刺激神经和肾生长的RET配体(RetL)的制作方法

专利名称：刺激神经和肾生长的RET配体(RetL)的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码Ret配体(RetL)的核苷酸序列，以及通过用RetLDNA或蛋白处理细胞和哺乳动物材料以刺激神经和肾生长的方法。发明背景目前关于细胞信号传导和受体激活的研究的目的之一是使细胞生长和存活过程的治疗调节成为可能。这些过程决定多种医学情况，例如器官衰竭，胎儿发育，和肿瘤生长等等的结果。上述每种情况具有世界范围内的临床重要性，并且有效治疗方案有限。本发明的目的是提供促进损伤组织再生或存活和治疗涉及组织生长发育异常的失调的组合物和方法。
组织遗失和最后阶段器官衰竭每年影响全世界几百万人口并且大量增加了医疗保健费用。器官或组织遗失通常通过移植损献者器官，通过外科手术重建或用机械装置来治疗。上述每种疗法都有缺点。移植受到捐献者缺乏的限制，外科手术重建会导致别的长期问题，机械装置不能完成一个器官的所有功能，因而不能防止进行性的退化。因此，存在真正的医疗需要以找到这些问题新的解决方案。
影响细胞生长，分化和/或存活的蛋白因子可能对治疗含应答细胞的器官失调有用。在这方面，人们对能与受体蛋白酪氨酸激酶(RPTK)家族的受体相互作用的因子或配体尤其有兴趣。这些受体参与包括细胞生长和分化及瘤发生的多种细胞过程。因而，能与这些受体相互作用的因子或配体可能在治疗有组织损伤的某些器官失调中有用。另外，也可用于阻断这些因子与它们的受体相互作用，以阻止肿瘤生长。
Ret原癌基因编码受体酪氨酸激酶。在包括外周和中枢神经系统及肾脏的各种组织的发育过程中表达。存在于Ret缺陷型小鼠中的各种异常现象表明Ret对于小肠神经元分布及迁移到后肠，以及肾发育过程中输尿管芽上皮的增殖和分枝具有关键作用(自然367,380-383,1994)。寻找Ret信号传导途径的关键组分，Ret配体，成为人们重点研究的领域。发明概述本发明提供编码RetL的分离纯化DNA分子，含任何RetL的核苷酸序列，但尤其包括大鼠retL1 cDNA(SEQ ID NO:1)，人部分retL1 cDNA(SEQ ID NO:8)，人全长retL1 cDNA(SEQ ID NO:10)，人retL2 cDNA(SEQ ID NO:12)，鼠retL3 cDNA(SEQ ID NO:16)，人部分retL3 cDNA(SEQ ID NO:18)，或人retL3 cDNA(SEQ ID NO:20)。本发明进一步提供Ret L蛋白，具有包括大鼠RetL1(SEQ ID NO:2)，人部分RetL1(SEQID NO:9)，人全长Ret L1(SEQ ID NO:1)，人RetL2(SEQ ID NO:13)，鼠RetL3(SEQ ID NO:17)，人部分RetL3(SEQ ID NO:19)或人RetL3(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明包括DNA序列，该序列包含HRL20克隆，美国典型培养物保藏中心编号97604，的插入DNA序列[人的部分retL1 cDNA(SEQ ID NO:8)]，或#230-5A-86-17克隆，美国典型培养物保藏中心编号98047，的插入DNA序列[大鼠的retL1 cDNA(SEQ IDNO:1)]。
本发明的另一个实施方案中，在原核或真核宿主细胞中用分离纯化的DNA分子稳定表达的多肽产物具有至少部分RetL一级结构构象和生物活性；该DNA可以是a)包括大鼠retL1 cDNA，人的部分retL1 cDNA，人全长retL1 cDNA，人retL2 cDNA，鼠retL3 cDNA或人retL3 cDNA；或者大鼠retL1 cDNA，人的部分retL1 cDNA，人全长retL1 cDNA，人retL2 cDNA，鼠retL3 cDNA或人retL3 cDNA的互补链的DNA分子；b)在严格条件下能与a)中所述DNA分子或其片段杂交的DNA分子；或c)因为遗传密码的简并性，能与a)、b)中所述DNA分子杂交的DNA分子。编码人RetL的多肽片段或变体的具有Ret生物活性的分离纯化DNA分子也在本发明之内。
本发明任何重组DNA分子可以适当地与调控序列相连。
包含了本说明书其它地方所述的DNA分子或构建体的载体和转化系统也包括在本发明之内。载体可以包含编码RetL或RetL变体的DNA分子。
本发明包括用含编码天然RetL或RetL变体的DNA分子的载体稳定转化或转染的原核或真核宿主细胞。
本发明特别包括基本不含其它人类蛋白的分离纯化的人RetL。本发明也包括生产具有部分或全部RetL一级结构构象和生物活性的多肽产物的方法。此方法可以包括在合适的培养条件下，以允许表达这样的多肽产物的方式培养用本发明任何DNA分子转化或转染的原核或真核宿主细胞，并回收RetL。本发明也包括在原核或真核宿主细胞中表达DNA的多肽产物。
本发明还包括水溶性或膜结合的蛋白，蛋白片段，变体和衍生物。在所选的实施方案中该蛋白具有包括大鼠RetL1；人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3的氨基酸序列，或这些序列之一的变体。在其它实施方案中，该蛋白是融合蛋白，包括与另一种分子或分子片段，如免疫球蛋白，毒素蛋白，可成像化合物或放射性核素融合的Ret或RetL。本发明也包括含RetL的嵌合分子。
本发明的其它实施方案包括对本发明的RetL特异的单克隆抗体。这种抗体可与毒素，可成像化合物或放射性核素结合。本发明还包括产生对Ret特异的抗体的杂交瘤细胞系，包括AA.FF9,AA.HE3,AF.E9,BA.B1,BB.B6,AA.GE7,CD.F11,AH.E3,CD.G4,AG.E7,BD.G6,BH.G8，和这些杂交瘤细胞的亚克隆，以及这些杂交瘤细胞或其亚克隆产生的抗体。
本发明进一步包括促进新生组织生长，或促进受治疗者损伤组织存活的方法，包括给受治疗者施用有效治疗剂量的能与细胞的Ret相互作用的化合物，并由此诱导Ret的自身磷酸化，该化合物可以是RetL1,RetL2，或RetL3，全长RetL的片段，或可与Ret结合的抗体。该化合物应与有效治疗剂量的第二种化合物如GDNF,neurturin，或GDNF相关分子同时注射。虽然用于这些方法的组织可以包括任何组织，但优选的组织包括肾组织，神经组织，心脏，胃，小肠，脊柱或肺。在一个实施方案中，RetL是可溶的RetL。这些方法的受治疗者是人。
本发明的另一方法中，表达RetL的第一个细胞和第二个细胞之间的信号传导通过用可溶性Ret蛋白或针对RetL的抗体与第一个细胞接触抑制。可溶性Ret蛋白可以是融合蛋白。
本发明也包括将毒素，可成像化合物，或放射性核素导向表达Ret的细胞的方法，包括用与毒素，可成像化合物或放射性核素偶联的RetL融合蛋白或抗Ret抗体接触细胞。该RetL可以是RetL1,RetL2或RetL3。另一种方法中，其中一步是使肿瘤细胞与RetL和毒蛋白或放射性核素的融合蛋白或偶联了毒蛋白或放射性核素的Ret抗体接触，从而抑制表达Ret的肿瘤细胞的生长。该细胞可以在受治疗者体内，该蛋白和偶联的抗体被施用给受实验者。
本发明还包括将毒蛋白，可成像化合物，或放射性核素导向表达RetL的细胞的方法，包括用Ret与毒素，可成像化合物，或放射性核素的融合蛋白或偶联了毒蛋白，可成像化合物，或放射性核素的RetL抗体与细胞接触。另一个实施方案是抑制表达RetL的肿瘤细胞生长的方法，包括用Ret与毒素或放射性核素的融合蛋白或偶联了毒蛋白，放射性核素的RetL抗体与肿瘤细胞接触；该细胞可位于受治疗者体内，蛋白施用给受治疗者。
本发明中所有方法使用的RetL都可以是RetL1,RetL2或RetL3，或者RetL1,RetL2,RetL3的变体或片段。
本发明还包括基因治疗方法。一个实施方案是治疗患Ret代谢紊乱的对象的方法，包括向受治疗者施用含编码RetL的DNA分子的载体，以及促进受治疗者新生组织生长的方法，包括施用这样的载体给受治疗者。另一个实施方案包括促进受治疗者体内损伤组织存活的方法，其中一步是向受治疗者施用有效治疗剂量的编码RetL的载体。附图简述

图1是大鼠RetL的cDNA序列(SEQ ID NO:1)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。核苷酸序列从SEQ ID NO:1序列的第201位碱基对延伸到第1700位碱基对，包含整个开放阅读框架。图2A是人RetL1的部分cDNA序列(SEQ ID NO:8)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。该序列是HRL20克隆，以编号97604保存于美国典型培养物保藏中心，的插入片段。图2B是人RetL1的合成的全长DNA序列(SEQ ID NO:10)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。图3A是人RetL1的核苷酸序列(上行序列)与鼠RetL1序列(下行序列)的比较，核苷酸之间的垂直线表示在该位点上是相同的，点表示在该位点有间隙。图3B是人RetL的氨基酸序列(上行序列)与大鼠RetL1序列(下行序列)的比较。相应氨基酸之间的垂直线表示残基相同，点表示该残基保守性取代。图4A是在后肾间质细胞和输尿管芽细胞相互作用中Ret和RetL的可能作用的图示。图4B是从cDNA文库转染子中筛选表达RetL的克隆的方法图示。通过估计这些转染子与Ret/IgG融合蛋白或Ret/碱性磷酸酶融合蛋白的结合来检测转染子中是否有RetL表达。图5是表示构建用于表达大鼠Ret/IgG融合蛋白的质粒的图示。图6是表示构建用于表达人Ret/IgG融合蛋白的质粒的图示。图7是从DSW240克隆中得到的人retL2的cDNA序列(SEQ ID NO:12)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)。含有位于25位到1416位核苷酸之间的蛋白阅读框架。图8是人RetL2的氨基酸序列(上行序列)与人RetL1序列(下行序列)的比较。氨基酸之间的垂直线表示该位置相同，点表示该位置留有间隙。图9是鼠RetL3的cDNA序列(SEQ ID NO:16)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。图10是人RetL3的cDNA序列(SEQ ID NO:20)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)。发明详述序列登记号说明书中提及的核苷酸和氨基酸序列已被赋予以下序列登记号。
SEQ ID NO:1-大鼠retL1 cDNA
SEQ ID NO:2-大鼠RetL1氨基酸SEQ ID NO:3-寡聚体kid-13SEQ ID NO:4-寡聚体kid-14SEQ ID NO:5-寡聚体kid-15SEQ ID NO:6-大鼠胞外ret cDNASEQ ID NO:7-大鼠胞外Ret氨基酸SEQ ID NO:8-人部分retL1 cDNASEQ ID NO:9-人部分RetL1氨基酸SEQ ID NO:10-人retL1 cDNASEQ ID NO:11-人RetL1氨基酸SEQ ID NO:12-人retL2 cDNASEQ ID NO:13人RetL2氨基酸SEQ ID NO:14-鼠部分retL3 cDNA(EST AA 50083)SEQ ID NO:15-鼠的部分RetL3氨基酸SEQ ID NO:16-鼠retL3 cDNASEQ ID NO:17-鼠RetL3氨基酸SEQ ID NO:18-人部分retL3 cDNASEQ ID NO:19-人部分RetL3氨基酸SEQ ID NO:20-人retL3 cDNASEQ ID NO:21-人RetL3氨基酸定义如本文所用的，术语“RetL”是指任何能与Ret受体蛋白特异性相互作用的蛋白，并且当它与Ret作用时可激发Ret形成二聚体和/或Ret酪氨酸激酶结构域发生自身磷酸化。编码RetL和Ret的DNA序列分别称为“retL”和“ret”。配体可以是可溶的或以与它要激发其自磷酸化的Ret分子位于同一细胞或不同细胞的膜结合的分子存在。在特定应用或与Ret相互作用中，配体可能需要别的分子来激发自身磷酸化。本发明的配体包括辅助受体或附属的配体辅因子。本发明的配体进一步包括抗Ret的单克隆抗体，该抗体可作为Ret拮抗物，激发Ret二聚体形成和自身磷酸化。配体也可用各种方法修饰，如掺入为融合蛋白的一部分，如与毒素或放射性核素结合。
对于“序列匹配”，是指将一种核苷酸或氨基酸的序列与另一种放在一起，以比较两种序列的相关部分。此过程的一种方法的例子在Needleman等(分子生物学杂志48:443-453,1970)中给出。通过计算机程序如Align程序(DNAstar,Inc.)可方便地运用此方法。在本领域的技术人员可以理解同源或功能相同的序列包括保守半胱氨酸骨架中半胱氨酸残基功能相同的排列，包括虽然改变了这些半胱氨酸线性排列但没有实质地损害蛋白质折叠结构中半胱氨酸相互关系的氨基酸插入或缺失。因此，在计算所选的和引用的序列之间氨基酸序列的同源性或同一性水平时，忽略所选序列中的中间空隙和氨基酸插入。常用于建立蛋白质同源性的一个特征是一种蛋白与另一种蛋白之间半胱氨酸残基数目及位置的相似性。
对于“克隆”，是指用体外重组技术将特定基因或其它DNA序列插入载体分子。为了成功地克隆所需的基因，必须采用获得DNA片段，连接片段到载体分子，将合成的DNA分子导入能在其中复制的宿主细胞，以及从受体宿主细胞中筛选含目的基因的克隆等的方法。
对于“cDNA”，是指通过RNA依赖型DNA聚合酶(逆转录酶)的作用由RNA模板生成的互补或拷贝DNA。因此“cDNA克隆”就指在克隆载体中带有的与所需RNA分子互补的双链DNA序列。
对于“cDNA文库”，是指含有cDNA片段插入的重组DNA分子的集合体，cDNA插入片段依赖RNA模板的来源包含了整个有机体或组织的mRNA分子的代表。这样的cDNA文库可以用技术人员已知的方法制备，举例来说，在Maniatis等，分子克隆实验手册，同上中描述。一般地，首先从有机体细胞中分离RNA，其基因组中含有所要克隆的特定基因。对于本发明的目的，优选哺乳动物，特别是人的细胞系。另外，RNA也可以从来自动物肿瘤，优选地来自人肿瘤的肿瘤细胞中提取。因此，文库可以从，例如人肾上腺瘤制备，但任何肿瘤都可以使用。
如此处所用的，术语“DNA多样性”是指在DNA的特定位点可以存在两个或多个不同的核苷酸序列的情况。
“表达载体”包括能表达其中所含的DNA序列，即与能影响它们表达的其它序列适当连接的编码序列的载体。尽管没有每次明确指出，但含有这些表达载体必须能在宿主有机体中以附加体或染色体的整合部分复制的意思。有效表达载体的一个有用的但非必须的元件是标记编码序列，该序列编码使具有该蛋白的细胞有表型特征(例如四环素抗性)的蛋白，使得这些细胞可以容易地得到鉴别。总之，“表达载体”被赋予了功能性定义，当它用于特定序列时任何能影响特定的所含基因编码区表达的DNA序列都包括在此术语内。这些载体经常是以质粒的形式，因此“质粒”和“表达载体”经常通用。但是，本发明预期包括其它形式的表达载体，包括噬菌体，它可以起到同样的作用，并且会慢慢在本领域变得公知。
同样，本发明中的任何一种蛋白的基因的“功能衍生物”是指基因的“片段”，“变体”和“类似物”，它们在核苷酸序列上“基本相似”，并且编码具有相同活性的分子。
“GDNF相关分子”是指与GDNF或neurturin有至少40％同源性并且也能与RetL特异性结合的任何分子。
术语“基因”是指编码多肽的多聚核苷酸序列。
对于“同源的”，是指当提及多肽或DNA序列时，在所考虑的组合中基本上所有分子的一级分子结构(即氨基酸或核苷酸序列)是相同的。
此处在提及探针，要检测的寡聚体片段，寡聚体对照，非标记封闭寡聚体和用于序列扩增的引物时所用的术语“寡聚核苷酸”被定义为包含多于三个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。它的确切的大小依赖于许多因素，按顺序依赖最终的功能或寡核苷酸的用途。
术语“探针”是指已知特性的能选择性结合目的抗配体的配体。用于核酸时，术语“探针”是指含有与靶链互补碱基序列的核酸链。
“重组宿主细胞”是指用重组DNA技术构建的载体转化的细胞。如此处定义的，由于转化作用重组宿主细胞产生抗体或其修饰物而不是如未转化宿主那样产生很少的量，或更通常地，比可测量更少的量。
如此处所用的，术语“限制性内切酶”和“限制性酶”是指每一种在或接近特定核苷酸序列处切割双链DNA的细菌酶类。
如此处所用的，术语“限制性内切酶片段长度多态性”(“RFCP”)是指在个体之间特定的限制性内切酶片段长度不同。
如果两个分子的氨基酸序列基本相同，并且具有相似的生物活性，其中一个分子被称为与另一个分子“基本相似”。因此，只要二个分子具有相似活性，就认为它们是如此处所用的术语变体，即使其中一个分子含有另一个分子中没有的额外氨基酸残基或者氨基酸残基序列不同。正如此处所用的，当一个分子含有另外的不是另一个分子正常的一部分的化学组分时，该分子称为另一分子的“化学衍生物”。这些组分可以提高分子的溶解度，吸收值，生物半衰期等。这些组分也可以选择地降低分子的毒性，去除或减轻分子任何不需要的副作用等。能介导这些效应的组分例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Mack出版公司，Easton,Penn.(1980)中公开。
“载体”是指DNA片段可以插入或克隆到其中的来自质粒或噬菌体的DNA分子。载体会包含一个或多个单酶切位点，能够在特定的宿主或载体有机体中自主复制从而克隆的序列是可复制的。
“基本纯”是指本发明的任何蛋白或编码任何这样蛋白的基因，基本上不含其它蛋白或基因，相应地也不含任何一般可能在自然界中发现的其它污染物以及以自然界中未发现的形式存在的物质。本发明的化合物本发明包括编码RetL的cDNA，如大鼠retL1 cDNA，人部分retL1cDNA，人全长retL1 cDNA，人retL2 cDNA，鼠retL3 cDNA或人retL3cDNA。另外，本发明的化合物包括含有上述序列的序列或这些序列之一的衍生物。本发明也包括载体、脂质体和其它包含这些序列之一或这些序列之一的衍生物的载体工具。本发明也包括从大鼠retL1 cDNA，人部分retL1 cDNA，人全长retL1 cDNA，人retL2 cDNA，鼠retL3 cDNA或人retL3 cDNA转录翻译的蛋白，但不限于鼠RetL1，人部分Ret1，人全长Ret1，人RetL2，鼠RetL3，或人RetL3，和它们的衍生物和变体。
本发明的一个实施方案包括RetL的可溶性变体。可溶性变体缺少至少天然RetL的跨膜区部分。在一些例子中，可溶性变体缺少天然RetL的磷脂酰肌醇糖苷键。可溶性变体包括含有缺少磷脂酰肌醇结构域的RetL衍生物的融合蛋白。
变体可以在氨基酸序列或在不涉及序列的方面，或二个方面同时与天然存在的RetL不同。当一个或多个天然存在的RetL中的氨基酸被不同的天然氨基酸，氨基酸衍生物或非天然氨基酸取代时，产生氨基酸序列变体。特别优选的变体包括天然存在的RetL，或天然存在的RetL的生物活性片段，它们的序列由于一个或多个保守的氨基酸替换与野生型序列不同，这些不同一般地对蛋白质或肽的二级结构和疏水性影响很小。变体也可以具有由于一个或多个非保守的氨基酸替换，缺失或插入而不同的序列，并且不失去RetL生物活性。保守的氨基酸替换典型地包括一个氨基酸替换另一个具相似特征的氨基酸，如下面几组之间的取代缬氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰氨，谷氨酰氨；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
其它的保守的氨基酸替换可从下表中看出。并且还有其它的由Dayhaff在蛋白序列和结构图表集中描述。
表1 保守的氨基酸替换
本发明中的其它变体是具提高了肽稳定性的各种修饰的那些变体。这样的变体包括，例如，在肽序列中的一个或多个非肽键(替换肽键)。也包括含不是天然存在的L-氨基酸残基的变体，如D-氨基酸或非天然存在的或合成的氨基酸，如β或γ氨基酸和环状变体。D-型代替L-型氨基酸掺入到多肽中可提高它对蛋白酶的抗性。见，例如美国专利5,219,990。
本发明的肽也可以由诸如保守的或非保守的插入，缺失和替换的各种改变修饰，在它们的应用中这样的改变可能带来某些优点。剪接变体也特别地包括在本发明中。
除了基本上地全长多肽外，本发明提供这些多肽的生物活性片段。如果RetL多肽或片段表现出天然存在的RetL的生物活性，那么它是具有生物活性的。这些生物活性包括特异性结合Ret的胞外区域的能力，其亲合力至少是天然存在的RetL对Ret胞外部分亲合力的50％，并优选地与之相同。另一种生物活性是具有与导向天然存在的RetL上的抗原决定基的抗体结合的能力。
在其它的实施方案中，具有较低保守性的氨基酸替换的变体也可能导致所需的衍生物，例如通过引起电荷，构象和其它生物特性的改变。这些替换可以包括，例如亲水残基替换成疏水残基，半胱氨酸或脯氨酸残基替换成另一种残基，具小侧链的残基替换成具大侧链的残基，具净正电荷的残基替换成具净负电荷的残基。当不能肯定地推测给定的替换的结果时，根据此处公开的方法可以稳定地分析这些衍生物以确定所需特性的存在或缺少。
一般地，期望引起Ret多肽功能特性改变的替换如下(ⅰ)疏水性残基，例如，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸或丙氨酸替换亲水性残基，例如，丝氨酸或苏氨酸。(ⅱ)半胱氨酸残基被任何其它残基替换；(ⅲ)具带正电侧链的残基，例如，赖氨酸，精氨酸或组氨酸被带负电的氨基酸，例如谷氨酸或天冬氨酸替换；或(ⅳ)带大侧链的残基，例如苯丙氨酸被不带这样的侧链的残基，例如甘氨酸替换。
在本发明范围内的变体包括在氨基酸序列上与大鼠RetL1(SEQ IDNO:2)，人部分RetL1(SEQ ID NO:9)，人全长RetL1(SEQ ID NO:11)，人RetL2(SEQ ID NO:13)，鼠RetL3(SEQ ID NO:17)，人部分RetL3(SEQ ID NO:19)或人RetL3(SEQ ID NO:21)有至少60％同源性的蛋白质和肽。更优选地，序列同源性是至少80％，至少90％，或至少95％。为了确定同源性，比较的序列长度一般是至少8个氨基酸残基，通常至少20个氨基酸残基。本发明的化合物变体也包括任何1)具有与本发明的RetL蛋白有至少40％同源性的氨基酸序列，和2)在置于与Ret序列的最佳匹配(如图8中表示的Ret1和Ret2)之后，其半胱氨酸残基至少有80％与本发明的RetL蛋白的半胱氨酸匹配。
正如可能置换支架的取代基一样，也可能用具有相似特性的基因替换结合在支架上的功能基团。这种修饰并不改变一级结构。这些初始会是保守的，即替换基团有与原始基因大致相同的大小，形状，疏水性和电荷。非序列修饰可能包括，例如，天然存在的RetL的一部分的体内或体外化学衍生物，以及乙酰化，甲基化，磷酸化，羧化或糖基化的改变。
本发明也包括与本发明的蛋白或蛋白片段特异性结合的试剂。这些试剂包括Ig融合蛋白和抗体(包括单链，双链，Fab片段等，它们或者是天然的，人工的，原始的，或者是嵌合的)。这些试剂目录的附加描述在PCT申请95/16709中，此处引用其说明书作为参考。实验步骤总体策略图4A和4B显示了用来克隆RetL1的基本策略。我们的策略基于这样一个前提，至少一种RetL在发育的肾的后肾间充质中表达为膜蛋白(尽管该配体也可能以可溶性形式表达；图4A)。RetL与输尿管芽细胞上的Ret受体结合，激活酪氨酸激酶胞质结构域并向核内传递信号，从而按顺序激活参与输尿管芽生长和分枝的基因。因此，含与人免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc部分或碱性磷酸酶(AP)融合的RET胞外区域的蛋白可用作克隆RetL策略的一部分(如图4B所示)。克隆RetL1用到的融合蛋白，表达文库和其它试剂在下面描述。
我们首先分离出大鼠RetL1的cDNA，然后用它作为探针分离人RetL1的cDNA。随后分离RetL2和RetL3的cDNAs。直接表达RetL配体的克隆所需试剂的制备1．分离编码大鼠Ret胞外结构域cDNA为鉴定出RetL1，构建了与其它蛋白融合的含大鼠或人Ret胞外结构域的融合蛋白，在一个实施例中与人IgG1的Fc区融合，在另一个实施例中与碱性磷酸酶融合。如图4B所示两种融合配偶体都可很容易的用来检测表达配体的细胞。
由于编码大鼠Ret的cDNA还没有公开，我们用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法分离编码大鼠Ret受体胞外结构域的cDNA。我们比较了人(基因库收录号M5746和X15262)和鼠(基因库收录号X67812)ret的两个核苷酸序列并根据两个序列之间高度同源区域设计寡核苷酸引物。命名为kid-013的正向寡聚体(SEQ ID NO:3；包含基因库序列X15262的150-169位核苷酸)选自人ret cDNA 5′端序列，与ATG启始密码子重叠。为了克隆在其5′端含一个NotⅠ内切酶位点。所选的命名为kid-014(SEQ ID NO:4；包含基因库序列M57464的1819-1839位核苷酸的互补序列)和kid-015(SEQ ID NO:5；包含基因库序列X67812的1894-1914位核苷酸的互补序列)的两个寡聚体分别选自对应于人和鼠的编码跨膜结构域序列的cDNA的5′端。为了克隆，寡聚体kid-014和kid-015在它们的5′端含有另外的核酸，编码一个SalⅠ限制酶位点。
从14天大鼠胚胎肾分离出总RNA，用寡聚脱氧胸腺嘧啶柱层析法纯化mRNA。用AMV反转录酶从mRNA合成cDNA，用寡聚体kid-013和kid-015在标准的聚合酶链式反应中使用Taq聚合酶将cDNA转变成双链cDNA并扩增。在1％琼脂糖凝胶中将PCR反应样品电泳以确定1942bp PCR产物的合成。剩余的PCR片段用NotⅠ和SalⅠ消化后克隆到事先用NotⅠ和SalⅠ消化过的pSAB132中。所得质粒命名为pJC011。包含在质粒pJC011的NotⅠ和SalⅠ位点之间的完整插入得到测序，证明为大鼠retL1胞外区域cDNA,SEQ ID NO:6。翻译该序列揭示该大鼠RetL1胞外域的肽序列(SEQ ID NO:7)。因为用于PCR的寡聚体选自人和小鼠的ret序列，所以可能所示为大鼠ret胞外域cDNA的核苷酸序列和所示为大鼠Ret的蛋白质序列在kid-013和kid-015区域可能与天然的大鼠ret核苷酸和Ret肽序列不同。随后从18天大鼠胚胎肾cDNA文库分离ret cDNA克隆并且观察在引物区域的一些核苷酸变化，结果是2个氨基酸改变。一个改变在信号序列中(5位的精氨酸变成苏氨酸)，一个改变邻近胞外结构域的末端(633位的谷氨酸变成丙氨酸)。这两个变化应该不影响配体结合。2．Ret/IgG融合蛋白与人IgG1的Fc部分融合的含大鼠(氨基酸残基#1-637)或人(氨基酸残基#1-636)的Ret受体的胞外域的融合蛋白得到制备。
用于表达大鼠Ret/IgG融合蛋白的质粒构建过程在图5中扼要描述。为构建编码大鼠Ret/IgG融合蛋白的基因，用SalⅠ消化含大鼠Ret胞外域的质粒pJC011(如上所述)，并把它与来自质粒2-4的700bp SalⅠ片段连接以得到质粒pJC012。这个SalⅠ片段含有来自质粒pSAB144的部分人IgG1 Fc结构域。质粒2-4事先经三方连接构建经PCR获得含兔TGF-βⅡ型受体的胞外结构域的NotⅠ-SalⅠ片段；来自pSAB144的含部分人IgG1 Fc结构域的693bp SalⅠ-NotⅠ片段；经NotⅠ酶切的pSAB132。如图5所示，从2-4质粒中可释放出含Fc结构域的700bp SalⅠ片段。用pJC102转染入COS细胞，48小时后用蛋白-A sepharose层析柱从培养物中纯化大鼠Ret/IgG融合蛋白。为了获得合成大鼠Ret/IgG蛋白的稳定细胞系，分离来自pJC012的含大鼠完整Ret/IgG融合蛋白的2612bp NotⅠ片段并将其克隆入表达载体pMDR901的NotⅠ位点。所得质粒命名为pJC022。质粒pJC022转染入CHO细胞以产生稳定细胞系。最高产量的细胞系适于悬浮培养。大鼠Ret/IgG CHO细胞系的典型产量为75mg/L。
用于表达人Ret/IgG融合蛋白的质粒的构建在图6中扼要描述。为构建编码人Ret/IgG融合蛋白的基因，我们从M.Takahashi博士(病理学系，Nagoya大学，医学院，Nagoya，日本)处得到含编码人Ret受体的cDNA的质粒。用寡聚体kid-013和kid-014从该质粒上合成PCR片段。PCR片段经Klenow处理后用NotⅠ消化以得到具NotⅠ粘端和平端的PCR片段。载体pGEM 11zf(+)事先用EcoRⅠ消化后用Klenow补平，再用NotⅠ酶切以获得NotⅠ粘端和平端，从而将上述PCR片段克隆入经上述步骤处理过的pGEM 11zf(+)中。所得质粒命名为pJC013。在pJC013用NotⅠ完全酶解和SalⅠ部分酶解后分离1916bp的NotⅠ-SalⅠ片段，并将该片段与含部分人IgG1 Fc结构域的来自pSAB144的693bp SalⅠ-NotⅠ片段连接；并与用NotⅠ酶切的pSAB132表达质粒连接。所得质粒命名为pJC015。pJC013中的插入片段得到测序并发现含有一个核苷酸的不同改变了人Ret胞外结构域中一个氨基酸(基因库序列M57464在812有一个C，而pJC013在相应位置为T；这就导致了人Ret蛋白序列的氨基酸294位丙氨酸变成缬氨酸)。通过对质粒pJC013定点突变使这个核苷酸纠正为基因库序列M57464的特定的C残基，从而得到质粒pJC023。分离来自pJC023的含修复的核苷酸序列的585bp BstE2片段并将其克隆入质粒pJC015中，其中含变异核苷酸的585bp BstE2片段已从pJC015去除。新的质粒命名为pJC024。分离来自pJC024的含完整人Ret/IgG融合蛋白的2609bp NotⅠ片段并将其克隆入表达载体pMDR901的NotⅠ位点。所得质粒命名为pJC025。将质粒pJC025转染入CHO细胞以获得稳定细胞系。最高产量的细胞系适于悬浮培养。人Ret/IgG CHO细胞系的典型产量为6mg/L。
关于本发明的方法中使用的载体的构建的细节在PCT申请94/01456和92/02056中给出，此处引用其说明书作为参考。3．Ret/IgG融合蛋白的生物活性为了确定我们制备的Ret/IgG融合蛋白是否具有生物活性并因此可作为RetL克隆良好的筛选试剂，我们做了几种器官培养的生物活性测定。器官培养分析包括在50ug/ml浓度的Ret/Ig融合蛋白存在时，在器官培养基中培养13-14天的大鼠胚胎肾。肾也在有IFA-3TIP/IgG或媒介缓冲液存在时培养。经一定时期培养后，用荧光标记的植物凝集素DolichosBiflorus凝集素(DB植物凝集素)对其中一些肾进行染色，DB植物凝集素对来自输尿管芽的上皮细胞集合管组织染色。既然Ret在输尿管芽和其上皮衍生物中表达，那么这些“DB”阳性细胞标记着Ret阳性细胞。这些提供了对胚胎肾生长和发育中Ret/IgG融合蛋白粗略的评估。在有LFA-3TIP时培养的肾和在有大鼠Ret/IgG融合蛋白时培养的肾之间集合管的形态和生长有显著的不同。Ret/IgG处理的肾的集合管分枝明显更少，并且典型地，总体更小。
从其它肾制备石蜡切片用于组织学观察。用对照缓冲液或Ret/IgG处理胚胎肾，然后用苏木素和伊红染色。Ret/Ig处理的胚胎肾集合管比对照缓冲液处理的胚胎肾集合管的分枝更少。另外，Ret/IgG处理的肾有较少的集合小管。我们也观察到人Ret/IgG融合蛋白的这种效应。这些现象与融合蛋白阻断间充质与输尿管芽之间的诱导信号一致。因此我们认为该融合蛋白是克隆RetL的良好试剂。4．Ret/碱性磷酸酶融合蛋白受体/碱性磷酸酶(AP)融合蛋白已成功地用于鉴定和克隆c-kit的配体(细胞63:185,1990)，孤独受体的eph家族成员配体(细胞79:157，1994)，以及最近用于克隆ob基因的产物leptin受体(细胞83:1263，1995)。构建编码大鼠Ret/AP融合蛋白的质粒，在COS7细胞中于细胞培养瓶中合成大鼠Ret/AP蛋白。接着得到平均表达10mg/L融合蛋白的稳定NIH3T3细胞系。大鼠Ret/AP蛋白的SDS-PAGE分析表明它的大小与推测分子量一致，并且凝胶过滤分析表明它以二聚体形式合成。通过抗AP柱上亲和层析得到部分纯化。5．抗Ret抗体抗大鼠Ret/IgG融合蛋白的兔多克隆抗体得到制备。该抗体用于Western杂交，Ret阳性细胞系的PACS分析以及胚胎肾切片的免疫组织化学分析。
一组抗大鼠Ret的仓鼠单克隆抗体得到制备。与蛋白A sepharose偶联的大鼠Ret/IgG融合蛋白用于免疫亚美尼亚仓鼠。融合后得到316个克隆并筛选它们在ELISA分析中与大鼠Ret融合蛋白和/或人IgG结合的能力。11个克隆产生只结合大鼠Ret/IgG(和大鼠Ret/AP)，不结合人IgG的抗体。与人Ret的交叉反应性用FACS分析；4个克隆产生能与Ret阳性的人细胞系THP-1结合的抗体。下表概括了12个单克隆抗体的Ret结合特性。<
6．cDNA表达文库我们从大鼠胚胎肾制备cDNA文库，一个在CDM8载体中，利用SV40复制子扩增，另一个在修饰的InVitrogen载体pCEP4中，利用EBV复制子扩增。修饰的载体CH269已去除EBNA-1基因序列。EBNA-1蛋白与EBV复制子相互作用，但当使用稳定表达EBNA蛋白的细胞时，这个基因不需要在载体上。以CDM8为载体的文库包含1.5×106个平均插入大小为1.18kb的克隆，而以CH269为载体的文库包含大约1×106个平均插入大小为1.5kb的克隆。Ret配体RetL1的表达克隆A大鼠Ret配体RetL1的克隆1．Ret配体RetL1的表达克隆的最初尝试尝试了许多直接表达方法以克隆RetL1。所有这些方法都是基于图4B中描述的概念。cDNA文库中的cDNA导入哺乳动物细胞；有RetL1导入的细胞可以用Ret融合蛋白鉴定。尽管下述三种方法是不成功的，但获得了重要的知识和技巧，它们在后来的成功方法中使用。
a．用Ret/IgG淘选法-利用淘选法[Aruffo和Seed，美国国家科学院院报84:8753-8757(1987)]，通过直接表达克隆，用大鼠Ret/IgG融合蛋白来分离RetL1。淘选法利用18天的大鼠胚胎肾cDNA文库。利用DEAE-葡聚糖法将来自文库的cDNA组(每组5,000-10,000 cDNAs)转入COS细胞中。48小时后，细胞用EDTA从培养皿转出，与融合蛋白一起温育，接着在用抗人IgG1抗体覆盖的平板上淘选。从贴壁细胞提取DNA并再转化入大肠杆菌，接着分离DNA用于第2轮淘选。第三轮淘选后我们看不到任何细胞结合，并且在将Hirt DNA转化回大肠杆菌后，得到极少克隆。VCAM cDNA与抗VCAM单克隆抗体结合用于作为一个阳性对照，可以以1∶100比例稀释并仍可检测到；表明我们的库的大小可能太大。对第二轮淘选后获得的一些克隆的分析，表明这些克隆存在重排和缺失。
b．使用Ret/IgG的制备FACS法-将来自18天大鼠胚胎，肾文库(CDM8载体)的80,000cDNA转入COS7细胞中并在使用大鼠Ret/IgG蛋白接着用荧光标记的二抗的制备FACS中使用。收集较高的0.5％和0.9％的发荧光细胞并且用Hirt裂解法提取质粒DNA。将DNA电击回大肠杆菌中从0.5％的组中得到228个克隆，从0.9％的组中得到752个克隆。从细菌克隆提取DNA并进行第二轮制备FACS。分析从第二轮结束时的细菌克隆提取的质粒发现含有较多的缺失和重排。
c．使用Ret/AP的比色检测法用来自18天大鼠胚胎肾cDNA文库(CDM8载体)的400个cDNA克隆组转染COS细胞并用Ret/AP蛋白和碱性磷酸酶比色底物染色。在显微镜下观察转染细胞的阳性信号。在一次试验中，重新分析5个可能阳性的克隆，但均为阴性。
作为Ret/AP蛋白的对照，通过将人VCAM的前两个结构域融合到胎盘AP的N端制备VCAM/AP蛋白(VCAM与integrin VLA4结合，VLA4包括α-4和β-1两条链)。瞬间转染的COS细胞产生足够的VCAM/AP蛋白用于对照实验。把VCAM/AP蛋白跟与AP直接偶联的VCAM/IgG及VCAM/IgG外加AP偶联的二抗作比较，以评估它们检测用α-4链cDNA转染的COS细胞上VLA4的能力(COS细胞已表达β-1链)。结果表明尽管VCAM/AP蛋白能检测到转染细胞上的VLA4，但最好的检测方法是通过将VCAM/IgG蛋白与AP偶联的二抗结合进行。d．方法学结论从这些初始克隆尝试中可得到三个主要结论1)当目的cDNA的丰度很低时，要求回收质粒DNA用于下一轮(即淘选和制备FACS的方法)不合适，因为在这些后续的循环中会出现重排和缺失。基于Ret的表达低，有很好的理由猜想RetL1的表达也低。优选的方法是以组转染并用一种能鉴定出阳性组的检测方法。然后原始组可以被折分，不需要从转染细胞中回收瞬间表达的DNA。2)当与第二种试剂偶联时，Ret/IgG蛋白表现了比Ret/AP蛋白更好的检测能力。3)使用VCAM/IgG对照蛋白(和AP偶联的二抗)和α-4 intergrincDNA(稀释入CDM8载体并转染COS细胞)的对照实验表明我们的检测能力仅是大约1/1000(即组的大小不能超过1000个克隆)。为得到较高水平的敏感性，我们从以SV40复制子为基础的载体(在COS细胞中表达)改变为以EBV复制子为基础的载体(在EBNA阳性细胞系中表达)。以EBV复制子为基础的载体以附加体形式存在并且扩增后不象以SV40复制子为基础的载体对细胞有毒性。有很多证据表明在这些载体中基因可以高水平表达并且cDNAs可以稀释得更稀得多(即高达1∶80,000)而仍可检测到。2．筛选来自以EBV复制子为基础的cDNA文库的组用大鼠Ret/IgG融合蛋白筛选来自18天大鼠胚胎肾cDNA文库(带有EBV复制子的CH269载体中)的克隆组。在一次实验中，从该文库产生256组，每组含5000个克隆。简要地，cDNA文库的等分样品经稀释，5000个细胞铺平板(256次)并使之生长过夜。将克隆刮到培养基中一部分培养物用于该组的甘油保存(保存于-70℃)而一部分用于质粒制备。用脂质体转染法将来自256组的DNA分别转染293/EBNA细胞(8×105/60毫米平板)。48小时后，细胞用HBHA缓冲液(0.5mg/ml BSA,0.1％NaN3,20mM HEPES(pH7.0)〕洗两次，室温下与20μg/ml大鼠Ret/IgG(于Tris盐缓冲液中，另加1mM MgCl2和CaCl2)一起培养60-90分钟。温育后细胞用HBHA缓冲液洗四次，再用60％丙酮/3％甲醛/20mMHEPES(pH7.0)固定30秒。接着用HBS缓冲液[150mM NaCl,20mMHEPES(pH7.0)]洗两次后，细胞与AP偶联的二抗[羊抗人IgG Fc-γ-特异的F(ab′)2][Jackson免疫实验室；目录号109-056-098；1∶5000稀释度于Tris盐缓冲液，(另加1mM MgCl2和CaCl2)中稀释]一起在室温下温育60分钟。然后细胞用HBS缓冲液洗两次，并用含2X Pierce ImmunoPureR磷酸酶抑制剂(目录号35002)的AP底物缓冲液[100mM Tris-HCl(pH9.5),100mM NaCl,5mM MgCl2)。洗两次。最后一次洗放置15分钟。然后在向含Pierce AP抑制剂的AP底物缓冲液中加入AP底物NBT(0.33mg/ml)和BCIP(0.17mg/ml)并与细胞一起温育5-20分钟。然后平板用水洗两次。在解剖显微镜下观察平板上紫色着色细胞的出现。
从256组的分析中，初次筛选鉴定出17个阳性组。将每个阳性组的DNA再转染入293/EBNA细胞中并与一些附加的对照实验一起重复以上程序，以确定观察到的着色是Ret/IgG特异的。17个阳性组中仅有10组表现用Ret/IgG融合蛋白时着色而用另一种IgG融合蛋白不着色。3．#230组的拆分作为一个例子，上述阳性组之一，命名为#230，拆分成更小的亚组以确定该组中介导与Ret/IgG融合蛋白结合的cDNA。来自#230组的甘油保存的600个细胞铺平板(10次)并培养过夜。将这些平板上的克隆刮入培养液中十分之一的培养物用于甘油保存，剩余部分用于DNA提取。600个克隆的十个亚组命名为230-1A到230-5A和230-1B到230-5B。将这些亚组的DNA转染入293/EBNV细胞，并且重复上述Ret/IgG融合蛋白染色程序。一个亚组#230-5A为Ret/IgG染色阳性。
#230-5A组进一步拆分以鉴定定该组中介导与Ret/IgG融合蛋白结合的cDNA。来自230-5A组甘油保存的细胞铺平板并培养过夜。将这些克隆挑到7个96-孔Bioblocks中并培养过夜。从每一个96-孔Bioblocks产生含20个克隆的4个组和含16个克隆的一个组。这样从七个Bioblocks可得到35个组，命名为230-5A-71到230-5A-105。从每个这样的组中制备DNA并转染入293/EBNA细胞，如上所述用Ret/IgG融合蛋白再分析。#230-5A-86组为阳性。
回到Bioblock再折分#230-5A-86组并鉴定混和在一起形成这组的20个克隆。从二十个克隆提取DNA并分别转染293/EBNA细胞，并如上所述对Ret/IgG再分析。#230-5A-86-17组为阳性。4．#230-5A-86-17号克隆的特征通过DNA测序进一步分析#230-5A-86-17号克隆(命名为retL-17或克隆17并以ATCC98047保存)。这个克隆的插入片段的全长核苷酸序列为SEQ ID NO:1(大鼠retL1 cDNA)，图1显示了部分核苷酸序列。在这个核苷酸序列中，我们发现了编码468个氨基酸的蛋白(RetL1)的阅读框架。推测蛋白有信号肽序列，在24位氨基酸后有推测的切割位点[VonHeijne等，核酸研究，14:14683(1986)]。疏水C-末端表明该蛋白可能通过磷脂酰肌醇糖苷键与细胞相连。有三个推测的N-连接糖基化位点。这些性质与Ret配体的预期特性一致。
通过在疏水C末端之前截断基因我们可以表达出大鼠RetL1蛋白的可溶性截短形式。例如，通过在435位赖氨酸(大鼠RetL1)之后截除该氨基酸的上游也应导致大鼠可溶性RetL1蛋白的表达。可溶性大鼠RetL1蛋白可以表达其自身，也可以作为它与人免疫球蛋白，组氨酸标记或被抗体识别的小抗原决定基的融合蛋白的一部分表达。B．人Ret配体RetL1的克隆在λgt10载体中的人胚胎肾cDNA文库购自Clontech(目录号HL5004A)。来自噬菌体贮液的100万个噬菌斑形成单位在10个NuncTM平板上铺板。在Schleicher和Schuell OptitranTM上重复进行噬菌斑浸提。
用限制性内切酶PvuⅡ消化大鼠RetL1质粒，接着通过琼脂糖凝胶分离对应于大鼠RetL核苷酸序列(大鼠retL1 cDNA)的242-1582位核苷酸的1.34 kb片段以得到探针。该编码区探针用随机引物进行32P标记(Feinberg和Vogelstein,Anal.Biochem.137:266-267,1984)。滤纸在300ml噬菌斑筛选PSB缓冲液(50mM Tris pH7.5,1M NaCl,0.1％焦磷酸钠，0.2％PVP,0.2％Ficoll)中55℃杂交过夜，杂交液含10％硫酸葡聚糖，100ug/ml tRNA，和6.7×107CPM大鼠探针。用噬菌斑筛选缓冲液洗两次，再用2X SSC/1％SDS于55℃洗两次，并用增感屏于-70℃曝光显影。
将两次阳性的克隆从主板挑到加明胶的SM(100mM NaCl,10mMSO4,50mM Tris,pH7.5)中。24个这样的阳性克隆经噬菌斑纯化。从纯化的候选噬菌斑小量提取λDNA，并用NotⅠ酶切，在1％琼脂糖凝胶上电泳和Southern印迹。用大鼠RetL1编码区探针杂交Southern印迹。HRL20克隆含有最长的插入片段(4.4kb)，与大鼠探针强烈杂交。从这个克隆已得到DNA序列(人部分retL1 cDNA；SEQ ID NO:8；图2A)和推测的多肽序列(人部分RetL1蛋白；SEQ ID NO:9；图2A)，确定它是人的同源物。这个克隆编码包括编码区3′端的大部分编码区。
为得到人cDNA的5′端，从Clontech购买人胎儿肾Marathon-ReadyTMcDNA试剂盒(目录号7423-1)。合成反义寡核苷酸kid-155，对应于SEQ ID NO:8(人部分retL1 cDNA)62-81位核苷酸的互补链和kid-154，对应于SEQ ID NO:8(人部分retL1 cDNA)17-43位核苷酸的互补链。用AdvantageTMcDNA PCR试剂盒(Clontech目录号8417-1)和MarathonTMcDNA试剂以及寡核苷酸kid-155或kid-154进行PCR。第一轮PCR如下准备35.5ul水；5.0ul 10XklenTaq缓冲液；1.0ul 10mMdNTP混和物；1.0ul 50XAdvantageTMklenTaq聚合酶混和物。把这些试剂加在一起混匀。接着加入5.0ul Marathon-ReadyTM胎儿肾cDNA；1.0ul 10uM AP1引物和1.5ul 6.4uM kid-155(终体积为50ul)。在Perkin-Elmer Cetus DNA高温循环仪480上按以下循环条件进行PCR反应94℃1分钟，1个循环；94℃30秒，55℃30秒，68℃4分钟，30个循环。用第一轮PCR反应的产物进行嵌套式PCR。首先，用TE将5ul PCR产物#1稀释50倍(终体积为250ul)。嵌套式PCR反应含有35.5ul水；5.0ul 10XklenTaq缓冲液，1.0ul 10mM dNTP混和物；1.0ul50X AdvantageTMklenTaq聚合酶混和物。把这些试剂如上混匀。再加入5.0ul稀释的PCR产物#1；1.0ul 10uM AP2引物和1.Sul 6.9uM的kid-154。循环条件同上。大约为700bp的所得产物在1％低熔点胶上纯化并用酚抽提。纯化的DNA克隆λpZErOTM的EcoR5位点(Invitrogen目录号K2510-01)。从大量分离物中获得序列信息，包括名为HRL7G6和HRL7G8的克隆。
发现从HRL7G8克隆得到的序列与HRL20克隆(人部分retL1 cDNA)的序列重叠，并用于制备人RetL1全长序列(人全长retL1 cDNA)，如图2B所示。从HRL7G8克隆得到的核苷酸序列代表人全长retL1 cDNA的1-502位核苷酸；来自HRL20克隆的核苷酸序列代表人全长retL1 cDNA的460-1682位核苷酸。用来自HRL7G6克隆的探针从人胚胎肾λgt10cDNA文库中分离出另一cDNA克隆(GJ102)，通过对GJ102进行测序核实了来自HRL7G8克隆的核苷酸序列。118-1497位核苷酸包括人全长retL1 cDNA的蛋白阅读框架。
图2B也表示了人RetL1全长氨基酸序列。如图3A所示通过BESTF1T分析，人retL1 cDNA与大鼠retL1 cDNA有88.2％的同源性。多肽比较(图3B)表明推测的人的肽序列与大鼠的有93.3％的同源性，97.2％的相似性。Ret配体RetL2的克隆A．人RetL2的克隆为了鉴定出相关蛋白(即同系物)，利用BLAST程序，用大鼠RetL1的肽序列检索GenBank数据库。BLAST，或基本区域对比检索工具，利用Altschul等的方法(分子生物学杂志215:403-410,1990)来检索待查序列与数据库所有序列之间的相似性。待查序列与要检索的数据库可以是肽或核苷酸的任何组合。当用大鼠RetL1肽序列检索表达序列标记(EST)核苷酸数据库时，得到两个重要的匹配序列。一个具GenBank收录号R02249，来自人胎儿肝和脾混合cDNA文库的229bp EST；另一个具GenBank收录号H12981，来自人婴儿脑cDNA文库的521bp EST。这两个EST在重叠区有99％的同源性，表明它们来自同一个cDNA。源于H12981 EST的寡核苷酸KID-228(GAA TGA CAA CTG CAA GAAGCT GCG CTC CTC；对应于38-67位核苷酸和SEQ ID NO:12的534-563位核苷酸)，反义寡核苷酸KID-229(GTG TAC TCG CTG GGCACC CG；对应于156-175位核苷酸的互补序列和SEQ ID NO:12652-671位核苷酸的互补序列)。
在OPTITRANTM滤纸上筛选来自clontech公司人胎儿肝5′突出(+)λgt10 cDNA文库(目录号HL5003a)的1×106噬菌斑形成单位。在400ml噬菌斑筛选缓冲液(50mM Tris pH7.5,1M NaCl,0.1％焦磷酸钠，0.2％聚乙烯吡咯烷酮和0.2％Ficoll)中滤纸与32P标记的KID-228和KID-32965℃杂交过夜，上述缓冲液含10％硫酸葡聚糖和100ug/ml tRNA及80pmole每种32p标记的寡核苷酸。用2X SSC/1％SDS洗两次，并用1XSSC/1％SDS洗两次后，曝光显影。11个重复阳性被纯化。来自每个这样的克隆的DNA用限制性酶消化，琼脂糖凝胶电泳和Southern杂交分析。滤膜与KID-228和KID-229杂交证实插入片段能与探针杂交。DSW240克隆的插入片段全部测序(人retL2 cDNA,SEQ ID NO:12)，结果在图7中表示。
人retL2 cDNA的蛋白阅读框架包含25-1416位核苷酸，它编码464个氨基酸的蛋白(人RetL2；SEQ ID NO:13)，在图7中表示。如图8所示的，通过BESTFIT分析，人RetL2蛋白与人RetL1蛋白有49.1％的同源性和63.7％的相似性，与人RetL1一样有暗示了信号肽序列的疏水N端和暗示了磷脂酰肌醇聚糖连结结构域的疏水C端。另外，每个蛋白的31个半胱氨酸中有30个是保守的。B．证明RetL2是Ret的配体通过用含DSW240克隆的插入片段的表达质粒转染293/EBNA细胞并通过证明转染细胞可以结合可溶性Ret/IgG融合蛋白，表明RetL2是Ret的配体。
用NotⅠ切出DSW240的插入片段并克隆入表达质粒载体CH269，CH269含有EBV复制子并允许在EBNA阳性细胞系中高水平表达。进行限制性酶切以鉴定具有正确插入方向的克隆。从具正确插入方向的克隆中制备质粒DNA。
用脂质体法将质粒DNAs(retL2表达质粒，retL1表达质粒作为阳性对照，含非相关蛋白的表达质粒作为阴性对照)转染293/EBNA细胞(在60mm平板上8×105细胞)。48小时后，细胞用HBHA缓冲液
洗两次并与20ug/ml大鼠Ret/IgG一起在含1mM MgCl2和CaCl2的Tris盐缓冲液中室温下温育60-90分钟。温育后，用HBHA缓冲液洗四次并用60％丙酮/3％甲醛/20mM HEPES(pH7.0)固定30秒。HBS缓冲液[150mM NaCl,20mMHEPES(pH7.0)]洗两次后，细胞与AP偶联的二抗[羊抗人IgG Fc-γ-特异的F(ab’)2](Jackson免疫研究实验室；目录号109-056-098；1∶5000倍稀释于含1mM MgCl2和CaCl2的Tris盐缓冲液中)一起室温下温育60分钟。然后用HBS缓冲液洗两次，并用含2X Pierce Immuno Pure磷酸酶抑制剂(目录号35002)的AP底物缓冲液[100mM Tris-HCl(pH9.5),100mM NaCl,5mM MgCl2)洗两次。最后一次洗涤放置15分钟。将AP底物NBT(0.33mg/ml)和BCIP(0.17mg/ml)加入含Pierce AP抑制剂的AP底物缓冲液中，并与细胞一起保温5-20分钟。平板用水洗两次。解剖显微镜下观察平板上紫色着色细胞的存在。紫色着色细胞的存在表明Ret融合蛋白已结合到细胞上，并且RetL2蛋白是Ret的配体。用retL1表达载体转染后也可观察到紫色着色细胞，而用阴性对照载体时观察不到。Ret配体RetL3的克隆A．鼠RetL3用大鼠RetL1氨基酸序列检索EST数据库，发现两个鼠EST与Ret配体有同源性。两个EST为AA049894和AA050083(为鼠部分retL3cDNA,SEQ ID NO:14)。以细菌穿刺物形式从Genome Systems Ins.获得编码这两个EST的质粒(目录号#47591和#475497)。将穿刺物在LB氨苄抗性平板上划线，从单菌落制备质粒DNA。对这些质粒中的插入片段进行全长序列测定。比较这两个序列表明有1.4kb插入的AA049894包含在有1.9kb片段插入的AA050083中。来自AA050083的DNA序列的翻译表明，它有一个从250位核苷酸到1242核苷酸的连续开放阅读框架(鼠部分RetL3；SEQ ID NO:15)。这个开放阅读框架与大鼠retL1的开放阅读框架有37.5％的同源性，与大鼠retL2的开放阅读框架有40.2％的同源性。但是该开放阅读框架在5′端并不编码甲硫氨酸或信号肽序列。我们研究了这个区域上游的5′ORF，发现在翻译起始必须的kozak保守序列附近有甲硫氨酸和为了表面表达和分泌的信号肽序列。这个ORF与下游ORF不在同一个框架内，表明EST AA050083在它的5′端含有可能的突变，如插入，缺失，内含子或克隆假象。
为获得正确的5′端，我们应用了Marathon RACE法。从Clontech购买小鼠11天胚胎Marathon-ReadyTMcDNA(目录号7458-1)和AdvantageTM试剂盒(目录号8417-1)。合成反义寡核苷酸kid-366，对应于SEQ ID NO:14的847-866位核苷酸的互补序列；和kid-365，对应于SEQ ID NO:14的589-615位核苷酸的互补序列。用AdvantageTMcDNA PCR试剂盒(Clontech目录号8417-1)结合MarathonTMcDNA试剂以及寡核苷酸kid-366进行PCR反应。第一次PCR反应如下制备35.3ul H2O；5.0ul 10XklenTaq缓冲液；1.0ul 10mM dNTP混合物；1.0ul 50XAdvantageTMKlenTaq聚合酶混合物。把这些试剂加好混匀。然后加5.0ul Marathon-ReadyTM小鼠11天胚胎cDNA,1.0ul 10uM AP1引物和1.7ul 5.88uM Kid-366(终体积=50ul)。PCR在Perkin-ElmerCetus DNA热循环仪480中按以下循环条件进行94℃1分钟，1个循环；94℃30秒，72℃4分钟，5个循环；94℃30秒，70℃4分钟，5个循环；94℃30秒，68℃4分钟，25个循环。用第一次PCR反应的产物进行嵌套式PCR。首先，5μl PCR产物#1用TE稀释50倍(终体积250ul)。嵌套式PCR反应含35.5ul水；5.0ul 10XklenTaq缓冲液；1.0ul l0mM dNTP混合物；1.0ul 50XAdvantageTMKlenTaq聚合酶混合物。把这些试剂如上混匀。然后加入5.0μl PCR产物#1,1.0μl 10μm AP2引物和3.6μl 2.8μM Kid-365。循环条件同上。大约665bp的所得产物在1％低熔点琼脂糖凝胶上纯化并用QiaexⅡ(Qiagen目录号20021)抽提。用PRIME PCR CLONERTM克隆系统(5Prime-＞3Prime目录号1-725029)将纯化的DNA克隆入λpNoTA/T7TM。从多个分离物中得到序列信息，包括名为DSW252和DSW253的克隆。
发现DSW252的序列与SEQ ID NO:14重叠，除了在SEQ IDNO:14序列的252位与253位核苷酸之间另外的T。在其它分离物DSW251和DSW253中也存在这个T。该附加碱基的插入纠正了ORF，从而得到一个编码397个氨基酸的1191bp的ORF(从第一个甲硫氨酸算起)。这个ORF在常规翻译起始保守序列(kozak)附近编码一个甲硫氨酸，并包含表面表达/分泌的信号肽序列。
为得到能表达的全长小鼠克隆，纯化DSW252的NotⅠ-BamHⅠ 630bp片段和AA050083的1308bp BamHⅠ-NotⅠ片段并将它们连接入NotⅠ酶切的表达质粒CH269。连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue(Strategene目录号200236)。所得转化子用Qiawell Ultra小量制备法制备DNA。通过限制性酶酶切和凝胶电泳分析这些转化子的正确大小和方向。这个构建体命名为DSW254。将DSW254的插入全长测序(鼠retL3；SEQ ID NO:16)，该ORF确定为编码含397个氨基酸的蛋白(鼠RetL3；SEQ IDNO:17)。这些序列也在图9中表示。RetL3的C末端为疏水性，并且暗含一个磷脂酰肌醇聚糖连接位点。B．人的RetL3为寻找适于克隆人RetL3的候选组织来源，我们用小鼠组织的Northern印迹方法来确定鼠RetL3的表达图谱。在所有实验组织中，RetL3在心脏组织中的表达最高。从Clontech公司购买在载体λgt10中的成人心脏cDNA文库(目录号HL3026a)。来自噬菌体贮液的一百万个噬菌斑形成单位在10个Nunc平板上铺板。在Schleicher和SchuellOptitranTM滤纸上重复噬菌斑浸取。
通过用引物kid-366和kid-367进行PCR制备探针，相应于AA050083序列的397-420位核苷酸。PCR反应体系如下配制10ul 10XPFU缓冲液，2.0ul 10mM dNTP混合物，72.1ul H2O,3.1ul13.2uM kid-367,6.8ul5.88μM kid-366,5.0ul 0.1ug/ul AA050083 DNA和2.0ul 2.5单位/ul PFU(Strategene目录号600154)并混匀。在Perkin-Elmer Cetus DNA热循环仪480上进行PCR，条件如下94℃1分钟，53℃1分钟，72℃4分钟，25个循环。PCR产物用酚，氯仿，异戊醇50∶49∶1抽提纯化，接着经过低熔点琼脂糖凝胶电泳并用QiaexⅡ纯化切下的片段。编码区探针通过随机引物延伸进行32p标记(Feinberg and Vogelstein)。滤膜在200ml含10％硫酸葡聚糖，100ug/ml tRNA和1.8×108CPM小鼠探针的噬菌斑缓冲液中65℃杂交过夜。用噬菌斑筛选缓冲液，2X SSC/1％SDS洗两次，再用1XSSC/1％SDS 65℃洗2次，-70℃用增感屏曝光显影。重复阳性克隆经噬菌斑纯化。从纯化的候选噬菌斑中小量提取的λDNA用EcoRⅠ消化，在1％琼脂糖凝胶上电泳，并进行Southern印迹。用小鼠探针杂交Southern印迹。GJ128克隆含1.3kb插入，与小鼠编码区探针强烈杂交。从该克隆得到DNA序列(人部分retL3 cDNA；SEQ IDNO:18)和推测的肽序列(人部分RetL3；SEQ ID NO:19)，证实它是人的同源物。这个克隆编码了大部分编码区，包括编码区的3′端。
为获得含5′端的克隆，来自GJ128的1.3kb插入经纯化，32P标记，用于筛选Clontech成人心脏文库。在来自该文库的2×106个噬菌斑中没有得到含5′端的克隆。用相同的探针根据厂家提供的方法对成人组织mRNA印迹(Clontech目录号7760-1,7759-1和7767-1)进行Northern分析，表明人RetL3在成人脊髓，胃，心脏，胰脏，小肠，结肠，前列腺和睾丸中表达。用GJ128插入片段筛选Clontech成人脊髓cDNA文库(目录号5001a)。纯化3个独立克隆，对最长的克隆GJ135进行序列测定。GJ135的插入片段与GJ128插入片段重叠，可得到人全长retL3 cDNA(SEQ ID NO:20)的组合序列，从而可确定人全长RetL3(SEQ ID NO:21)。这些序列在图10中表示。人RetL3与人RetL1和RetL2的同源性分别为34.3％和34.9％。与鼠RetL3的同源性为76.8％。本发明的化合物的治疗用途天然的和变异的RetL，抗RetL抗体，抗Ret抗体，和Ret及RetL的融合蛋白在需要阻断或激活Ret信号途径，在细胞丢失或受损的患病的情况下可刺激肾和/或神经细胞生长或存活，或抑制生长或杀死非需要细胞如表达Ret或RetL的肿瘤细胞的情况下可以有治疗用途。
通常，本发明的结合Ret，诱导Ret二聚体形成和/或Ret自身磷酸化的化合物，可用于刺激Ret表达组织生长或减少其损伤。本发明的化合物可用于刺激肾组织生长和/或存活，维护肾功能，最大限度减少各种损害后对肾组织的损伤。可用本发明的化合物有效治疗的特定情况包括急性肾衰竭，急性肾炎，慢性肾衰竭，肾病综合症，肾小管缺陷，肾移植，毒性损伤，缺氧损伤和创伤。肾小管缺陷包括遗传性的或获得性的，如多囊肾病，髓囊病和髓质海绵肾。不限于这里列出的，而可包括一些其它肾脏失调(见，例如Harrison’s Principles of Internal Medicine，第13版，1994，此处引用作为参考)。
在其它的应用中，本发明的基因和蛋白可在需要神经生长和再生的情况下用于治疗。这包括任何涉及神经退化的情况，如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、图雷综合症，肌萎缩晚期硬化，及运动神经元病，脱髓鞘病如多发硬化症，细菌病如脑膜炎，脓肿或积脓，病毒病如HIV伴随性脊髓病，朊病毒病包括克罗伊茨费尔特-雅各布病。也包括对神经组织造成损伤的紊乱，或者由肿瘤浸润，创伤，或者由脑血管事件如出血或气栓引起。颅神经和脊髓疾病，包括涉及创伤，炎症，充血或血管病因学的紊乱，以及影响自主神经系统的紊乱都特别地包括在内。也包括发育性神经紊乱，如智力迟钝，孤独症，胎儿酒精综合症，唐氏综合症和大脑麻痹症。本发明的化合物也可用于治疗涉及周围神经系统的综合症。这些失调包括上述任何因子引起的那些，并特别包括菜姆病，HIV伴随神经病，多肌炎，肌肉营养不良和重症肌无力。
与大鼠RetL，人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3的蛋白，或这些蛋白的片段特异结合的本发明的抗RetL抗体和Ret融合蛋白在几种方法中有用。这些化合物可在治疗上用于抑制或阻断Ret受体信号，如用于阻断肿瘤生长，这些肿瘤生长依赖Ret信号传导的活化。这些试剂也可与可检测的标记融合，如荧光性或放射性不透明物质，施用给受治疗者可使表达RetL的组织成像。这些试剂也可与诸如辣根过氧化物酶的物质结合，其可用作免疫细胞化学染色以对组织切片上的Ret-阳性细胞区域进行观察。可以这种方法单独使用特定抗体，在特定抗体结合的位点可使用结合于可检测的标记上的抗免疫球蛋白抗体在夹心分析中观察到。任何RetL的特异抗体也在对给定抗体的特异的底物定量免疫分析中有用。RetL的特异抗体也可结合于固体支持物上，如玻璃珠或平板，并可用于从溶液中移出配体以纯化蛋白或从溶液中除去配体。每项这种技术对于免疫领域的技术人员来说都是常规操作。
本发明的其它方法包括通过Ret与抗Ret单克隆抗体接触调节Ret-RetL信号传导。依赖每个特异单克隆抗体与Ret相互作用的特征，这种单克隆抗体-Ret接触的效应可以是阻断或刺激Ret信号传导途径的活化。某些单克隆抗体作为兴奋剂与Ret相互作用，兴奋剂单克隆抗体与Ret结合激发Ret二聚体形成和自身磷酸化。其它单克隆抗体作为Ret拮抗剂起作用。Ret与拮抗剂单克隆抗体相互作用阻止由其它RetL或由含RetL的复合物引起的Ret信号传导的活化。
RetL和/或针对Ret或Ret融合蛋白的抗体可用于使表达Ret的组织成像，或对于抗RetL抗体，可在上述免疫组织化学或制备方法中应用。
包含RetL和/或抗Ret抗体的融合蛋白可用来抵抗表达Ret的癌和肿瘤进行特异靶位点医疗。这样的肿瘤可包括与Ret突变相关的几种不同的肿瘤表型(N.Engl.J.Med.335:943-951,1996；自然367:319-320,1996；Trends Gen.12:138-144,1996)。抵抗表达RetL的肿瘤形成的治疗干扰利用整合了Ret和/或抗RetL抗体的融合蛋白。通过抗体依赖的和补体依赖的由Fc结构域介导的细胞溶解作用，抗Ret抗体或抗RetL抗体本身可以有效。通过将这种杂交配体和抗体作为抗肿瘤形成药物，毒素和杀细胞放射性核素如钇90的传送载体使用，可使它们更有效。使用异源偶联抗体可将细胞毒性效应细胞导向肿瘤细胞，即对肿瘤表达的Ret或RetL的特异的抗体可与针对细胞毒性效应细胞如NK细胞或CTL上的表面蛋白诱导的抗体共价偶联。
抗Ret抗体或RetL治疗的一个例子是将蓖麻毒蛋白的毒性A链或修饰的蓖麻毒蛋白全长形式(其不再能结合细胞)与RetL或针对在恶性细胞表面表达的Ret多肽诱导的抗体偶联。在另一种实施方案中，毒素与Ret或抗RetL抗体偶联以选择性地定向并杀死RetL阳性细胞，如表达RetL的肿瘤。通过阻断蓖麻毒蛋白与针对大多数肿瘤形成细胞上表达的CD19抗原的单克隆抗体偶联证明这种方法是成功的(Grossbard等，血液79:576,1992)。如本领域的技术人员所知，其它毒素同样有用。这样的毒素包括但不限于假单孢外毒素，白喉毒素，和皂草素。与已知的抗CD-19抗原方法相比，利用RetL或抗Ret抗体的该法应该证明甚至更成功，因为Ret在非常有限的几个组织中表达。
上述使用蓖麻毒素或其它毒素融合的方法同样适用于RetL或抗Ret抗体的有毒偶联物；它们可用于选择性地锚定和杀死Ret阳性细胞，如表达Ret的肿瘤细胞。
这种医疗的另一种方法是用放射性同位素标记的RetL或抗Ret抗体。这种放射性标记的化合物优先将放射活性定位到表达Ret的细胞中的肿瘤位点，而正常组织中没有。根据所用的同位素，结合于肿瘤细胞的放射性标记的抗体发出的辐射也可能杀死邻近不表达Ret的恶性肿瘤细胞。一系列放射性核素可以使用。发射β粒子的同位素(如，131Ⅰ)已成功地用于针对B-细胞淋巴瘤上CD20的单克隆抗体[Kaminski.等，N.Engl.J.Med.329:459(1993)；Press等，N.Engl.J.MeCl.329:1219(1993)]。发射β粒子的放射性核素产生的放射性辐射，具有跨几个细胞直径距离的杀肿瘤活性，允许抗原阴性细胞的根除和减小肿瘤中抗体或配体的非同源沉积后果。
发射α粒子的放射性核素也可使用。放射性核素标记的RetL或抗Ret抗体产生的低剂量照射可能比传统放射治疗中外部施加的瞬间照射更有效。低剂量照射可能诱导某些细胞系凋亡(程序性细胞死亡)[Macklis等，Radiat.Res.130:220(1992)；Maklis等，Radiopharm.5:339(1992)]。
本发明的化合物以治疗有效量用药，此意味着产生医疗满意结果或对治疗的特定情况产生影响的化合物量。
此处使用的术语“受治疗者(subject)”是用来指任何接受Ret配体或基因的哺乳动物。预期用本发明的方法治疗的特定受治疗者包括人，以及非人灵长类，绵羊，马，牛，山羊，猪，狗，猫，兔，豚鼠，仓鼠，沙土鼠，大鼠和小鼠，以及来源于或来自这些宿主的器官，肿瘤和细胞。本发明的化合物在基因治疗中的应用将本发明的RetL基因导入受损组织，刺激转染细胞合成RetL，促进表达Ret的细胞生长和/或细胞存活。
在基因治疗方法的特定实施方案中，可将RetL基因导入所选的肾或神经靶组织。RetL即可以稳定表达并刺激Ret受体阳性细胞生长，分裂，分化和/或促进细胞存活。另外，使用以病毒或非病毒为基础的策略的一系列众所周知的方法可将RetL基因导入靶细胞内。
非病毒方法包括电穿孔法，用脂质体膜融合，用DNA包被的微粒高压轰击，与磷酸钙-DNA一起温育，DEAE-葡聚糖介导的转染和单细胞直接注射法。例如，RetL基因可通过磷酸钙共沉淀法[Pillicer等，科学，209:1414-1422(1980)]；机械微注射和/或粒子加速[Anderson等，美国国家科学院院报，77:5399-5403(1980)]；以脂质体为基础的DNA转染(例如LIPOFECTIN介导的转染，Fefgner等，美国国家科学院院报，84:471-477,1987；Gao and Huang,Biochem.Biophys.Res.Comm.,179:280-285,1991)；DEAE葡聚糖介导的转染；电穿孔法(美国专利4,956,288)；或以多聚赖氨酸为基础的方法(其中DNA被偶联以转运DNA优先地到肝脏的肝细胞中)(Wolff等，科学，247:465-468,1990；Curiel等，人类基因治疗3:147-154,1992)导入细胞。
通过直接基因转移法可将本发明的基因转染目的细胞。见例如Wolff等，“直接基因转入驼鹿肌肉内”，科学247:1465-68,1990。在一些情况下，载体介导的转染受欢迎。本领域任何已知的将多聚核苷酸序列插入载体中的方法都可使用。见Sambrook等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港实验出版社，NY(1989)和Ausuabel等，分子生物学常规方法，J.Wiley&amp;Sons,NY(1992)，此处引用两者作为参考。启动子活化可以是组织特异性的或者受代谢产物或施用物质诱导的。这种启动子/增强子包括但不限于，天然RetL启动子，巨细胞病毒立即早期启动子/增强子[Karasuyama.等，J.Exp.Med.,169:13(1989)]；人β-肌动蛋白启动子[Gunning等，美国国家科学院院报，84:4831(1987)]；小鼠乳腺瘤病毒长末端重复序列(MMTV LTR)中的糖皮质激素诱导启动子[klessig等，Mol.Cell.Biol.,4:1354(1984)]；Moloney鼠白血病病毒长末端重复序列(MuLV LTR)[Weiss等，RNA肿瘤病毒，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，NY(1985)]；劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子[Yamamoto等，细胞，22:787(1980)]；SV40早期启动子[Bernoist and Chambon，自然，290:304(1981)]；单纯疱疹病毒(HSV)胸腺嘧啶激酶启动子[Wagner等，美国国家科学院院报，78:1441(1981)]；腺病毒启动子[Yamada等，美国国家科学院院报，82:3567(1985)]。
RetL基因也可通过特定的病毒载体导入细胞，这些载体在现已建立的基因转移系统中使用。见例如，Madzak等，J.Gen.Virol.,73:1533-36,1992(乳多空病毒SV40)；Berkner等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:39-61,1992(腺病毒)；Hofmann等，美国国家科学院院报92:10099-10103,1995(杆状病毒)；Moss等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:25-38,1992(痘病毒)；Muzyczka,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:97-123,1992(腺病毒伴随病毒)；Margulskee,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:67-93,1992[单纯疱疹病毒(HSV)和Epstein-Barr病毒(HBV)]；Miller,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:1-24,1992(逆转录病毒)；Brandyopadhyay等，Mol.Cell.Biol.,4:749-754,1984(逆转录病毒)；Miller等，自然，357:455-450,1992(逆转录病毒)；Anderson，科学，256:808-813,1992(逆转录病毒)，分子生物常用方法Section 9.10-9.14(Ausubel.等，编辑)，Greene PublishingAssociates,1989，引用所有这些文献作为参考。
优选的载体是DNA病毒，包括腺病毒(优选以Ad-2或Ad-5为基础的载体)，杆状病毒，疱疹病毒(优选以单纯疱疹病毒为基础的载体)，和细小病毒(优选以“缺陷型”或非自主型细小病毒为基础的载体，更优选以腺病毒伴随病毒为基础的载体，最优选以AAV-2为基础的载体)。见例如Ali等，基因治疗1:367-384,1994；美国专利4,797,368和5,399,346和以下讨论的。
为转染，例如RetL序列，根据一系列因素选择特定的载体系统。一个重要因素是靶细胞群体的性质。尽管逆转录病毒载体已广泛地被研究并用于许多基因治疗应用，但它们一般并不适用于转染非分化细胞，而在癌症治疗中有用，因为它们只能在复制细胞中整合与表达。由于它们能稳定地整合到靶细胞基因组中，它们在体外方法中有用而且很有吸引力。
腺病毒是真核DNA病毒，可被修饰以有效地将治疗或报告转化基因运载到一系列细胞类型中。能引起人类呼吸性疾病的普通腺病毒2型和5型(Ad2和Ad5)，现已被发展用于假肥大性肌营养不良(DMD)和胆囊纤维化(CF)的基因治疗。Ad2和Ad5属于与人恶性肿瘤无关的一种腺病毒亚型。不管处于那个分裂时期，腺病毒载体能将非常高水平的转化基因运载到几乎所有细胞类型中。在293细胞中(腺病毒转化的互补人胚胎肾细胞系:ATCC CRL 1573)能很容易的获得高滴度(1013噬菌斑形成单位/ml)的重组病毒，并可冷冻贮存很长时间而无明显丢失。在各种失调的动物模型中已证实这种系统在体内转运补偿遗传性失衡的治疗性转化基因中的效力。见Y.Watanabe,Atherosclerosis,36:261-268(1986)；K.Tanzawa等，REBS Letters,118(1):81-84(1980)；J.L.Golasten等，New Engl.J.Med.,309(11983):288-296(1983)；S.Ishibashi等，J.Clin.Invest.,92:883-893(1993)；和S.Ishibashi等，J.Chin.Invest.,93:1889-1893(1994)，引用所有这些文献作为参考。确实，编码胆囊纤维化跨膜调节子(CFTR)的重组复制缺损腺病毒已批准用于至少两例人CF临床试验。见例如J.Wilson自然，365:691-692(1993年8月21日)。人类中存活腺病毒疫苗的大量经验进一步支持了重组腺病毒用于基因治疗的安全性。
人类腺病毒包含线性，约36kb的双链DNA基因组，该基因组可分成100个图谱单位(m.u.)，每个图谱单位长360bp。在基因组的每个末端的DNA含有短的反向末端重复(ITR)，是病毒DNA复制必须的。根据在病毒DNA合成起始前或后表达，这些基因产物排列为早期区(E1到E4)和晚期区(L1到L5)。参见Horwitz，病毒学，第二版，B.N.Fields编辑，Raven Press Ltd.,New York(1990)。
第一代重组子，复制缺陷型腺病毒已发展用于DMD和含全长E1a和部分E1b区域缺失的其它遗传性失调的基因治疗。复制缺陷型病毒可以在293细胞中生长，293细胞包含有功能的腺病毒E1a基因，可提供反式作用E1a蛋白。E1缺失病毒能在293细胞中复制和增殖侵染性的细胞，293提供E1a和E1b区基因产物互补。所得病毒侵染一些细胞类型，并表达导入的基因(假设它带有自己的启动子)，但不能在不含E1区DNA的细胞中复制，除非以非常高的感染复数侵染细胞。腺病毒有下列优点它们有广谱宿主范围，能侵染休眠或终级分化的细胞如神经元，表现出必需地非致癌性。腺病毒不整合到宿主基因组中。因为他们存在于染色体外，插入突变的危险大大降低。Ali等，同上，于273。重组腺病毒(rAdV)有很高的滴度，病毒粒子相当稳定，表达水平高，能侵染广谱的细胞。它们的天然宿主细胞是气道上皮细胞，因此他们在肺癌的治疗中有用。
杆状病毒介导的转化有一些优点。杆状病毒基因转移可在复制和非复制细胞中进行，并可在肾细胞，及肝细胞，神经细胞，脾，皮肤和肌肉中进行。在哺乳动物细胞中杆状病毒是非复制和非致病性的。人缺少能阻断侵染的重组杆状病毒抗体。另外，杆状病毒能整合并转导大片段的DNA插入。
腺病毒伴随病毒(AAV)也已用于体细胞基因治疗。AAV是小的，单链DNA病毒，有简单的基因组构成(4.9kb)，使它成为基因工程的理想底物。两个开放阅读框编码一系列的rep和cap多肽。Rep多肽(rep78,rep68,rep62和rep40)参与AAV基因组的复制，装配和整合。Cap蛋白(VP1,VP2和VP3)形成病毒外壳。邻近rep和cap开放阅读框架的5′和3′区是145bp的反向末端重复(1TRs)，前125bp能形成Y-型或T-型二级结构。为改进AAV载体，整个rep和cap结构域可以被切除并用治疗基因或报告基因代替。参见B.J.Carter，于细小病毒手册，P.Tijsser编辑，CRC出版社，155-168页(1990)。已表明ITRs代表了AAV基因组复制，装配，包装和整合必须的最小序列。
ANV生活史是双相的，包括潜伏期和裂解期。在潜伏侵染期，AAV病毒粒子以包被的SSDNA进入细胞，之后立即传递入核并且在此AAVDNA稳定地整合入宿主染色体，不明显需要宿主细胞分裂。在没有辅助病毒时，整合的AAV基因组保持潜伏状态，但能被激活和装配。当含AAV原病毒的细胞经疱疹病毒或腺病毒第二次侵染激发时，生活史的裂解期开始，疱疹病毒或腺病毒编码辅助功能蛋白，能被AAV用于帮助它从宿主染色体的切割(B.J.Carter，同上)。侵染的亲本SSDNA以rep依赖方式形成双链复制形式(RF)DNAs。将装配的AAV基因组包装到预先形成的蛋白外壳中(直径约20nM的正二十面体对称结构)，随着细胞裂解释放侵染性病毒粒子，病毒粒子中包装了+或-SSDNA。
腺病毒伴随病毒(AAV)在基因治疗方面有重要潜力。病毒粒子很稳定并且重组AAV(rAAV)有“药物样”特征，其特征在于rAAV可通过沉淀或CsCl梯度条带纯化。它们是热稳定的并可冻干成粉末且可水化后恢复全部活性。它们的DNA稳定整合到宿主染色体中，因此表达是长期的。它们的宿主范围广并且AAV不引起任何可知的疾病，因此重组载体无毒性的。
一旦目的序列导入靶细胞后，可用常规的方法鉴定有用序列，如用与载体插入基因序列同源/互补序列为探针的核酸杂交。在另一种方法是，可用由表达载体导入靶细胞引起“标记”基因功能(如胸腺嘧啶激酶活性，抗生素抗性等)的有无鉴定该序列。配方与给药本发明的化合物可以用医学上可接受的任何方法给药。可包括注射，经非肠胃途径如静脉内，血管内，动脉内，皮下，肌肉内，肿瘤内，会阴内，心室内，表皮内以及口部，鼻部，眼部，直肠或局部。通过贮积注射或可蚀性植入的持续释放用药也特别地包括在本发明中。特别考虑的是定向导入，通过用导管传递到一个或多个动脉中，如肾动脉或供应局部肿瘤的血管。
术语“药学上可接受的载体”是指一个或多个有机的或无机的，天然的或合成的成分，突变的原癌基因或突变的癌蛋白与它们结合促进其施用。合适的载体包括无菌的生理盐水，尽管其它已知的药学上可接受的含水和不含水的等渗无菌溶液和无菌悬浮液已被本领域的一般熟练技术人员所熟知。在这方面，“载体”包括脂质体和HIV-1 tat蛋白(参见Chen等，Anal.Biochem.,227:168-175,1995)及任何质粒和病毒表达载体。“有效剂量”是指能减轻或延迟疾病过程，退化或损伤情况的量。有效剂量可在个体基础上确定，部分基于待治病症和想要达到的结果的考虑。有效剂量可由本领域的一般技术人员权衡这些因素和使用常规实验确定。
脂质体系统可以是单层载体，多层载体或稳定极性层载体中的任一种，并可以根据本领域技术人员已知的方法制备和给药，例如根据美国专利5,169,637,4,762,915,5,000,958或5,185,154的说明。另外，为增加它们与脂质体的结合，需要表达本发明的新的多肽以及其它所选择的多肽如脂蛋白。例如用脂质体包被的RetL治疗人急性肾衰竭，可通过可利用脂质体将RetL导入需要这样治疗的细胞在体内进行。脂质体可通过导道运送到肾动脉。重组的RetL蛋白例如通过免疫亲和层析或其它常规方法从CHO细胞纯化，然后与脂质体混和并且高效掺到脂质体中。在体外可检测包被蛋白对刺激细胞生长的任何影响。
本发明也考虑到，为提高它们的稳定性和/或免疫原性，通过脂质体传递系统将本发明的新的多肽施用给动物。因为在接受治疗的动物中脂质体可以通过吞噬细胞内化，所以通过脂质体来运载新的多肽有特别的优点。这些细胞在消化掉脂质体膜后，将与引发强烈免疫反应所必须的其它分子偶联的多肽提呈到免疫系统。
本发明的任何一种新的RetL多肽可以以药学上可接受的盐的形式使用。能与本发明的多肽形成盐的合适酸或碱已为本领域技术人员所熟知，包括无机和有机酸和碱。
尽管上述发明已通过说明和实施例的方式详细描述，以便于理解清晰，但对一个本领域的技术人员来说，在本发明范围内，如仅由附录权利要求的范围限定的，很明显可以进行一些改变和修饰。
序列表(1)基本信息(ⅰ)申请人Doherty,jodi(ⅱ)发明名称生物基因专利申请名称(ⅲ)序列数目21(ⅳ)联系地址(A)地址Biogen,Inc.
(B)街道14 Cambrige Center(C)城市Cambrige(D)州名MA(E)国家USA(F)邮政编码02142(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(ⅵ)目前申请资料(A)申请号(B)递交日1997年5月7日(C)分类(ⅶ)在先申请资料(A)申请号US 08/999,999(B)递交日1996年1月1日(ⅷ)律师/代理人信息(A)名称levine,leslie M(B)登记号35,245(C)文件/著录号A008 PCT CIP
(ⅸ)电信信息(A)电话617-679-2400(B)传真617-679-2838(2)关于SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度3616个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟否(ⅳ)反义否(ⅸ)特征(A)名称/关键CDS(B)位置257..1660(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GCGGCCGCAG GTTGGGTCGG AACTGAACCC CTGAAAGCGG GTCCGCCTCC CGCCCTCGCG60CCCGCCCGGA TCTGAGTCGC TGGCGGCGGT GGGCGGCAGA GCGACGGGGA GTCTGCTCTC 120ACCCTGGATG GAGCTGAACT TTGAGTGGCC AGAGGAGCGC AGTCGCCCGG GGATCGCTGC 180ACGCTGAGCT CTCTCCCCGA GACCGGGCGG CGGCTTTGGA TTTTGGGGGG GCGGGGACCA 240GCTGCGCGGC GGCACC ATG TTC CTA GCC ACT CTG TAC TTC GCG CTG CCA 289Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro1 5 10CTC CTG GAT TTG CTG ATG TCC GCC GAG GTG AGT GGT GGA GAC CGT CTG 337Leu Leu Asp Leu Leu Met Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu15 20 25GAC TGT GTG AAA GCC AGC GAT CAG TGC CTG AAG GAA CAG AGC TGC AGC 385Asp Cys Val Lys Ala Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser30 35 40ACC AAG TAC CGC ACA CTA AGG CAG TGC GTG GCG GGC AAG GAA ACC AAC 433Thr Lys Tyr Arg Thr Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn45 50 55TTC AGC CTG ACA TCC 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(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCTCGTC GCA 33(2)关于SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCGCATC ACA 33(2)关于SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1926个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键CDS(B)位置10..1920(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:GCGGCCGCC ATG GCG AAG GCG ACG TCC GGC GCC GCA GGG CTG GGG CTG 48Met Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Gly Leu470 475 480AAG CTG TTT TTG CTG CTG CCG CTA CTG GGA GAA GCC CCG CTG GGT CTC 96Lys Leu Phe Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Glu Ala Pro Leu Gly Leu485 490 495TAC TTC TCA AGG GAT GCT TAC TGG GAG AGG CTG TAT GTG GAC CAG CCA 144Tyr Phe Ser Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Arg Leu Tyr Val Asp Gln Pro500 505 510GCT GGC ACA CCT CTG CTC TAT GTC CAT GCC CTA CGG GAT GCC CCT GGA 192Ala Gly Thr Pro Leu Leu Tyr Val His Ala Leu Arg Asp Ala Pro Gly515 520 525GAA GTG CCC AGC TTC CGC CTG GGC CAG TAT CTC TAT GGC GTC TAC CGC 240Glu Val Pro Ser Phe Arg Leu Gly Gln Tyr Leu Tyr Gly 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(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Met Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Gly Leu Lys Leu Phe1 5 10 15Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Glu Ala Pro Leu Gly Leu Tyr Phe Ser20 25 30Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Arg Leu Tyr Val Asp Gln Pro Ala Gly Thr35 40 45Pro Leu Leu Tyr Val His Ala Leu Arg Asp Ala Pro Gly Glu Val Pro50 55 60Ser Phe Arg Leu Gly Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Tyr Arg Thr Arg Leu65 70 75 80His Glu Asn Asp Trp Ile His Ile Asp Ala Gly Thr Gly Leu Leu Tyr85 90 95Leu Asn Gln Ser Leu Asp His Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ser Ile Arg100 105 110Asn Gly Gly Phe Pro Leu Leu Thr Val Phe Leu Gln Val Phe Leu Gly115 120 125Ser Thr Ala Gln Arg Glu Gly Glu Cys His Trp Pro Gly Cys Ala Arg130 135 140Val Tyr Phe Ser Phe Ile Asn Asp Thr Phe Pro Asn Cys Ser Ser Phe145 150 155 160Lys Ala Arg Asp Leu Cys Thr Pro Glu Thr Gly Val Ser Phe Arg Ile165 170 175Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly Thr Phe Tyr Gln Phe Arg Met Leu Pro180 185 190Val Gln Phe Leu Cys Pro Asn Ile Ser Val Lys Tyr Lys Leu Leu Glu195 200 205Gly Asp Gly Leu Pro Phe Arg 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(A)名称/关键CDS(B)位置118..1497(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:GGGCGGCCAG AGCAGCACAG CTGTCCGGGG ATCGCTGCAT GCTGAGCTCC CTCGGCAAGA60CCCAGCGGCG GCTCGGGATT TTTTTGGGGG GGCGGGGACC AGCCCCGCGC CGGCACC 117ATG TTC CTG GCG ACC CTG TAC TTC GCG CTG CCG CTC TTG GAC TTG CTC 165Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu350 355 360CTG TCG GCC GAA GTG AGC GGC GGA GAC CGC CTG GAT TGC GTG AAA GCC 213Leu Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys Ala365 370 375AGT GAT CAG TGC CTG AAG GAG CAG AGC TGC AGC ACC AAG TAC CGC ACG 261Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr380 385 390CTA AGG CAG TGC GTG GCG GGC AAG GAG ACC AAC TTC AGC CTG GCA TCC 309Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Ala Ser395 400 405 410GGC CTG GAG GCC AAG GAT GAG TGC CGC AGC GCC ATG GAG GCC CTG AAG 357Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lys415 420 425CAG AAG TCG CTC TAC AAC TGC CGC TGC AAG CGG GGT ATG AAG AAG GAG 405Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg 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(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键CDS(B)位置205..1242(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:CGCGGCGCCC AGCGCAGGCA GAGCGCTGTC GCATCCCGGG CGTCCACCCG CCATGGGGCT60CTCCTGGAGC CCGCGACCTC CACTGCTGAT GATCCTGCTA CTGGTGCTGT CGTTGTGGCT 120GCCACTTGGA GCAGGAAACT CCCTTGCCAC AGAGAACAGG TTTGTGAACA GCTGTACCCA 180GGCCAGAAAG AAATGCGAGG CTAA TCC CGC TTG CAA GGC TGC CTA CCA GCA 231Ser Arg Leu Gln Gly Cys Leu Pro Ala465 470CCT GGG CTC CTG CAC CTC CAG TTA AGC AGG CCG CTG CCC TTA GAG GAG 279Pro Gly Leu Leu His Leu Gln Leu Ser Arg Pro Leu Pro Leu Glu Glu475 480 485TCT GCC ATG TCT GCA GAC TGC CTA GAG GCA GCA GAA CAA CTC AGG AAC 327Ser Ala Met Ser Ala Asp Cys Leu Glu Ala Ala Glu Gln Leu Arg Asn490 495 500 505AGC TCT CTG ATA GAC TGC AGG TGC CAT CGG CGC ATG AAG CAC CAA GCT 375Ser Ser Leu Ile Asp Cys Arg Cys His Arg Arg Met Lys His Gln Ala510 515 520ACC TGT CTG GAC ATT TAT TGG ACC GTT CAC CCT GCC CGA AGC CTT GGT 423Thr Cys Leu Asp Ile Tyr Trp Thr Val His Pro Ala Arg Ser Leu Gly525 530 535GAC TAC GAG TTG GAT GTC TCA CCC TAT GAA GAC ACA GTG ACC 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175Arg Arg Asn Thr Ile Ala Pro Ser Cys Ala Leu Pro Ser Val Thr Pro180 185 190Asn Cys Leu Asp Leu Arg Ser Phe Cys Arg Ala Asp Pro Leu Cys Arg195 200 205Ser Arg Leu Met Asp Phe Gln Thr His Cys His Pro Met Asp Ile Leu210 215 220Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cys Leu Arg Ala Tyr Leu Gly225 230 235 240Leu Ile Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Ile Ser Lys Val Asn Thr245 250 255Thr Val Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly Ser Gly Asn Leu Gln Asp260 265 270Glu Cys Glu Gln Leu Glu Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Cys Leu Val275 280 285Glu Ala Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe His Arg Gln Leu Phe Ser Gln290 295 300Asp Trp Ala Asp Ser Thr Phe Ser Val Val Gln Gln Gln Asn Ser Asn305 310 315 320Pro Ala Leu Arg Leu Gln Pro Arg Leu Pro Ile Leu Ser Phe Ser Ile325 330 335Leu Pro Leu Ile Leu Leu Gln Thr Leu Trp340 345(2)关于SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1889个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征
(A)名称/关键CDS(B)位置41..1231(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:CGCAGGCAGA GCGCTGTCGC ATCCCGGGCG TCCACCCGCC ATG GGG CTC TCC TGG 55Met Gly Leu Ser Trp350AGC CCG CGA CCT CCA CTG CTG ATG ATC CTG CTA CTG GTG CTG TCG TTG103Ser Pro Arg Pro Pro Leu Leu Met Ile Leu Leu Leu Val Leu Ser Leu355 360 365TGG CTG CCA CTT GGA GCA GGA AAC TCC CTT GCC ACA GAG AAC AGG TTT151Trp Leu Pro Leu Gly Ala Gly Asn Ser Leu Ala Thr Glu Asn Arg Phe370 375 380GTG AAC AGC TGT ACC CAG GCC AGA AAG AAA TGC GAG GCT AAT CCC GCT199Val Asn Ser Cys Thr Gln Ala Arg Lys Lys Cys Glu Ala Asn Pro Ala385 390 395TGC AAG GCT GCC TAC CAG CAC CTG GGC TCC TGC ACC TCC AGT TTA AGC247Cys Lys Ala Ala Tyr Gln His Leu Gly Ser Cys Thr Ser Ser Leu Ser400 405 410 415AGG CCG CTG CCC TTA GAG GAG TCT GCC ATG TCT GCA GAC TGC CTA GAG295Arg Pro Leu Pro Leu Glu Glu Ser Ala Met Ser Ala Asp Cys Leu Glu420 425 430GCA GCA GAA CAA CTC AGG AAC AGC TCT CTG ATA GAC TGC AGG TGC CAT343Ala Ala Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Leu Ile Asp Cys Arg Cys His435 440 445CGG CGC ATG AAG CAC CAA 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Leu Val Glu Ala Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe His Arg Gln Leu340 345 350Phe Ser Gln Asp Trp Ala Asp Ser Thr Phe Ser Val Val Gln Gln Gln355 360 365Asn Ser Asn Pro Ala Leu Arg Leu Gln Pro Arg Leu Pro Ile Leu Ser370 375 380Phe Ser Ile Leu Pro Leu Ile Leu Leu Gln Thr Leu Trp385 390 395(2)关于SEQ ID NO:18的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度1271个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA”(ⅸ)特征(A)名称/关键CDS(B)位置2..946(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:C GGC TAC TGT GAA ACA CCT CAA CTC AGG AAC AGC TCT CTG ATA GGC 46Gly Tyr Cys Glu Thr Pro Gln Leu Arg Asn Ser Ser Leu Ile Gly400 405 410TGC ATG TGC CAC CGG CGC ATG AAG AAC CAG GTT GCC TGC TTG GAC ATC 94Cys Met Cys His Arg Arg Met Lys Asn Gln Val Ala Cys Leu Asp Ile415 420 425TAT TGG ACC GTT CAC CGT GCC CGC AGC CTT GGT AAC TAT GAG CTG GAT142Tyr Trp Thr Val His Arg Ala Arg Ser Leu Gly Asn Tyr Glu Leu Asp430 435 440GTC TCC CCC TAT GAA GAC ACA GTG ACC AGC AAA CCC TGG AAA ATG AAT190Val Ser Pro Tyr Glu Asp Thr Val Thr Ser Lys Pro Trp Lys Met Asn445 450 455 460CTC AGC AAA CTG AAC ATG CTC AAA CCA GAC TCA GAC CTC TGC CTC AAG238Leu Ser Lys Leu Asn Met Leu Lys Pro Asp Ser Asp Leu Cys Leu Lys465 470 475TTT GCC ATG CTG TGT ACT CTC AAT GAC AAG TGT GAC CGG CTG CGC AAG286Phe Ala Met Leu Cys Thr Leu Asn Asp Lys Cys Asp Arg Leu Arg Lys480 485 490GCC TAC GGG GAG GCG TGC TCC GGG CCC CAC TGC CAG CGC CAC GTC TGC334Ala Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro His Cys Gln Arg His Val Cys495 500 505CTC AGG CAG CTG CTC ACT TTC TTC GAG AAG GCC GCC GAG CCC CAC GCG382Leu Arg Gln Leu Leu Thr Phe Phe Glu Lys Ala Ala Glu Pro His Ala510 515 520CAG GGC CTG CTA CTG TGC CCA TGT GCC CCC AAC GAC CGG GGC TGC GGC430Gln Gly Leu Leu Leu Cys Pro Cys Ala Pro Asn Asp Arg Gly Cys Gly525 530 535 540GAG CGC CGG CGC AAC ACC ATC GCC CCC AAC TGC GCG CTG CCG CCT GTG 478Glu Arg Arg Arg Asn Thr Ile Ala Pro Asn Cys Ala Leu Pro Pro Val545 550 555GCC CCC AAC TGC CTG GAG CTG CGG CGC CTC TGC TTC TCC GAC CCG CTT 526Ala Pro Asn Cys Leu Glu Leu Arg Arg Leu Cys Phe Ser Asp Pro Leu560 565 570TGC AGA TCA CGC CTG GTG GAT TTC CAG ACC CAC TGC CAT CCC ATG GAC 574Cys Arg Ser Arg Leu Val Asp Phe Gln Thr His Cys His Pro Met Asp575 580 585ATC CTA GGA ACT TGT GCA ACA GAG CAG TCC AGA TGT CTA CGA GCA TAC 622Ile Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cys Leu Arg Ala Tyr590 595 600CTG GGG CTG ATT GGG ACT GCC ATG ACC CCC AAC TTT GTC AGC AAT GTC 670Leu Gly Leu Ile Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Val Ser Asn Val605 610 615 620AAC ACC AGT GTT GCC TTA AGC TGC ACC TGC CGA GGC AGT GGC AAC CTG 718Asn Thr Ser Val Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly Ser Gly Asn Leu625 630 635CAG GAG GAG TGT GAA ATG CTG GAA GGG TTC TTC TCC CAC AAC CCC TGC 766Gln Glu Glu Cys Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe Ser His Asn Pro Cys640 645 650CTC ACG GAG GCC ATT GCA GCT AAG ATG CGT TTT CAC AGC CAA CTC TTC 814Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe His Ser Gln Leu Phe655 660 665TCC CAG GAC TGG CCA CAC CCT ACC TTT GCT GTG ATG GCA CAC CAG AAT 862Ser Gln Asp Trp Pro His Pro Thr Phe Ala Val Met Ala His Gln Asn670 675 680GAA AAC CCT GCT GTG AGG CCA CAG CCC TGG GTG CCC TCT CTT TTC TCC 910Glu Asn Pro Ala Val Arg Pro Gln Pro Trp Val Pro Ser Leu Phe Ser685 690 695 700TGC ACG CTT CCC TTG ATT CTG CTC CTG AGC CTA TGG TAGCTGGACT 956Cys Thr Leu Pro Leu Ile Leu Leu Leu Ser Leu Trp705 710TCCCCAGGGC CCTCTTCCCC TCCACCACAC CCAGGTGGAC TTGCAGCCCA CAAGGGGTGA 1016GGAAAGGACA GCAGCAGGAA GGAGGTGCAG TGCGCAGATG AGGGCACAGG AGAAGCTAAG 1076GGTTATGACC TCCAGATCCT TACTGGTCCA GTCCTCATTC CCTCCACCCC ATCTCCACTT 1136CTGATTCATG CTGCCCCTCC TTGGTGGCCA CAATTTAGCC ATGTCATCTG GTGCCTGTGG 1196GCCTTGCTTT ATTCCTATTA TTGTCCTAAA GTCTCTCTGG GCTCTTGGAT CATGATTAAA 1256CCTTTGACTT AAAAA 1271(2)关于SEQ ID NO:19的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度315个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:Gly Tyr Cys Glu Thr Pro Gln Leu Arg Asn Ser Ser Leu Ile Gly Cys1 5 10 15Met Cys His Arg Arg Met Lys Asn Gln Val Ala Cys Leu Asp Ile Tyr20 25 30Trp Thr Val His Arg Ala Arg Ser Leu Gly Asn Tyr Glu Leu Asp Val35 40 45Ser Pro Tyr Glu Asp Thr Val Thr Ser Lys Pro Trp Lys Met Asn Leu50 55 60Ser Lys Leu Asn Met Leu Lys Pro Asp Ser Asp Leu Cys Leu Lys Phe65 70 75 80Ala Met Leu Cys Thr Leu Asn Asp Lys Cys Asp Arg Leu Arg Lys Ala85 90 95Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro His Cys Gln Arg His Val Cys Leu100 105 110Arg Gln Leu Leu Thr Phe Phe Glu Lys Ala Ala Glu Pro His Ala Gln115 120 125Gly Leu Leu Leu Cys Pro Cys Ala Pro Asn Asp Arg Gly Cys Gly Glu130 135 140Arg Arg Arg Asn Thr Ile Ala Pro Asn Cys Ala Leu Pro Pro Val Ala145 150 155 160Pro Asn Cys Leu Glu Leu Arg Arg Leu Cys Phe Ser Asp Pro Leu Cys165 170 175Arg Ser Arg Leu Val Asp Phe Gln Thr His Cys His Pro Met Asp Ile180 185 190Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cys Leu Arg Ala Tyr Leu195 200 205Gly Leu Ile Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Val Ser Asn Val Asn210 215 220Thr Ser Val Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly Ser Gly Asn Leu Gln225 230 235 240Glu Glu Cys Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe Ser His Asn Pro Cys Leu245 250 255Thr Glu Ala Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe His Ser Gln Leu Phe Ser260 265 270Gln Asp Trp Pro His Pro Thr Phe Ala Val Met Ala His Gln Asn Glu275 280 285Asn Pro Ala Val Arg Pro Gln Pro Trp Val Pro Ser Leu Phe Ser Cys290 295 300Thr Leu Pro Leu Ile Leu Leu Leu Ser Leu Trp305 310 315(2)关于SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1699个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键CDS(B)位置175..1374(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:TGTGGACGCG CGCTTCGGAG TTGGAGGGCG GCGCCCAGGA CCCTGGTGGG AGAGTGTGTG 60CGTCGCGCTG GAGGGCGGGA GGCGGGGGCG GGAGGTGCCG GTCGAGGGAG CCCCGCTCTC120AGAGCTCCAG GGGAGGAGCG AGGGGAGCGC GGAGCCCGGC GCCTACAGCT CGCC ATG 177MetGTG CGC CCC CTG AAC CCG CGA CCG CTG CCG CCC GTA GTC CTG ATG TTG 225Val Arg Pro Leu Asn Pro Arg Pro Leu Pro Pro Val Val Leu Met Leu320 325 330CTG CTG CTG CTG CCG CCG TCG CCG CTG CCT CTC GCA GCC GGA GAC CCC 273Leu Leu Leu Leu Pro Pro Ser Pro Leu Pro Leu Ala Ala Gly Asp Pro335 340 345CTT CCC ACA GAA AGC CGA CTC ATG AAC AGC TGT CTC CAG GCC AGG AGG 321Leu Pro Thr Glu Ser Arg Leu Met Asn Ser Cys Leu Gln Ala Arg Arg350 355 360AAG TGC CAG GCT GAT CCC ACC TGC AGT GCT GCC TAC CAC CAC CTG GAT 369Lys Cys Gln Ala Asp Pro Thr Cys Ser Ala Ala Tyr His His Leu Asp365 370 375 380TCC TGC ACC TCT AGC ATA AGC ACC CCA CTG CCC TCA GAG GAG CCT TCG 417Ser Cys Thr Ser Ser Ile Ser Thr Pro Leu Pro Ser Glu Glu Pro Ser385 390 395GTC CCT GCT GAC TGC CTG GAG GCA GCA CAG CAA CTC AGG AAC AGC TCT 465Val Pro Ala Asp Cys Leu Glu Ala Ala Gln Gln Leu Arg Asn Ser Ser400 405 410CTG ATA GGC TGC ATG TGC CAC CGG CGC ATG AAG AAC CAG GTT GCC TGC 513Leu Ile Gly Cys Met Cys His Arg Arg Met Lys Asn Gln Val Ala Cys415 420 425TTG GAC ATC TAT TGG ACC GTT CAC CGT GCC CGC AGC CTT GGT AAC TAT 561Leu Asp Ile Tyr Trp Thr Val His Arg Ala Arg Ser Leu Gly Asn Tyr430 435 440GAG CTG GAT GTC TCC CCC TAT GAA GAC ACA GTG ACC AGC AAA CCC TGG 609Glu Leu Asp Val Ser Pro Tyr Glu Asp Thr Val Thr Ser Lys Pro Trp445 450 455 460AAA ATG AAT CTC AGC AAA CTG AAC ATG CTC AAA CCA GAC TCA GAC CTC 657Lys Met Asn Leu Ser Lys Leu Asn Met Leu Lys Pro Asp Ser Asp Leu465 470 475TGC CTC AAG TTT GCC ATG CTG TGT ACT CTC AAT GAC AAG TGT GAC CGG 705Cys Leu Lys Phe Ala Met Leu Cys Thr Leu Asn Asp Lys Cys Asp Arg480 485 490CTG CGC AAG GCC TAC GGG GAG GCG TGC TCC GGG CCC CAC TGC CAG CGC 753Leu Arg Lys Ala Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro His Cys Gln Arg495 500 505CAC GTC TGC CTC AGG CAG CTG CTC ACT TTC TTC GAG AAG GCC GCC GAG 801His Val Cys Leu Arg Gln Leu Leu Thr Phe Phe Glu Lys Ala Ala Glu510 515 520CCC CAC GCG CAG GGC CTG CTA CTG TGC CCA TGT GCC CCC AAC GAC CGG 849Pro His Ala Gln Gly Leu Leu Leu Cys Pro Cys Ala Pro Asn Asp Arg525 530 535 540GGC TGC GGG GAG CGC CGG CGC AAC ACC ATC GCC CCC AAC TGC GCG CTG 897Gly Cys Gly Glu Arg Arg Arg Asn Thr Ile Ala Pro Asn Cys Ala Leu545 550 555CCG CCT GTG GCC CCC AAC TGC CTG GAG CTG CGG CGC CTC TGC TTC TCC 945Pro Pro Val Ala Pro Asn Cys Leu Glu Leu Arg Arg Leu Cys Phe Ser560 565 570GAC CCG CTT TGC AGA TCA CGC CTG GTG GAT TTC CAG ACC CAC TGC CAT993Asp Pro Leu Cys Arg Ser Arg Leu Val Asp Phe Gln Thr His Cys His575 580 585CCC ATG GAC ATC CTA GGA ACT TGT GCA ACA GAG CAG TCC AGA TGT CTA 1041Pro Met Asp Ile Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cys Leu590 595 600CGA GCA TAC CTG GGG CTG ATT GGG ACT GCC ATG ACC CCC AAC TTT GTC 1089Arg Ala Tyr Leu Gly Leu Ile Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Val605 610 615 620AGC AAT GTC AAC ACC AGT GTT GCC TTA AGC TGC ACC TGC CGA GGC AGT 1137Ser Asn Val Asn Thr Ser Val Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly Ser625 630 635GGC AAC CTG CAG GAG GAG TGT GAA ATG CTG GAA GGG TTC TTC TCC CAC 1185Gly Asn Leu Gln Glu Glu Cys Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe Ser His640 645 650AAC CCC TGC CTC ACG GAG GCC ATT GCA GCT AAG ATG CGT TTT CAC AGC 1233Asn Pro Cys Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe His Ser655 660 665CAA CTC TTC TCC CAG GAC TGG CCA CAC CCT ACC TTT GCT GTG ATG GCA 1281Gln Leu Phe Ser Gln Asp Trp Pro His Pro Thr Phe Ala Val Met Ala670 675 680CAC CAG AAT GAA AAC CCT GCT GTG AGG CCA CAG CCC TGG GTG CCC TCT 1329His Gln Asn Glu Asn Pro Ala Val Arg Pro Gln Pro Trp Val Pro Ser685 690 695 700CTT TTC TCC TGC ACG CTT CCC TTG ATT CTG CTC CTG AGC CTA TGG 1374Leu Phe Ser Cys Thr Leu Pro Leu Ile Leu Leu Leu Ser Leu Trp705 710 715TAGCTGGACT TCCCCAGGGC CCTCTTCCCC TCCACCACAC CCAGGTGGAC TTGCAGCCCA 1434CAAGGGGTGA GGAAAGGACA GCAGCAGGAA GGAGGTGCAG TGCGCAGATG AGGGCACAGG 1494AGAAGCTAAG GGTTATGACC TCCAGATCCT TACTGGTCCA GTCCTCATTC CCTCCACCCC 1554ATCTCCACTT CTGATTCATG CTGCCCCTCC TTGGTGGCCA CAATTTAGCC ATGTCATCTG 1614GTGCCTGTGG GCCTTGCTTT ATTCCTATTA TTGTCCTAAA GTCTCTCTGG GCTCTTGGAT 1674CATGATTAAA CCTTTGACTT AAAA1699(2)关于SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)长度400个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型
(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:Met Val Arg Pro Leu Asn Pro Arg Pro Leu Pro Pro Val Val Leu Met1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Ser Pro Leu Pro Leu Ala Ala Gly Asp20 25 30Pro Leu Pro Thr Glu Ser Arg Leu Met Asn Ser Cys Leu Gln Ala Arg35 40 45Arg Lys Cys Gln Ala Asp Pro Thr Cys Ser Ala Ala Tyr His His Leu50 55 60Asp Ser Cys Thr Ser Ser Ile Ser Thr Pro Leu Pro Ser Glu Glu Pro65 70 75 80Ser Val Pro Ala Asp Cys Leu Glu Ala Ala Gln Gln Leu Arg Asn Ser85 90 95Ser Leu Ile Gly Cys Met Cys His Arg Arg Met Lys Asn Gln Val Ala100 105 110Cys Leu Asp Ile Tyr Trp Thr Val His Arg Ala Arg Ser Leu Gly Asn115 120 125Tyr Glu Leu Asp Val Ser Pro Tyr Glu Asp Thr Val Thr Ser Lys Pro130 135 140Trp Lys Met Asn Leu Ser Lys Leu Asn Met Leu Lys Pro Asp Ser Asp145 150 155 160Leu Cys Leu Lys Phe Ala Met Leu Cys Thr Leu Asn Asp Lys Cys Asp165 170 175Arg Leu Arg Lys Ala Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro His Cys Gln180 185 190Arg His Val Cys Leu Arg Gln Leu Leu Thr Phe Phe Glu Lys Ala Ala195 200 205Glu Pro His Ala Gln Gly Leu Leu Leu Cys Pro Cys Ala Pro Asn Asp210 215 220Arg Gly Cys Gly Glu Arg Arg Arg Asn Thr Ile Ala Pro Asn Cys Ala225 230 235 240Leu Pro Pro Val Ala Pro Asn Cys Leu Glu Leu Arg Arg Leu Cys Phe245 250 255Ser Asp Pro Leu Cys Arg Ser Arg Leu Val Asp Phe Gln Thr His Cys260 265 270His Pro Met Asp Ile Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cys275 280 285Leu Arg Ala Tyr Leu Gly Leu Ile Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe290 295 300Val Ser Asn Val Asn Thr Ser Val Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly305 310 315 320Ser Gly Asn Leu Gln Glu Glu Cys Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe Ser325 330 335His Asn Pro Cys Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe His340 345 350ser Gln Leu Phe Ser Gln Asp Trp Pro His Pro Thr Phe Ala Val Met355 360 365Ala His Gln Asn Glu Asn Pro Ala Val Arg Pro Gln Pro Trp Val Pro370 375 380Ser Leu Phe Ser Cys Thr Leu Pro Leu Ile Leu Leu Leu Ser Leu Trp385 390 395 400
权利要求
1．分离纯化的DNA分子，具有如大鼠retL1 cDNA，人部分retL1cDNA，人retL1 cDNA，人retL2 cDNA，鼠retL3 cDNA或人retL3 cDNA所示的核苷酸序列。
2．编码大鼠RetL1，人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3的氨基酸序列的DNA分子。
3．分离纯化的DNA分子，用于在原核或真核宿主细胞中安全表达多肽产物，该多肽产物至少具有大鼠RetL1，人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3的部分一级结构构象和生物活性，上述DNA选自下列DNA分子a)大鼠retL1 cDNA，人部分retL1 cDNA，人retL1 cDNA，人retL2cDNA，鼠retL3 cDNA，或人retL3 cDNA的DNA分子，或其互补链；b)在严格条件下与a)中所述的DNA分子或其片段杂交的DNA分子。c)因为遗传密码的简并性，能与a)和b)中所述DNA分子杂交的DNA分子。
4．分离纯化的DNA分子，至少具有与大鼠retL1 cDNA，人部分retL1 DNA，人retL1 cDNA，人retL2 cDNA，鼠retL3 cDNA或人retLcDNA80％的同源。
5．权利要求4的DNA，进一步特征在于编码具有大鼠RetL1，人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3的生物活性的蛋白。
6．根据权利要求1,2,3,4或5所述的重组DNA分子，适当地与表达调控序列相连。
7．包含编码大鼠Ret1，人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3，人部分RetL3或人全长RetL3的DNA分子的载体。
8．包含根据权利要求1,2,3,4或5的任意一项所述的DNA分子的具生物功能的质粒或病毒DNA载体。
9．由包含编码大鼠RetL1，人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3的DNA分子的载体稳定转化或转染的原核或真核宿主细胞。
10．合成具有大鼠RetL1，人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3，人部分RetL3或人全长RetL1的部分或全部一级结构构象和生物活性的多肽产物的方法，该方法包括以允许这样的多肽产物表达的方式，在适当的培养条件下，培养用根据权利要求1,2,3,4或5所述的DNA分子转化或转染的原核或真核宿主细胞，并回收大鼠RetL1，人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3。
11．根据权利要求10在真核或原核宿主细胞中表达DNA的多肽产物。
12．分离纯化的大鼠RetL1，人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3，基本上不含其它人类蛋白质。
13．具有包括大鼠RetL1，人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3，人部分RetL3或人全长RetL3的氨基酸序列的蛋白。
14．一种蛋白，该蛋白是大鼠RetL1，人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3，人部分RetL3或人全长RetL3的变体。
15．根据权利要求11,12,13或14所述的蛋白的可溶性变体。
16．含大鼠RetL1，人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3，人部分RetL3或人全长RetL3的IgG融合蛋白。
17．权利要求15的蛋白，该蛋白与毒素，可成像的化合物或放射性核素结合。
18．针对权利要求11,12,13，或14的蛋白的特异的单克隆抗体。
19．权利要求18的抗体，该蛋白与毒素，可成像的化合物或放射性核素结合。
20．产生针对大鼠RetL1，人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3，人部分RetL3或人全长RetL3的特异抗体的杂交瘤细胞系。
21．权利要求20的杂交瘤产生的抗体。
22．在受治疗者中促进新组织生长或促进损伤组织存活的方法，包括给受治疗者施用治疗有效剂量的大鼠RetL1，人部分RetL1，人全长RetL1，人RetL2，鼠RetL3，人部分RetL3或人全长RetL3的多肽。
23．权利要求22的方法，进一步包括给受治疗者施用治疗有效剂量的第二种多肽。
24．权利要求23的方法，其中第二中多肽是GDNF,neurturin或GDNF相关多肽。
25．权利要求22的方法，其中的组织是肾或神经组织。
26．权利要求22的方法，其中的多肽是膜结合的。
27．权利要求22的方法，其中的多肽是可溶的。
28．权利要求27的方法，其中的多肽是融合蛋白。
29．权利要求22,23,24,25,26或27的方法，其中受治疗者是人类。
30．抑制表达RetL的细胞中信号传导的方法，包括将细胞与抗RetL的抗体接触。
31．在表达Ret的细胞中抑制信号传导的方法，包括使细胞与可溶的Ret蛋白接触。
32．权利要求31的方法，其中可溶的Ret蛋白是融合蛋白。
33．将毒素，可成像的化合物或放射性核素导向表达Ret的细胞的方法，包括使细胞与权利要求17的RetL融合蛋白接触。
34．抑制表达Ret的肿瘤细胞生长的方法，包括使细胞与RetL和毒素或放射性核素的融合蛋白接触。
35．权利要求30-34的任意一项的方法，其中细胞在受治疗者体内，蛋白施用给受治疗者。
36．将毒素，可成像化合物或放射性核素导向表达RetL的细胞的方法，包括使细胞与偶联了毒素，可成像化合物或放射性核素的抗RetL抗体接触。
37．抑制表达RetL的肿瘤细胞生长的方法，包括使细胞与偶联了毒素或放射性核素的抗RetL抗体接触。
38．权利要求36或37的方法，其中细胞在受治疗者体内，偶联的抗体施用给受治疗者。
39．将毒素，可成像化合物或放射性核素导向表达RetL的细胞的方法，包括使细胞与Ret融合蛋白接触，其中Ret融合蛋白包括Ret和毒素，可成像化合物或放射性核素。
40．权利要求39的方法，进一步包括使细胞与GDNF,neuturin，或GDNF相关多肽接触。
41．抑制表达RetL的肿瘤细胞生长的方法，包括使细胞与Ret和毒素或放射性核素的融合蛋白接触。
42．权利要求39,40或41的方法，其中细胞在受治疗者体内，蛋白施用给受治疗者。
43．治疗患RetL代谢紊乱的对象的方法，包括给受治疗者施用权利要求7或8的载体。
44．促进受治疗者体内新组织生长的方法，包括给受治疗者施用权利要求7或8的载体。
45．权利要求44的方法，其中的组织是肾组织或神经组织。
46．促进受治疗者体内损伤组织存活的方法，包括给受治疗者施用治疗有效剂量的权利要求7或8的载体。
47．权利要求46的方法，其中的组织是肾组织或神经组织。
全文摘要
本发明涉及编码Ret配体(RetL9)的核苷酸序列以及通过用RetLDNA或蛋白处理细胞和哺乳动物受治疗者以刺激神经和肾的生长的方法。本发明提供了分离纯化的编码RetL和DNA分子,含有任何RetL的核苷酸序列,特别包括鼠retL1 cDNA(SEQIDNO∶1),人部分RetL1cDNA(SEQIDNO∶8),人全长retL1 cDNA(SEQIDNO∶10),人retL2cDNA(SEQIDNO∶12),鼠retL3 cDNA(SEQIDNO∶12)或人retL3cDNA(SEQIDNO∶16),人部分retL3 cDNA(SEQIDNO∶18)或人retL3 cDNA(SEQIDNO∶20)。本发明进一步提供了RetL蛋白,具有包括大鼠RetL1(SEQIDNO∶2),人部分RetL1(SEQIDNO∶9),人全长RetL(SEQIDNO∶11),人RetL2(SEQIDNO∶13),鼠RetL3(SEQIDNO∶17),人部分RetL3(SEQIDNO∶19)或人RetL3(SEQIDNO∶21)的氨基酸序列。
文档编号C07K14/72GK1232469SQ97195466
公开日1999年10月20日 申请日期1997年5月7日 优先权日1996年5月8日
发明者M·萨尼科拉－纳德尔, C·赫辛, R·L·卡特 申请人:拜奥根有限公司