是使用非离子表面活性剂)混合。在一些实验中，尤其是当将产生的复合物应用于表面或生物腔等时，本发明人使用于惰性载体。将dsRNA/表面活性素复合物过夜保温，该混合物用标准介质盐稀释以用于表1和表2中的一些性质检测。
这些新的药用组合物将有很多种局部服用方法。如，可将组合物引入到感染区域，或还未感染的区域，但以预防模式引入，微胶囊形式，如使用脂质体或类脂质体。也可以将它们以泡沫、喷雾剂、塞棉阴道或直肠栓剂引入，或在制造过程中直接加到避孕套内或避孕套上。没有本发明，后一种方法(避孕套引入)将不可能，本发明能够延长失配dsRNA或其生物活性片段在室温(20℃-23℃)下的稳定性和连续生物活性，且提供可靠的产物贮藏寿命。例如，使用Reddy在美国专利4，415，548号中所述的机械方法插入dsRNA/表面活性素复合物，可以很容易的实施本发明(该专利叙述的是制备一种经润滑的杀精子男性避孕药)。
尤其是，本发明也克服了某些杀精子剂如普通的壬苯聚醇-9(壬苯氧基聚乙氧乙醇)的某些不利作用，因为本发明使壬苯聚醇-9的有效浓度减少了。如下详述(见表2)。用本杀精子剂可证实阴道炎和胚胎坏死及胚毒性[Tryphones等《Toxicology》39卷(2)，1986年5月，177页]。本发明人也使用其它杀精子剂进行过类似实验，这些杀精子剂包括精子精虫头粒蛋白的芳基-4-胍基苯甲酸酯(NPGB)抑制剂，在生育过程中具有基本作用的一种酶;这种NPGB分子可依照Kamcnski等[《J.Med.Chem.》(Apr)29卷(4)，514页1986]所述的方法从FDA证实的苯酚合成。与本发明相适合的其它杀精子剂包括醋酸洗必太[由Sharman等所述，《Fertil.Steril》45(2).Feb.，P259，1986];孟苯聚醇[见Lamptey等《Contraception》32(5)卷，11月，445页，1985];洁尔灭[不是壬苯聚醇-9一样通过鞘壁吸收，如Zufferey所述，见《J.Gynecol.Obster.Biol.Reprod.》(巴黎)14(3)卷，359页，1985);和最近所述的两相同壬苯聚醇-9系统，其中润滑系统含有硅胶、壬苯聚醇-9和杀精子膏[见Rodgers-Meeme等《Fertiliz.Steril.》43(6)卷，6月，931页，1985]。在后一种情况下，很显然可以将大约2.0毫克的dsRNA加到0.45±0.1毫升硅胶液(含有6.6%±0.5%表面活性剂)的润滑系统中，或加到0.45%±0.1%毫升(聚乙烯乙二醇400(大约63%)和聚乙烯乙二醇3350(大约30%))的杀精子膏基质中。以上都是一些简单的非限定实例，适用于辅助各种避孕模式。
重要的是，本发明人所述的药用组合物既具有抗微生物活性，也具有抗病毒活性(如见表2)，在Asculai和Rapp的美国专利4，507，281号中也指出了这一点是可行的(在该申请中他们将干扰素与壬苯聚醇-9结合)，现在的情况是，干扰素(单独的或与某些表面活性剂混合的)对许多病毒相对无活性，尤其是对人免疫缺陷病毒。至今没有提出一种象本发明人所述的那样新型大分子聚集物，在两种生物特性中明显变化及在某些生物物理性中相应变化。在使用低角激光散射(且用studier方式校正到S20W)观察到表现分子量增加的同时，本发明人也观察到在分析超离心时表观分子量没有改变，这可能是由于三元复合物的新水化膜的“障碍物”作用抵销了质量上的明显增加。
表1和表2显示了本发明的典型结果。该结果在新生物物理特性(增加了三元复合物的热稳定性)和新的生物特性(扩大了抗病毒和抗微生物的范围)方面表现极为明显。
表1与表面活性剂复合的dsRNA的生物物理如生物化学特性的稳定作用组成/浓度时间(37℃)1分子量(est)2专一活性3(在25%的人 (S20W) (2′-5′oligo A血清中)合成)%1.失配dsRNA010.5100(2.5毫克/毫升)1小时6.3906小时2.1＜524小时不可测＜348小时不可测＜372小时不可测＜390小时不可测＜32.失配dsRNA010.5100(2.5毫克/毫升)1小时10.5100加上壬苯氧多乙6小时10.0100氧乙醇(壬苯聚24小时8.390醇-9以1%溶于48小时4.540生理缓冲液)72小时3.02590小时不可测＜3
表1与表面活性剂复合的dsRNA的生物物理如生物化学特性的稳定作用组成/浓度时间(37℃)分子量(est)专一活性(在25%的人(SW)(2′-5′oligoA血清中)合成)%3.失配dsRNA010.5100(2.5毫克/毫升)6小时10.095加上聚氧乙烯24小时8.58.8油醚(1%)48小时6.070说明①得自捐献者的库存血清是用作内-外溶核酶源;
②2分子量的测定如前所述(Carter等，《J.Mol.Biol.》70卷，567页，1972);
3.低聚2′-5′A合成酶诱导如前所述是以多聚IC作为对照(100%)在二倍体人成纤维细胞提取物中测得(Cartes等，《J.Biol.Resp.Mod.》，4卷，613页，1985)。
表2dsRNA/表面活性剂复合物的组成扩大了抗包括病毒在内的病原的范围组成浓度 HIV滴度1HSV-2滴度2衣原体(原生小体数)1.ds RNA 0 微克 1×1065×10610810 微克 5×1053×10610530 微克 1×1055×10410550 微克 1×1032×10495200 微克 ＜10 8×103802.壬苯聚醇-9 0% 1×1065×1061105% 3×1033×1031101% 3×1034×1051100.05% 2.5×1038×1051080.01% 3×1035×1061103.dsRNA/01×105×10108壬苯聚醇-930微克/5%＜101×102030微克/1%＜102×102530微克/0.05%＜101×104030微克/0.01%＜105×1055
说明1使用Hicks(出处同上)所述的ID检测。简单地说就是，在上述形成物存在或缺乏的情况下暴露于正常个体的外周血细胞，然后用一微培养物系统滴定感染HIV;在第21天终止培养，收集上清液，用标准方法测定HIV逆转录酶。2HS-2是在甲基纤维素涂布后利用噬菌斑的形成在融合HEL细胞中测得;3，在96孔微滴定平板中通过使用在Mc Coy细胞单层中的计数检测原生小体;将含有已知数目的内含物(形成单位/毫升)的标准化接种物加到每孔中，且与各种形成物一起保温60分钟(Kappres等Sexully Transmitted Diseases》13卷，134页，1986)。
下面是含有非表面活性剂1，2，3和ds RNA的合适组成的典型例子药膏A纯水41.00克晶形蜡3.00克羊毛脂10.00克矿脂41.00克脱水山梨醇含油酸基化合物4.75克多乙氧基醚0.25克dsRNA10-180毫克药用洗液纯水7.00毫升油酸1.50克聚乙烯二醇-硬脂酸10.50克Carbpol-93442.25丙二醇24.75毫升三乙醇胺1.00毫升硅流体10.00毫升dsRNA10-180毫克药膏B鲸蜡7.5%蜡12.0%矿物油56.0%硼酸钠0.5%脱水山梨醇含油酸基化合物5.0%水19.0%dsRNA1-200毫克所用表面活性剂的类型如下1，典型的酯或醚-酯胶连接物，如脱水山梨醇(单或三-硬脂酸盐)、脱水山梨醇含油酸基化合物、倍半油酸盐、三油酸盐、聚氧乙烯、脱水山梨醇甘油-月桂酸酯脱水山梨醇甘油-棕榈酸酯。2，典型醚-酰胺连接雾，如脂肪链烷醇酰胺，包括onyx-ol、unamide、单胺和月桂二乙醇胺，如聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、onyx-ol对-二异丁基苯氧-聚乙氧乙醇、壬苯氧基聚乙氧乙醇、聚氧乙烯油醚等。3醚连接物在本文中已述，且包括聚氧乙烯烷基酚、聚氧乙烯醇、脂肪酸的聚氧乙烯、聚氧乙烯硫醇和聚氧乙烯烷基胺等。
本人也评估过多种复杂组合物，包括那些含有淋巴细胞活素或相关介体物的物质，以测定它们对本发明的适合性。尤其是，例如洗液，本发明人向局部制剂中加入了干扰素和/或某些2′-5′A核心分子，它包括带有RpRp、SpRp、和RpSp核苷酸间连接物的三种2，5-硫代磷酸酯三聚体核，本人最近已证实该连接活化与细胞间宿主防疫途径相关的RNaseL。具有合适载体的某些产物(如单层脂质体、单克隆抗体、重组病毒被膜等)也可细胞内引入，以提供一种辅助的抗病毒、免疫和抗癌症特性。
权利要求
1.局部应用的药物组合物用于治疗对用失配的dsRNA治疗敏感的疾病，组合物含在药物可用局部载体中，有效量的失配dsRNA存在失配双链dsRNA与表面剂形成的三元络合物中。
2.权项1的局部应用药物组合物，其中三元复合物是分子团，分子团中的失配ds RNA由表面活性剂环绕。
3.具有杀精子和抗病毒活性的局部药物组合物含有杀精子有效量的杀精子剂，在药物可用载体中，失配ds RNA占组合物的0.001%至10%(重量)。
4.权项3的杀精子和抗病毒活性局部药物组合物，还包括对人体生殖泌尿系统无刺激的润滑剂。
5.用权项3或4药物组合物包衣的避孕套。
6.治疗对失配ds RNA给药敏感的皮肤，眼和粘膜组织病毒传染病的方法，其特征是，将含治疗有效量的失配ds RNA的稳定药物组合物局部用于病毒感染的皮肤，眼和粘膜组织，其中失配ds RNA的形式为双键RNA与表面活性剂形成的三元复合物。
7.权项1的组合物，其中ds RNA量为占整个组合物的0.001%至10%(重量)，表面活性剂量为占整个组合物的0.005%至20%(重量)。
8.权项1组合物，其中失配ds RNA是多聚核糖核酸与多聚胞苷酸的复合物，此复合物含尿嘧啶碱基或胍碱基的比例为1∶5～1∶30。
9.权项1组合物，其ds RNA含键断裂区域，并且这种ds RNA展现出良好治疗效果，如r In·r(C11-14)Un。
10.权项1组合物，其中ds RNA是r In·r(C11-14U)n。
全文摘要
局部应用药物组合物中的用表面活性剂稳定的dsRNA三元复化物，也可包括淋巴因子和/或逆转录酶抑制剂，局部应用于感染的或裸露区的治疗或预防病毒传染病，如疱疹病毒和其它传染病，尤其是性传染疾病。双链互补的RNA加适宜的稳定的表面活性剂形成三元复合物可抗温度造成的酶灭活。
文档编号C07H21/02GK1031325SQ8810495
公开日1989年3月1日 申请日期1988年8月12日 优先权日1987年8月12日
发明者威廉姆·阿·卡特 申请人:Hem研究公司