专利名称：一种分离纯化香菇菌多糖的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物分离纯化技术，具体地说是关于香菇菌多糖分离纯化的工艺。
在本发明提出之前，传统的分离纯化香菇菌多糖的方法，只在工艺上采取脱蛋白方法，没有针对性地去除色素及小分子物质，因而纯化后其纯度一般只能达到30％-40％，最多也只能达到70％左右，仅能制成一般口服制剂产品。
本发明的目的是对香菇菌粗多糖进行“三脱”(脱蛋白，脱色，脱盐)处理，并进行分子量截留超滤和柱层析纯化，以达到提高香菇菌多糖的纯度，使其能用于制备香菇菌多糖片剂、胶囊剂、针剂等多种制剂的原料药。
实现本发明的具体工艺方法，是从香菇菌深层培养的菌丝体中，提取生物活性成份香菇菌粗多糖，对其进行脱蛋白，脱盐，脱色素处理和柱层析纯化。具体工艺步骤1．脱蛋白取香菇菌粗多糖1份，加水2000ml于90～100℃加热30min后，3000rpm离心收取上清，加入等量氯仿∶正丁醇(1∶0.2～1∶0.25)，萃取杂蛋白5～10次，3000rpm离心取上层，大部分杂蛋白被去除。2．分子量截留超滤(1)脱盐，用截留分子量(MW50,000)的超滤膜超滤脱盐及去除小分子杂质。(2)去除大分子杂质，用截留分子量(MW100,000)的超滤膜超滤去除大分子杂质，调节PH5.8～PH6.5.3．柱层析三步法纯化(1)阴离子交换柱层析(DE-52)，用PH5.8～PH6.5,0.01MPBS缓冲液平衡DE52柱，上样量40ML～80ML，流速1～3ml/min，测总糖，流出峰为多糖峰，色素及部分杂质吸附于交换柱中被分离去除；(2)阳离子交换柱层析，用PH4.8～PH5.5,0.01MPBS缓冲液平衡CM52柱进一步分离，流速0.1～0.3ml/min，测总糖，得到6个峰，峰6为所需多糖峰；(3)分子筛柱层析，将峰6浓缩5～10后倍后，上Sephedax柱，流速0.1～0.3ml/min，测总糖，得到2个峰，峰1即为分离纯化后的香菇菌多糖峰，经高效液相检测为单一峰；4．干燥，将过sephedax G-100柱层析后的峰1经冷冻干燥后，即为香菇菌多糖精制纯品的干燥粉末。经高效液相检测，其为单一多糖成份，纯度达90％以上。
本发明与传统的分离纯化香菇菌多糖只单一脱蛋白相比较，充分地体现了其工艺的优越性及可操作性。其工艺实践证明，此方法获取的香菇菌多糖，主要成份为甘露聚糖肽，其多糖部分主要以甘露糖为主，具有抗病毒、抗肿瘤、抗细菌感染、诱生干扰素及增强机体免疫等作用。
下面结合附图及实施例，进一步描述本发明
本发明附
图1是分离纯化香菇菌多糖的工艺流程图，附图2是阴离子交换柱层析图谱，附图3是阳离子交换柱层析图谱，附图4是分子筛柱析图谱，附图5是高效液相检测图谱。
实施例实施操作步骤(见附图1)1．脱蛋白香菇菌粗多糖10g，加水2000ml于90℃加热30min后，3000rpm离心收取上清，加等量氯仿∶正丁醇(1∶0.22)萃取杂蛋白7次，3000rpm离心收取上层，大部分杂蛋白被去除。2．超滤①脱盐(及去除小分子杂质)用截留分子量(MW50,000)的超滤膜超滤脱盐及去除小分子杂质。
②去除大分子杂质用截留分子(MW100,000)的超滤膜超滤去除大分子杂质，调节PH6.0。3． 柱层析纯化(三步法)①阴离子交换柱层析(DE-52)用PH6.0,0.01MPBS缓冲液平衡DE52柱(4×20cm)，上样量50ml，流速2ml/min，测总糖，流出峰为多糖峰，色素及部分杂质吸附于交换柱中被分离去除(图2)②阳离子交换柱层析用PH5.0,0.01MPBS缓冲液平衡CM52柱(2×100cm)进一步分离，流速0.2ml/min，测总糖，得到6个峰，峰6为所需的多糖峰(图3)③分子筛柱层析将峰6浓缩5倍后，上Sephedax G-100(2×100cm)，流速0.1ml/min，测总糖，得到2个峰，峰1即为分离纯化后的香菇菌多糖峰(图4)，经高效液相检测为单一峰(图5)。
4．干燥将过Sephedax G-100柱层析后的峰1经冷冻干燥后，即为香菇菌多糖精制纯品的干燥粉末。经高效液相检测，其为单一多糖成份，纯度达90％以上。
总之，本发明提供了一种分离纯化香菇菌多糖的新工艺方法，通过本发明制备得到的香菇菌多糖可作为多种制剂的原料药使用。
权利要求
1．一种分离纯化香菇菌多糖的工艺，它至少包括对香菇菌粗多糖进行脱蛋白、脱色、脱盐处理及将其分子量截留超滤和柱层析纯化，最后干燥。
2．根据权利要求1所述的一种分离纯化香菇菌多糖的工艺，其特征是(1)脱蛋白取香菇菌粗多糖1份，加水2000ml于90～100℃加热30min后，3000rpm离心收取上清，加入等量氯仿∶正丁醇(1∶0.2～1∶0.25)，萃取杂蛋白5～10次，3000rpm离心取上层，大部分杂蛋白被去除。(2)分子量截留超滤a．脱盐，用截留分子量(MW50,000)的超滤膜超滤脱盐及去除小分子杂质。b．去除大分子杂质，用截留分子量(MW100,000)的超滤膜超滤去除大分子杂质，调节PH5.8～PH6.5。
3．根据权利要求1所述的一种分离纯化香菇菌多糖的工艺，其特征是柱层析三步法纯化(1)阴离子交换柱层析(DE-52)，用PH5.8～PH6.5,0.01MPBS缓冲液平衡DE52柱，上样量40ML～80ML，流速1～3ml/min，测总糖，流出峰为多糖峰，色素及部分杂质吸附于交换柱中被分离去除；(2)阳离子交换柱层析，用PH4.8～PH5.5,0.01MPBS缓冲液平衡CM52柱进一步分离，流速0.1～0.3ml/min，测总糖，得到6个峰，峰6为所需多糖峰；(3)分子筛柱层析，将峰6浓缩5～10倍后，上sephedax柱，流速0.1～0.3ml/min，测总糖，得到2个峰，峰1即为分离纯化后的香菇菌多糖峰，经高效液相检测为单一峰。
全文摘要
一种分离纯化香菇菌多糖的工艺,本发明涉及生物纯化技术,具体地说是关于香菇菌多糖分离纯化技术。本发明主要解决传统的分离纯化香菇菌多糖的方法只采取脱蛋白的方法,没有针对性地去除色素和小分子物质,因此纯度低。本发明技术方法是用氯仿:正丁醇萃取,去除杂蛋白后,采用超滤、离子交换柱层析和分子筛柱层析,进行多步骤分离纯化,其获取的香菇菌多糖为单一多糖,纯度达90%以上。
文档编号C08B37/00GK1314417SQ0011443
公开日2001年9月26日 申请日期2000年3月20日 优先权日2000年3月20日
发明者王春生, 吴晶, 程汉强 申请人:武汉迪普生物技术有限公司