合成多肽的制作方法

专利名称：合成多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及合成多肽，具体地说，涉及仿效病毒被膜蛋白质特定区域的三级结构和/或静电表面和/或其它物理，化学和结构属性的合成多肽。它对于与已知作为获得性免疫缺损综合症(爱滋病)病原体的人体免疫缺损病毒(IHV)有关的疫苗，免疫活性治疗剂，诊断和其它医用或科研药剂的设计有着特别的意义。
过去的十年中，爱滋病成为世界性的严重医学问题，并且对于用作研究，诊断，治疗和/或预防被HIV(爱滋病的病原体)感染的物质存在普遍紧迫的需要。随着由HIVⅠ和HIVⅡ病毒产生的蛋白质氨基酸序列(见，例如，Ratne，L.etal.，Nature313，277(1985);Meusing，M.A.etal.，Nature313，450，(1985);Wain-Hobson，S.etal.，Cell40，9(1985))的可得性，设计仿效病毒被膜蛋白质抗原属性的合成多肽成为可能。
本发明的目的是开发能引导HIV病毒的抗体，并且最好是中和抗体产生的合成多肽，这种抗体通过被动或自动免疫，预防HIV病毒感染和/或限制HIV病毒扩散。由这种抗体带来的被动免疫可以建立治疗爱滋病患者的有效方法，从而控制该病毒在体内和个体间传播，并由此减慢或停止该病的发展。
我们的发明提供了具有至少一株人体免疫缺损病毒(HIV)被膜蛋白质的至少一种抗原属性的合成多肽，所说的多肽大体由式(Ⅰ)的氨基酸序列组成X-R1-Leu-R2-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-R3-Lys-Y (Ⅰ)其中R1选自Gln-Gln-R4-R5，Gln-R4-R5，R4-R5，R5或R1缺失;
R2为选自Gln，Lys，Glu或Arg的氨基酸残基;
R3为选自Ile，Thr或Ala的氨基酸残基;
R4为His或Glu;
R5为Leu或Met;且X和Y可以各自独立地缺失或独立地为一个或多个氨基酸残基。
通常，当R1为Gln-GlnGln-R4-R5且X和Y存在时X和Y与天然的被膜蛋白序列不同源。更具体地说，当X和Y存在且R1如上定义时，X和Y不提供或构成至少一株人体免疫缺乏病毒的被膜蛋白质抗原属性的部分。
根据上述式Ⅰ的无X且Y存在的肽当然是有用的，例如，在产生抗HIV的抗体时。当与载体分子结合时，这样的肽会特别有效。然而，当X或Y存在时，它们可以是任何长度，但优选少于20个氨基酸，更优选的是少于10，例如3至6。显然，根据式Ⅰ的序列可以构成一种蛋白质，它以X和Y作为具有抗原序列的该蛋白质的主要部分，例如，球状蛋白上裸露圈的部分。
如果R1存在，R5是Leu或Met是优选的，更优选的是Leu，且R4如果存在，为His或Glu，更优选的是His。R2优选的是Gln，Lys或Glu，更优选的是Gln且R3优选的是Ile。
如式(Ⅰ)的序列中优选的是，R1为Gln-Gln-R4-R5或无，如果存在时，R4优选的是His且R5为Leu。R2为Leu和R3为Gln也是优选的。
如本发明的式(Ⅰ)的多肽优选的形式由以下序列组成X-Gln-Gln-His-Leu-Gln-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-Ile-Lys-Y(Ⅰa);和X-Leu-Gln-Leu-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-Ile-Lys-Y(Ⅰb)其中X和Y如上定义，虽然如果X或Y存在，它们为相对短的序列是优选的。最好X是缺乏的，且Y为2或3个残基长度，例如，Gly-Cys或Gly-Cys-Ala。考虑上述的Ⅰa和Ⅰb序列，优选的是缺X且在Ⅰa序列中Y为Gly-Cys和在Ⅰb序列中为Gly-Gys或Gly-Cys-Ala;这种C未端延伸为与载体结合提供了另一位点。
如式Ⅰ的多肽模拟了HIV1被膜蛋白质的某些表面部分。
如本发明的多肽的另一种优选的形式基本上由式(Ⅱ)的氨基酸序列组成X-R1-Leu-Arg-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-R3-Lys-Y (Ⅱ)其中R1选自Gln-Gln-Glu-R5，Gln-Glu-R5，Glu-R5，缺R5或R1R3为Thr或Ala;
R5为Met或Leu;且X和Y如上定义。
优选的是，R5，如果有，为Met且R3优选的是Thr。R1为Gln-Gln-Glu-Met或缺乏同样也是优选的。
根据式Ⅱ的多肽的优选形式由以下序列组成X-Gln-Gln-Glu-Met-Leu-Arg-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-Thr-Lys-Y(Ⅱa);和X-Leu-Arg-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-Thr-Lys-Y(Ⅱb)。
优选的是，缺X且Y为2或3个残基长度，例如，Gly-Cys或Gly-Cys-Ala。
根据式Ⅱ的多肽相似于HIV2的被膜蛋白质的某些表面。
根据本发明优选的多肽序列是依据它们与HIV被膜蛋白的一种或多种抗原决定子的表面构形相似性选择出来的。例如，对于一个抗原决定的特定的多肽原本设计成一种相似物也可以显示出与HIV被膜蛋白的一个或多个其它区域的表面克形相似性，这可能是由于遗传基因的复制，或因为该多肽是一种不连续决定子的相似物，或因为该多肽被设计成多价的。不连续的抗原决定基可以看作由紧密相对的序列的、其本身可以具抗原显著性的抗原决定基构成，且一个多价多肽可以在单多肽链上含有2个或多个(连续或不连续)决定子相似物，因此提供了一种方法以同时引导出抗体范围的产生，该抗体将认出HIV被膜蛋白上的2个或多个决定子。
本发明的肽可以被合成，例如采用标准的9-芴基-甲氧羰基(F-Moc)化学法(见，例如，Atherton，E.andSheppard，R.C.(1985)J.Chem.Soc.Chem.Comm.165)或标准的丁氧羧酸酯(T-Boc)化学法。为了对结构的正确性和通常超过85%的纯度水平，作认真的核对。可以采用各种色谱分析，包括例如高效液相色谱，和质谱分析。
本文中的所有序列采用标准的I.U.P.A.C.三字母代码缩写进行阐述。对氨基酸残基定义如下Gly-甘氨酸，Ala-丙氨酸，Val-缬氨酸，Leu-亮氨酸，Ile-异亮氨酸，Ser-丝氨酸，Thr-苏氨酸，Asp-天冬氨酸，Glu-谷氨酸，Asn-天冬酰胺，Gln-谷氨酰胺，Lys-赖氨酸，His-组氨酸，Arg-精氨酸，Phe-苯丙氨酸，Tyr-酪氨酸，Trp-色氨酸，Cys-半胱氨酸，Met-蛋氨酸和Pro-脯氨酸。
作为治疗使用，根据本发明的多肽或其抗体可以单独或与其它药剂如在不同的水平通过干扰病毒基因物质的复制起作用的3′-叠氮基-3′-去氧胸苷(AZT)(zidovudie)和/或阻遏形成病毒所必需的酶的HIV蛋白酶抑制剂一起给药。
根据本发明的多肽可以用作产生会与由宽广范围的HIV1和或HIV2株产生的被膜蛋白相互作用的多肽的构造表面/表面构形/静电属性，使它们非常可靠地引导出能与来源于几株或多株的HIV被膜蛋白相互作用的抗体的产生，进一步的优点可能从组合几种不同的多肽成一个大的多肽而产生。这种多肽可以具有通式(Ⅲ)[La-F]m-[Lb-G-]n-Lc(Ⅲ)其中F和G可以相互独立地为根据式Ⅰ和Ⅱb的任何一种多肽，L为连接序列，a，b和c各自独立地为0或1且m和n各为正数，例如1和10之间包括的。L优选的是短的构造灵活的多肽链部分如，例如且不限于Gly-Gly-Gly-Gly-Gly，Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro或Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala。应当明白，每次复制均可以具有也可以不具有根据本发明的多肽的不同变异体。
如由式Ⅲ定义的多价决定子相似物被称作假同多价。相同的决定子相似物的变异体基本上在单多肽链中复制。此外，简单的同多价多肽免疫原，它含有根据式Ⅰ至Ⅱb之任何一种决定子相似物之一的相同变异体的多样复制体，也预料会有效，并也包括在本发明的范围内。
预料假同多价免疫原多肽作为疫苗会特别有价值。作为疫苗，它们会以类似但不确定的专一性诱导一个范围的(中和)抗体产生，它们会与来源于较宽范围的HIV株的被膜蛋白之间相互作用，并且会由此在赋与保护性免疫上更有效。在构成异多价多肽上也有优点。该异多价多肽含有一种或多种根据本发明多肽之一的复制体(以任何顺序)和决定子相似物的一种或多种其它多肽相似物。这些由本发明提供的多肽，具有通式(Ⅳ)Ld-[G-L]m-F-[L-G]n-Le(Ⅳ)其中F为根据式Ⅰ至Ⅱb的任意一种的多肽，G为式Ⅰ至Ⅱb或其它序列任意一种的多肽，G为式Ⅰ至Ⅱb或其它序列任意一种的多肽，m和n各为正数，例如，1至10之间包括的，且d和e各自独立地为0或1。“L”优选的是短的构造灵活的多肽链部分，如，例如但不限于Gly-Gly-Gly-Gly-Gly，Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro或Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala。
应当理解，任意一种保留亲本多肽通式和功能的上述定义的多肽序列的抗原意义的亚片段和/或抗原意义的变异体都包括在本发明的范围内。具体地说，由具有可比构造和/或物理属性的残基替代任何一种特定的残基，包括由稀有氨基酸(例如，D-立体异构体)或合成氨基酸相似物替代，均包括在内。例如，在相同的部分(Set)由另一残基代替一个残基的取代，如下所定义，包括在本发明的范围内;Set1-Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Thy，Trp和Met;Set2-Ser，Thr，Asn和Gln;Set3-Asp和Glu，Set4-Lys，His和Arg，Set5-Asn和Asp;Set6-Glu和Glu;Set7-Gly，Ala，Pro，Ser和Thr。所有氨基酸类型的D-立体异构体均可以被替代，例如，D-Phe，D-Tyr和D-Trp。
在本发明的优选实施方案中，X和Y如果存在，可以独立地包括一个或多个具有作为T细胞表位能力的蛋白质序列片断，例如，通式1-2-3-4的氨基酸序列片断，其中1为Gly或带电氨基酸(例如，Lys，His，Arg，Asp或Glu)，2为疏水氨基酸(例如，Ile，Leu，Val，Met，Tyr，Phe，Trp，Ala)，3为疏水氨基酸(如上定义)或不带电的极性氨基酸(例如，Asn，Ser，Thr，Pro，Gln，Gly)，和4为极性氨基酸(例如，Lys，Arg，His，Glu，Asp，Asn，Gln，Ser，Thr，Pro)，在至少某些情况下显示出T细胞抗原决定基作用(Rothbard，J.B.&Taylor，W.R.(1988)。序列类型同于T细胞抗原决定基。(TheEMBOJournal7(1)93-100)。相似的片断可以是序列1′-2′-3′-4′-5′，其中1′相同于前述定义的1，2′相同于2，3′和4′相同于3，5′相同于4(同上)。这两种形式都包括在本发明的范围之内且一个或多个T细胞表位(优选的是少于5个)可以结合入根据式Ⅰ至Ⅱb之任一种多肽中。因此各表位可以是如上定义的类型或可以是其它结构且可以通过任何长度或组合物(优选长度少于5个氨基酸残基)的分离片断被分隔且包含例如选自Gly，Ala，Pro，Asn，Thr，Ser残基或多功能连接子如非α氨基酸。C或N末端连接子也可能代表完整的蛋白质，因此避免了结合于载体蛋白的可能需要。
根据式Ⅰ多肽的衍生物也包括在本发明的范围内。式Ⅰ中X或Y是或者包括“retro-inverso”氨基酸，即，具有相应于氨基酸功能基团的双功能酰胺。例如根据本发明的相似物，含有retro-inverso的氨基酸具有式
其中R为任一功能基团，例如，甘氨酸侧链，且A1和A2优选的是各为与它的N或C末端相连的本文中定义的相似物之一的复制体(但不是必需相同)。可以包含也可以不包含T细胞抗原决定基，如前文所讨论的。
肽的retro-inverso修饰一个或几个肽键的逆转以产生比原分子更能抵抗酶退化的相似物，并提供一个方便的途径去产生分支免疫原，这种抗原与大免疫原相比对介质含有高浓度的表位。这些化合物在短链生物活性肽的retro-inverso相似物的大规模溶液合成的应用中具有很大的潜力。
应当提到的是，与retro-inverso结合的氨基酸衍生物的相似物不能采用重组DNA系统直接制得。然而，基本的相似物可以，且它们可以然后被纯化和采用标准肽/有机化学法化学地连于retro-inverso氨基酸。用作在retro-inverso肽的多酰胺型树脂上的固相合成的实际和方便的新方法最近已有描述[Gazerro，H.，Pinori，M.&Verdini，A.S.(1990)。它是用作retro-inverso肽的固相合成的新的一般方法。见“InnovationandPerspectivesinSolidPhaseSynthesis”Ed.RogerEpton.SPCC(UK)Ltd，Birmingham，UK]。
该多肽也可以连在载体分子上，既可以通过多肽本身内的化学基团，也可通过加在C或N末端的附加氨基酸，并且，为保留它们最适宜的免疫学功能，可以从多肽中分离出其本身，也可以被一个或多个附加的氨基酸包围。适宜的联接有许多且包括例如用Tyr，Cys和Lys残基的侧链。适合的载体包括，例如，结核菌素(PPD)的纯化蛋白衍生物，破伤风菌类毒素，霍乱毒素及其B亚单位，卵白蛋白，牛血清白蛋白，大豆胰蛋白酶抑制剂，胞壁酰二肽和它们的相似物，和布劳恩脂蛋白，其它适合的载体对熟练技术人员来说是显而易见的。例如，可以采用诸如那些包含多赖氨酰核的多抗原肽，例如，七赖氨酸来产生反应氨基末端。根据本发明的多肽抗原可以与氨基末端反应，或合成在氨基末端上，且不同的多肽抗原可以与相同的核或载体反应。
当采用PPD作为根据本发明的多肽的载体时，如果多肽-PPD结合物的受体已经是结核菌素敏感的，例如，通过较早的BCG接种的效力，可以获得较高的抗体滴度。在人们接种过牛痘的情况下，值得一提的是，在英国和许多其它的国家，人们按惯例接受接种，因而是极为PPD敏感的。因此预料PPD会是在这些国家里使用的优选的载体。
多肽与载体偶合的方式取决于被偶合的物质的性质。例如，在载体上的赖氨酸残基可以通过N-马来酰亚胺丁酰氧-琥珀酰亚胺处理，与多肽上的C-末端或其它半胱氨酸残基偶合(Kitagawa，T.&Ackawa，T(1976)J.Biochem.79，233)。在此文献中还对其它偶合反应试剂作了描述。
多肽，或是单独的或是连于载体分子的，可以通过任何途径(例如非肠道的，鼻腔的，经口的，直肠的，阴道内的)给药，使用或不用常规助剂(如氢氧化铝或，当不是施于人体时，Freund完整或不完整助剂)和/或其它免疫效能的药剂。本发明也包括根据本发明的多肽的缓释形式的制剂。诸如皮下植入或储存包含，例如，脂质体(Allison，A.C.&Gregoriadis，G.(1974)Nature(London)252，252)或由乳酸和乙醇酸的共聚物制备的可生物降解的微囊(Gresser，J.D.andSandersonJ.E.(1984)in“BiopolymerControlledReleaseSystems”pp.1278-138，Ed.D.L.Wise)。
可以理解，根据本发明的多肽可以通过任何常规方法合成，或是如上所述采用人工或自动肽合成技术直接合成，或是通过RNA或DNA合成和分子生物学和基因工程的常规技术间接合成。采用这些技术可以产生含有一个或多个多肽插入其它多肽序列的杂交蛋白质。
因此，本发明的另一个方面提供了编码至少一种根据本发明的合成多肽的DNA分子，最好与在微生物或哺乳动物，昆虫，植物，真菌或其它细胞中的可复制的适合的表达载体结合。DNA也可以是用作更长的产物(例如，也可以是其它蛋白质部分表达的多肽)的DNA顺序的一部分。这种多肽通过基因工程插入该蛋白质中。Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(第2版1989)的“MolecularcloningaLaboratorymanual”一书为这种技术的一种实践指南。
根据本发明的多肽可以单独使用或连在适宜的载体上使用，如(a)多肽疫苗，用作防止被一株或多株HIV感染;
(b)在测定，例如，HIV阳性患者的血清中作为配位体;
(c)在测试，例如，对于多肽抗体高出的结合水平作为质量控制剂;
(d)作为免疫药剂通过适宜动物的免疫产生单克隆或多克隆抗体，这些抗体被用作(ⅰ)HIV病毒的科学研究，(ⅱ)作为诊断剂，例如，作为组织化学剂部分，(ⅲ)用作HIV患者的被动免疫，既可作为一种治疗剂量单独用于爱滋病，也可与其它药剂例如AZT和/或HIV蛋白酶抑制剂组合，和(ⅳ)作为一种使其它药物(例如，AZT或HIV蛋白酶抑制剂)击靶于其表面表达HIV被膜蛋白的HIV感染细胞的手段，这样的药物或被共价相连或以其它的方式连接到例如含有这种药物的脂质体中和与任何抗原多肽引起的抗体混合。本发明采用文献中描述的技术，进一步提供了基因工程形式或亚单位因抗该多肽产生的抗体的人类形式的抗体。特别是VH区域;和(e)治疗HIV感染，或是通过转换结合于人或动物细胞的HIV病毒，或是通过搅乱体内该病毒的三级组织，以及帮助离体HIV病毒的科学研究。
在HIV或抗HIV抗体的检测和论断方面，熟练技术人员会想到各种本专业已知的免疫测定技术，尤其是，夹层测定(Sandwichassay)，竞争和非竞争测定和直接和非直接标定的使用。
本发明的另一方面提供了一套用作检测的HIV或抗HIV抗体的药盒，它包含至少一种根据本发明的合成多肽。
多克隆或单克隆抗体，这种抗体的人类形式(见，例如，ThompsonK.M.etal(1986)Immunology58，157-160)，单区抗体(见，例如，Ward，，E.S.，Gussow，D.，Griffiths，A.D.，Jones，P.andWinter，G.(1989)Nature341，544-546)，和可以穿过血脑屏障的、特异地结合到本发明的合成多肽上抗体，可以采用常规方法制备并且这样的抗体被认为形成了本发明的部分。根据本发明的抗体是，尤其是，用在诊断哺乳动物HIV感染的方法中的抗体。这种方法包含用有效量的如本文中所描述的抗体与哺乳动物的组织或体液的样品一起培养并测定所述的样品和所述的抗体之间是否有相互反应作用发生，且如果需要还可测定相互反应的程度和/或比率。含有至少一种所述的抗体的诊断药盒也构成本发明的部分。
本发明的另一方面提供了用于治疗或预防哺乳动物HIV感染和/或刺激哺乳动物的免疫系统和/或阻断HIV病毒的细胞受体的合成多肽以及用于制备适合于这样的用途的药剂的合成多肽。还包括含有作为活性成分，如本文中所述的至少一种多肽或多肽载体结合物与一种或多种药用的助剂，载体和/或赋形剂相联系的药用组合物。这些组合物可以配制成口服，直肠，鼻腔或特别是非肠道给药(包括中枢神经系统内给药)。
本发明还提供了治疗或预防哺乳动物HIV感染和/或刺激哺乳动物免疫系统和/或阻断HIV病毒细胞受体的方法。它包含，或是单独或是与其它用作治疗爱滋病的药剂诸如AZT和/或HIV蛋白酶抑制剂组合施用有效量的如前文所限定的多肽。
下列实施例旨在说明本发明而非以任何方式限定。
实施例1采用标准的固相F-moc法(Atherton，E.andSheppard，R.C.，1985;J.Chem.Soc，Comm.165-166)合成序列Leu-Gln-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-Ile-Lys-Gly-Gys-Ald的肽Ⅰb的C末端伸延形式。引入C末端Gly-Cys-Ala为载体提供另一偶合位点。在三氟乙酸的存在下将此肽从树脂上切下，并通过凝胶过滤，离子交换色谱和反相高效液相色谱随后纯化此肽。所得的肽的纯度超过85%。C末端丙氨酸被包括以支持结合。将肽溶于磷酸缓冲盐水(PBS;5mg/ml)并且在加入戊二醛达0.1%(W/V)的最终浓度前与等量的卵白蛋白(5mg/ml)混合。在与Freund助剂乳化前，让此结合混合物静置30分钟。每只绵羊(每组5头)用等量的在Freund完全助剂(FCA)中的250μg肽免疫。2周时每头动物给与加强剂量的注射，并且再在5-6周用等量的在Freund不完全助剂(FIA)中的肽免疫。最后加强剂量注射之后7-10天取血样，并测定结合支HIVgp160被膜蛋白上。
研究中采用两株HIV1。一株为完全特异的，识别很好的并广泛采用的HIV1株，定名为GB8，可从DrG.Farrarr，CenterforAppliedMicrobiologyandResearch(CAMR)，PortonDown，Salisbary，UK，得到并在AIDS1147-150(1987)中讨论过。另一株为用于合胞体抑制测定HIV1的RF株，HIV1的RF株可从Science224497-500(1984)得知。来自单个个体的2或更多的HIV1分离株的序列已经获得并且比较测定了测试物抑制这些病毒株的生长和复制的能力。从Dr.G.Farrarr处获得定名为GB8A，GB8B和GB8D的分离株。当用GB8或RF的HIV1“实验株”感染时，已知细胞系H9，C8166和JM支持合胞体形成的复制或显示。
(a)活HIV1抗肽抗血清抑制的测定采用三种标准的测定步骤测定活HIV1被抗肽抗血清的抑制(ⅰ)中和测定这种测定测量抗肽抗血清防止敏感细胞被活的无细胞病毒结合和感染的能力。这种测量通过合胞体计数确定。
将测试抗血清在56℃下加热30分钟失活，在RPMI1640中适当地稀释并在室温(RT)下与含已知滴度的液体等体积的HIV1一起培养30分钟。将在已知浓度的和对HIV1GB8株感染高度敏感的CD4+细胞系(JM)暴露于HIV1抗血清混合物中，在37℃放置2小时，冲洗，悬浮在细胞培养基中，培养并在特定的时间进行合胞体数量测定。抗血清的中合活性通过与对照比较合胞体数量的减少测定。
每批测试中包括的对照是已知的阳性或阳性血清替代已知的阳性或阳性血清测试血清。
(ⅱ)抑制测定这种测定确定抗肽抗血清细胞感染后抑制HIV1复制的能力和测量细胞外和细胞内HIV1P24抗原的水平。此外，进行合胞体的检测和计数。
在已知多重感染中将高度敏感的CD4+细胞系暴露于HIV1并在37℃培养2小时。然后用PRMI1640将该细胞冲洗3次并加入等量的适当稀释的热纯化的测试抗血清。将感染的细胞血清悬浮液在37℃培养1小时，显微镜检查并在随后特定的时间位点(在3和5天)对细胞培养基采样测量P24抗原。采用适宜的溶胞缓冲液溶解细胞后在同样的时间位点测定细胞内P24抗原水平。贮存用ELISA测定HIV1p24抗原的样本直至进行测定。在第5天测量合胞体数量。
用作每批测试的对照包括已知的阴性和阳性血清替代在其它鉴定步骤中的测试抗血清。
(ⅲ)合胞体测定这种测定确定抗肽抗血清防止活的HIV1从感染的细胞扩散到未感染的细胞和防止细胞间通过病毒糖蛋白(gp160)和CD4分子之间的反应融合的能力。本测定是通过合胞体检测和计数进行的。
将已知浓度的支持活病毒复制(H9细胞缓慢地用HIV1RF株感染)的HIV1生产(CD4+)细胞系冲洗3次，并在特定的稀释度与测试用的抗血清混合。在37℃培养30分钟后，将这些细胞以特定的比例与对HIV1感染和合胞体诱导高度敏感的指示剂CD4+细胞系(C8166)混合。每日观察这些细胞的合胞体形成。
用作每批测试的对照包括已知的阳性和阴性血清替代在其它鉴定步骤中的测试血清。
结果中和测定一些肽Ⅰb的培养血清显示出抗HIV1GB8株的离体中和活性。表1表明血清17抗所有GB8随后的分离株的活性较大。测定表明该血清中和无细胞病毒。
表1抗肽羊血清显示离体抗HIV1GB8株的中和活性
＊＝测试中合胞体的平均数/对照中合胞体的平均数(减少%)(-)＝减少≤50%复制抑制测定如表2中所表明的，就复制抑制测定第5天合胞体数量的减少来说，血清17和37显示出可比的活性。再则，如P24抗原测定所显示的，复制被防止。应当提到，用在这种测定中的血清未被稀释。
表2用抗肽羊血清体外测定HIV1(GB8株)的复制抑制
P9＝阳性人血清NSS＝正常羊血清合胞体抑制测定表3给出了血清17在合胞体抑制测定中的数据。1∶100的稀释度减少血清的抑制活性至稍少于50%。这种测试提示怎样的水平稀释血清可以防止细胞鬲合和由此防止活病毒的扩散。
表3抗肽抗HIV1(H9-RF株)的体外合胞体抑制活性
＊＝测试中的合胞体平均数/对照中的合胞体平均数(减少%)实施例2HIV-2阳性人血清与根据式Ⅱa和Ⅱb的多肽的ELISA反应性如在实施例中所描述的方法合成和纯化具有序列Gln-Gln-Glu-Met-Leu-Arg-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-Thr-Lys-Gly-Cys(2A)的式Ⅱ的C末端延伸肽和具有序列Leu-Arg-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-Thr-Lys-Gly-Cys(2B)的式Ⅱb的C末端延伸肽，然后将这些肽与HIV阳性人血清一起用于ELISA。肽“10A”(公开在我们未决的以WO91/00903公开的申请的实施例1中)已知是与HIV被膜蛋白相关的免疫区肽和已知是基本识别所有HIV-1感染的个体。这种肽被用来研究相互反应性和确定方法的适用性。
ELISA法1.将100μl包裹缓冲液(coatingbuffer)，含20μg/ml肽，加到ELISA板(Dynetech)的每一孔穴中，并将该板在4℃过夜培养。
2.用Tris缓冲的盐水将板冲洗一次并彻底干燥。
3.将200μl阻断缓冲液加入每一孔穴，将板摇振10秒并在37℃培养1小时。
4.用于测试的血清用稀释缓冲液稀释1/100或1/200。每一孔穴中加入0.1ml，并将板在37℃培养1小时。每个样品重复三次。
5.用冲洗缓冲液将板冲洗三次，持续2分钟。
6.将100μl碱性磷酸酯酶结合的山羊抗入IgG(1/2000的稀释缓冲液)加入每一孔穴并将板在37℃培养1小时。
7.如(5)中冲洗孔穴。
8.将50μl碱性磷酸酯酶缓冲液加入每一孔穴，接着加50μl底物(10mg/ml水)并将板在37℃培养15分钟。
9.立刻在414nm读出吸收度。
测试的人血清样品如下20个先前已显示与HIV-1血清不呈现相互作用的已知的HIV-2阳性血清。所有20位患者来自象牙海岸。
5个先前已显示与HIV-1血清不呈现相互反应的已知的HIV-2阳性血清。所有5位患者来自非洲但非象牙海岸。
7个已显示与HIV-2血清不呈现相互反应的已知的HIV-1阳性血清。
10个来自年龄和性别与主题相配的已知的HIV阴性血清样品。
对照不含血清，但总体积通过加入0.1ml的稀释缓冲液来保持。
表4中的结果清楚地表明1)HIV-1和HIV-2肽之间未观察到相互反应性，这就是说HIV-2血清不识别HIV-1肽而且HIV-1血清不识别HIV-2肽;
2)在HIV阴性样品中未发现肽的特异活性;
3)来自象牙海岸的患者的血清和来自非洲大陆的其它部分的患者的血清之间在反应作用上有区别;和4)HIV-1+血清样品有可测的HIV-1(10A)抗体。
表4HIV阳性血清与肽2A，2B和10A的反应作用
如所期望的，对照无阳性结果产生这些结果表明来自一些患者的HIV-2+血清含有与如本发明式Ⅱa和Ⅱb的HIV-2多肽有特异反应的抗体。
实施例3用结合于载体蛋白的如式Ⅰa的肽给鼠免疫如实施例1中所描述的方法，合成和纯化具有序列Gln-Gln-His-Leu-Leu-Gln-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-Ile-Lys-Gly-Cys(ⅠA)的如式Ⅰa的C末端伸延肽。
结合采用戊二醛或是MBS(M-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基-琥珀酰亚胺酯)作为偶合剂将肽结合到卵白蛋白上。
戊二醛将肽溶于PBS(5mg/ml)并加入卵白蛋白给出每1摩尔肽50个载体氨基酸的摩尔比。总体积用PBS调至2ml。将2ml0.2%的戊二醛PBS溶液缓慢地加入到搅拌着的混合物中并让溶液在室温下搅拌1小时。该混合物用大量的PBS渗析过夜并在-20℃下贮存不超过3周。
MBS将0.1ml的MBS溶液(25mg/mlPBS)加入到搅拌着的卵白蛋白溶液(10mg/mlPBS)中并在室温下搅拌反应混合物30分钟。然后通过在用PBS平衡的SephadexG-25柱上凝胶过滤将活化的卵白蛋白从游离的MBS分离。将肽溶于PBS并加入活化的卵白蛋白中。这样就得到每50个载体氨基酸1摩尔肽的最终浓度。将PH调至7-7.5并在室温下让反应物搅拌三小时。将混合物用大量的PBS渗析过夜并在-20℃下贮存不超过3周。
为确定肽/载体蛋白的比率，可采用Habeeb描述的步骤(Habeeb，A.F.S.A.，Anal，Biochem.，14，328(1966))。在此步骤中，游离氨基酸通过用PH9.0的硼酸盐缓冲液，三硝基苯磺酸(TNBS)法测定。在335nm读取数溶液的吸收度并计算修饰的游离氨基酸基团的百分率。游离硫醇测定如由Ellman所描述的也可以用来评价结合率(Anderson，W.L.andWetlanfer，D.B.，Anal.Biochem.67，493(1975))。
免疫C57黑小鼠在最初接种前2-3天抽血，将血清分离并在-20℃贮存。这种血清为阴性对照小鼠血清。每只小鼠用在FCA中的40μg肽免疫并随后2至3周后用在FIA中的20μg肽免疫。每种情况下接种体积为0.1ml并且所有的注射为皮下注射。就在加强剂量注射之前给动物抽血，然后2周和4周后抽血。
ELISAELISA法是在实施例2中所描述的，除了血清是被稀释缓冲液稀释1/50和1/100，并且所用的抗体为与山羊抗小鼠IgG结合的碱性磷酸酯酶。
结果1.第3次抽血之后与对照相比，2/24(8%)的动物对用戊二醛结合的如式Ⅰa的肽有反应。因此，可能当非特定地结合在一个载体上时，产生抗这种肽的抗体。
2.用MBS通过特异连接结合于卵白蛋白的式Ⅰa的肽免疫化一次之后，14/24(58%)的小鼠便具有高水平的抗体。这是一种强的和特异的反应。
结果表明，如式Ⅰa的多肽，当用MBS结合于卵白蛋白时，是一种强的免疫原，它只在一次免疫之后就诱导很高水平的抗体，并且既使该肽为非特异地结合到卵白蛋白，也可产生抗体。
权利要求
1.一种具有至少一株人体免疫缺损病毒(HIV)被膜蛋白的至少一种抗原属性的合成多肽，所说的多肽大体由式(Ⅰ)的氨基酸序列组成X-R1-Leu-R2-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-R3-Lys-Y(Ⅰ)其中R1选自Gln-Gln-R4-R5，Gln-R4-R5，R4-R5，缺失R5或R1；R2为选自Gln，Lys，Glu或Arg的氨基酸残基；R3为选自Ile，Thr或Ala的氨基酸残基；R4为His或Glu；R5为Leu或Met；且X和Y可以各自独立地缺失或独立地为一个或多个氨基酸残基。
2.根据权利要求1中所要求的合成多肽，其中R2选自Gln，Lys和Glu，且R3为Ile。
3.根据权利要求1或权利要求2中所要求的含有序列X-Gln-Gln-His-Leu-Leu-Gln-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-Ile-Lys-Y (Ⅰa);和X-Leu-Gln-Leu-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-Ile-Lys-Y (Ⅰb)的合成多肽，其中X和Y如权利要求1中所定义的。
4.根据权利要求1中所要求的大体含有式(Ⅱ)的氨基酸序列的合成多肽X-R1-Leu-Arg-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-R3-Lys-Y (Ⅱ)其中R1选自Gln-Gln-Glu-R5，Gln-Glu-R5，Glu-R5，缺失R5或R1R3为Thr或Ala;R5为Met或Leu;且X和Y如权利要求1中所定义的。
5.根据权利要求4中所要求的合成多肽含有序列X-Gln-Gln-Glu-Met-Leu-Arg-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-Thr-Lys-Y (Ⅱa);或X-Leu-Arg-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-Thr-Lys-Y (Ⅱb)
6.如前述权利要求所要求的任意之一种合成多肽，其中缺失X且Y为Gly-Cys或Gly-Cys-Ala。
7.通式(Ⅲ)的合成多肽[La-F]m-[Lb-G]-Lc (Ⅲ)其中F和G可以各自独立地为如式Ⅰ至Ⅱb中任何一个多肽，L为连接序列，a，b和c各自独立地为0或1且m和m各自为正数，例如1和10之间所包括的。
8.通式(Ⅳ)的合成多肽La-[G-L]m-F-[L-G]n-Lc (Ⅳ)其中F为如式Ⅰ至Ⅱb的任何一种多肽，G为如式Ⅰ至Ⅱb的任何一种或其它序列的多肽，m和n各自为正数，例如，1和10之间所包括的，且d和e各自独立地为0或1。
9.一种合成多肽，它包含如权利要求1至8所要求的多肽序列中任意一种抗原意义的亚片断和/或抗原意义的变异体。
10.如权利要求1至5或7至9所要求的合成多肽还包含一种T细胞抗原决定基。
11.如权利要求1至5或7至10中所要求的合成多肽包括一种retro-inverso氨基酸。
12.如前述权利要求所要求任意之一种合成多肽连于一种载体。
13.一种DNA分子，它编码至少一种如权利要求1至10所要求的任意之一种合成多肽。
14.一种疫苗，包含至少一种如权利要求1至12所要求的任意一种合成多肽，有效地促进预防HIV感染。
15.一种用于检测HIV或抗HIV抗体的药盒，它包含至少一种如权利要求1至12所要求的任意一种合成多肽。
16.一种药用组合物，它含有作为有效成分的，至少一种如权利要求1至12所要求的任意一种合成多肽，与一种或多种医药上可接受的助剂，载体和/或赋形剂相混合。
17.一种根据权利要求16中所要求的药用组合物，还包含AZT和/或一种HIV蛋白酶抑制剂。
18.一种检测HIV或抗HIV抗体或其抗原结合片断的方法，它包含将样品与至少一种如权利要求1至12所要求的任意之一种多肽一起培养。
19.一种抗体或其抗原结合片断，它特异地结合在如权利要求1至12所要求的任意之一种合成多肽上。
20.一种用作检测HIV或抗HIV抗体的论断工具，它含有至少一种如权利要求19中所要求的抗体或其结合片断。
21.一种检测HIV或抗HIV抗体或其抗原结合片断的方法，它包含将样品与至少一种如权利要求19中所要求的抗体或其结合片断一起培养。
22.一种药用组合物，它含有，作为有效成分如权利要求19中所要求的抗体或其抗原结合片断，与一种或多种药用助剂，载体和/或赋形剂相混合。
23.如权利要求22中所要求的组合物，还包含AZT和/或一种HIV蛋白酶抑制剂。
24.一种诊断HIV感染的方法，它包含将哺乳动物的组织或体液的样品与有效量的如权利要求19中所要求的一种抗体或其结合片断一起培养并测定是否在所述的样品和所述的抗体之间有相互作用发生，如需要，测定相互作用的程度和/或比率。
25.如权利要求19中所要求的，一种针对抗体或抗原结合片断产生的抗特异基因型抗体。
26.如权利要求1至12中所要求的任意之一种合成多肽在制备用于治疗或预防处理哺乳动物HIV感染和/或用于刺激哺乳动物的免疫系统和/或阻断HIV病毒的细胞受体的药品时的应用。
27.一种治疗或预防哺乳动物HIV感染和/或用于刺激哺乳动物免疫系统和/或阻断HIV病毒细胞受体的方法，它包含施用有效量的如权利要求1至12中所要求的任意之一种合成多肽。
28.一种制备具有至少一株人体免疫缺损病毒(HIV)被膜蛋白的至少一种抗原属性的合成多肽的方法，所述的多肽大体由式(Ⅰ)的氨基酸序列组成X-R1-Leu-R2-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-R3-Lys-Y (Ⅰ)其中R1选自Gln-Gln-R4-R5，Gln-R4-R5，R4-R5，无R5或R1;R2为选自Gln，Lys，Glu或Arg的氨基酸残基;R3为选自Ile，Thr或Ala的氨基酸残基;R4为His或Glu;R5为Leu或Met;且X和Y可以各自独立地缺失或独立地为一个或多个氨基酸残基，该方法包含采用本身已知的化学，生物学或重组技术偶合残基并且分离多肽。
29.一种制备特异地结合在具有至少一株人体免疫缺损病毒，(HIV)被膜蛋白的至少一种抗原属性的合成多肽上的抗体的方法，所说的多肽大体由式(Ⅰ)的氨基酸序列组成X-R1-Leu-R2-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-R3-Lys-Y (Ⅰ)其中R1选自Gln-Gln-R4-R5，Gln-R4-R5，R4-R5，无R5或R1;R2为选自Gln，Lys，Glu或Arg的氨基酸残基;R3为选自Ile，Thr或Ala的氨基酸残基;R4为His或Glu;R5为Leu或Met;且X和Y可以各自独立地无或独立地为一个或多个氨基酸残基，该方法包含用所述的多肽给非人之哺乳动物免疫并分离抗体。
全文摘要
一种具有至少一株人体免疫缺损病毒(HIV)被膜蛋白的至少一种抗原属性的合成多肽，所述的多肽大体上由式(I)的氨基酸序列组成X-R-R这些肽与HIV被膜蛋白的某些抗原决定基相似。
文档编号C07K14/16GK1082053SQ9310590
公开日1994年2月16日 申请日期1993年4月16日 优先权日1992年4月16日
发明者R·V·菲施雷格, B·罗伯森, R·阿斯顿 申请人:普罗托斯分子设计有限公司