Gcsf缀合物的制作方法

专利名称：Gcsf缀合物的制作方法
背景技术：
粒细胞集落刺激因子(GCSF)是一种药学上的活性蛋白，所述蛋白调节嗜中性粒细胞的增殖、分化和机能的激活(Metcalf，Blood 67257(1986)；Yan等，Blood 84(3)795-799(1994)；Bensinger等，Blood 81(11)3158-3163(1993)；Roberts等，Expt’l Hematology 221156-1163(1994)；Neben等，Blood 81(7)1960-1967(1993))。GCSF可以使干细胞和前体细胞从骨髓转移(mobilization)，并且用于治疗由于化学疗法引起的粒细胞减少的患者，或用作骨髓移植的前序。
美国专利第5,214,132号公开了一种人GCSF的突变蛋白，所述突变蛋白在位置1、3、4、5和17不同于天然hGCSF，所述突变蛋白的所述位置不是天然GCSF的氨基酸，而分别是Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser。(也参见，Kuga等，Biochem.Biophys.Res.Commun.159103-111(1989))。M.Okabe等(Blood 75(9)1788-1793(1990年5月1日))报道了一种rhGCSF的衍生物，其中在rhGCSF N端区的5个位置上的氨基酸被取代，在两种测定中，所述rhGCSF衍生物显示比小鼠和/或人骨髓祖细胞中的完整rhGCSF的比活高。美国专利第5,218,092号公开了一种人GCSF的突变蛋白，所述突变蛋白在位置1、3、4、5、17、145和147不同于天然hGCSF，所述突变蛋白的所述位置不是天然GCSF的氨基酸，而分别是Ala、Thr、Tyr、Arg、Ser、Asn和Ser。美国专利第5,214,132和5,218,092号的公开内容通过引用结合到本文中。
蛋白治疗药物例如GCSF的生物利用度通常受血浆半寿期短的限制，并且对蛋白酶降解敏感，阻碍了最大的临床潜能。其它治疗蛋白的研究已经表明，通过使蛋白与聚合物例如聚乙二醇(PEG)缀合，通常一个与通过蛋白和PEG两者共价结合的连接部分缀合，可以克服这样的困难。
这种PEG缀合的生物分子已经显示具有临床上的可应用特性(Inada等，J.Bioact.and Compatible Polymers，5343(1990)；Delgado等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，9249(1992)；和Katre，Advanced Drug Delivery Systems，1091(1993))。在这些特性中有更好的物理和热稳定性、针对酶降解敏感性的保护作用、溶解度增加、使体内循环半寿期更长和清除率减少、降低免疫原性和抗原性以及降低毒性。
具有与本发明缀合物的结构不同的PEG-GCSF缀合物公开于欧洲专利公布号EP 0 335 423；欧洲专利公布号EP 0 401 384；R.W.Niven等，J.Controlled Release 32177-189(1994)；和Satake-Ishikawa等，Cell Structure and Function，17157-160(1992))。
发明概述因此，本发明是一类新型的GCSF的PEG衍生物。本发明的缀合物具有一个可以参见下文的酰胺连接物。
与未修饰的GCSF(即没有连接PEG的GCSF)比较，本缀合物的循环半寿期和血浆滞留期增加、清除率减少以及体内粒细胞生成活性增加。另外，与PEG-GCSF缀合物比较，本发明的缀合物具有优良的粒细胞生成特性。其它PEG-GCSF缀合物公开于欧洲专利公布号EP 0335 423；欧洲专利公布号EP 0 401 384；以及载于Niven等(出处同上)中。然而，本发明缀合物的结构不同于这些缀合物，并且具有优良的特性，尤其在体内低剂量时表现出长期、高粒细胞生成活性。
本发明的一个优选的GCSF是一种GCSF突变蛋白，所述突变蛋白的特性等同于或优于天然GCSF，并且与GCSF的用途相同。所述突变蛋白与GCSF的氨基酸序列相同，只是所述突变蛋白在位置1、3、4、5和17的氨基酸不是天然GCSF氨基酸，而分别是Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser(GCSF突变蛋白)(参见

图1)。该突变蛋白公开于美国专利第5,214,132号，该专利通过引用结合到本文中。
本发明生理学活性PEG-GCSF缀合物的结构式如下 本发明的另一部分是要求保护的缀合物的组合物，其中对于所述组合物中的缀合物而言，m和n可以为不同的整数。
本发明缀合物的用途与GCSF相同。具体来说，本发明的缀合物可用于治疗由于化学疗法引起的粒细胞已减少的患者或用作骨髓移植的前序，其方式与用GCSF治疗这些病症的方式相同。然而，本发明的缀合物具有包括优良的稳定性、更高的溶解度、循环半寿期和血浆滞留期增加在内的改良的特性。
附图的描述图1GCSF突变蛋白的一级结构所示的GCSF突变蛋白在位置1、3、4、5和17上不同于野生型人GCSF，所述突变蛋白在所述位置上不是天然GCSF氨基酸，而分别是Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser。图2PEG化(Pegylation)试剂图320kDa PEG修饰的和未修饰的GCSF突变蛋白的分离。PEG反应混合物的一种典型洗脱图。
柱子1-2ml FractogelEMD SO3650S。
平衡缓冲液10mM乙酸铵，pH 4.5洗脱缓冲液1. 0.15M NaCl的平衡缓冲液2. 0.5M NaCl的平衡缓冲液图4单次注射后第5天的PEG-GCSF突变蛋白活性给雌性C57BL/6J小鼠皮下注射25.2μg PEG化GCSF突变蛋白缀合物；在给药后的第5天，从眶后窦中收集静脉血样品。进行计数器血液学分析和白细胞分类分析(leukocyte differentialanalysis)；将所得到的嗜中性粒细胞计数相对于每个实验的载体对照标准化。所示数据代表每组4只小鼠的平均值±S.E.。图5 在酰胺和脲连接的GCSF突变蛋白-PEG缀合物中随PEG质量(kDa)而变化的PMN的增加。对于用SPA试剂制备的缀合物，PMN＝0.277MW+3.95。对于用脲试剂制备的缀合物，PMN＝0.152MW+2.74。图6 单次注射后第7天的PEG-GCSF突变蛋白活性给雌性C57BL/6J小鼠皮下注射25.2μg PEG化的GCSF突变蛋白缀合物；在给药后的第7天，收集眶后静脉血样品。进行计数器血液学分析和白细胞分类分析；将所得到的嗜中性粒细胞计数相对于每个实验的载体对照标准化。所示数据代表每组4只小鼠的平均值±S.E.。图7 鼠PBSC转移集落测定图8 鼠PBSC转移集落测定图9 鼠PBSC转移集落测定图10鼠PBSC转移集落测定图11鼠PBSC转移集落测定发明详述要求保护的发明是一种具有下式结构的生理学活性PEG-GCSF缀合物 其中G是一种粒细胞集落刺激因子，其参与如式I中所示的聚乙二醇部分的酰胺键的氨基较少，R为低碳烷基，n为420-550的整数，而m为1-5的整数。
选择n和m的数目，使得所产生的式I缀合物的生理学活性和未修饰的GCSF相当，所述活性可以表示与未修饰GCSF的相应活性相同、超过其活性或为未修饰GCSF相应活性的一部分。n代表PEG单位中环氧乙烷残基的数目。OCH2CH2的一个PEG亚单位的分子量约为44道尔顿。m代表与所述GCSF分子连接的PEG单位的数目。本发明的缀合物可以有1、2、3、4、5或6个PEG单位/个GCSF分子。因此，所述缀合物的分子量(不包括所述GCSF的分子量)取决于n和m的数目。
n值可以为420-550，产生其中每个PEG单位的平均分子量为约18千道尔顿至约25千道尔顿/PEG单位的缀合物。n值最好为450-490，产生其中每个PEG单位的平均分子量约为20千道尔顿的缀合物。m可以为1、2、3、4或5。优选的m为1-4，特别优选的m为2。本发明缀合物PEG部分的分子量范围为约18千道尔顿(n＝420，m＝1)至约125千道尔顿(n＝550，m＝5)。如果n为420-550而m为1-4的整数，则本发明缀合物PEG部分的分子量范围为约18千道尔顿(n＝420，m＝1)至约97千道尔顿(n＝550；m＝4)。“约”为某一数值的分子量是指所述数值在通过常规分析技术测定的合理范围内。
在一个优选的缀合物中，n为450-490，而m为1-4，在所述情况下，所述缀合物PEG部分的分子量范围为约20千道尔顿(n＝450；m＝1)至约86千道尔顿(n＝490；m＝4)。在另一优选的缀合物中，n为420-550，而m为2，在所述情况下，所述缀合物PEG部分的分子量范围为约37千道尔顿(n＝420)至约48千道尔顿(n＝550)。在一个特别优选的缀合物中，n为450-490，而m为2，在所述情况下，所述缀合物PEG部分的分子量范围为约40千道尔顿(n＝450)至约43千道尔顿(n＝490)。
R可以是任一低碳烷基，所谓低碳烷基是指具有1-6个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、异丙基等。包括支链烷基。一个优选的烷基是甲基。
所谓GCSF是指从任何常规来源例如组织、蛋白质合成、含有天然或重组细胞的细胞培养物中获得的、最好是人类的天然或重组的蛋白。包括具有GCSF活性的任一蛋白，例如突变蛋白或非突变的修饰蛋白。从天然或重组来源获得并且分离GCSF是众所周知(参见，例如美国专利第4,810,643和5,532,341号，所述专利的公开内容通过引用结合到本文中)。一种优选的GCSF缀合物是如美国专利第5,214,132号中所描述的带有GCSF突变蛋白的缀合物。
式I的生理学活性缀合物具有GCSF活性，意思是指如通过本领域已知的各种分析所测定的任何已知GCSF活性的任一部分活性或多种活性。具体来说，本发明的缀合物具有表现为增加PMN计数能力的GCSF活性。这是一种已知的GCSF活性。在缀合物中的这种活性可以通过本领域众所周知的分析法而确定，例如下文描述的分析法(也参见Asano等，Jpn.Pharmacol.Ther.(1991)192767-2773；Yamasaki等，J.Biochem.(1994)115814-819；和Neben等，Blood(1993)811960)。
通过GCSF与下式的琥珀酰亚胺丙酸(SPA)试剂共价连接，产生式I的缀合物 通过常规方法，按照已知步骤，可以获得式II的试剂(参见美国专利第5,672,662号，该专利的公开内容通过引用结合到本文中)。n与上述式I中的一样，并选择n以产生所需分子量的缀合物。优选其中n为450-490(MW＝20kDa)的这类试剂。通过常规方法，根据用于式II试剂中的PEG-醇原材料而变化n，可以获得其它的分子量。分子量为5kDa、10kDa、15kDa和20kDa的式II的SPA试剂可以得自ShearwaterPolymers，Inc.(Huntsville，Alabama)。
通过常规方法可以将式II的试剂与GCSF缀合。连接是通过酰胺键进行的。具体来说，式II的试剂主要与GCSF的一个或更多个伯氨基(例如，N末端和赖氨酸侧链)反应，在GCSF和PEG聚合物骨架之间形成一个酰胺键。式I中所示的NH衍生自与式II的试剂反应形成一个酰胺键的GCSF的这些伯氨基。式II的试剂还可以在较低程度上与位于GCSF位置66上的丝氨酸的羟基反应，以在GCSF和PEG聚合物骨架之间形成一个酯键。对技术人员而言，所述反应条件是常规的，并在下文的详述中提供。
通过常规方法可以完成所述试剂与GCSF的连接。可以使用本发明任何选定MW的PEG(n)。例如，可以在pH为5-10的溶液中、在温度为4℃-室温、持续30分钟-20小时、利用试剂与蛋白的摩尔比为4∶1-30∶1的条件下进行所述反应。可以选择反应条件以指导所述反应向主要产生所需取代程度的方向进行。一般而言，低温、低pH(例如pH5)和短反应时间趋于减少所连接的PEG的数目(较低的m)。高温、中性至高pH(例如pH≥7)和较长的反应时间，增加所连接的PEG的数目(较高的m)。例如，在式II试剂为5kDa、pH7.3和试剂与蛋白的摩尔比为30∶1、温度为4℃以及反应时间为30分钟的情况下主要产生单-PEG缀合物；温度为4℃并且反应时间为4小时的情况下主要产生二-PEG缀合物；温度为室温并且反应时间为4小时的情况下主要产生三-PEG缀合物。所述反应通过使所述反应混合物酸化并且冷冻于-20℃而终止。一般而言，优选pH为7-7.5以及试剂与蛋白的摩尔比为4∶1-6∶1。
根据电荷差异，可以采用例如阳离子交换层析的纯化方法分离缀合物，这有效地将缀合物分离成它们的各种分子量。例如，可以在阳离子交换柱上加样，然后用约20mM乙酸钠(pH约4)洗涤，然后用缓冲的线性(0M-0.5M)NaCl梯度(pH为3-5.5，最好是pH约为4.5)洗脱。可以采用常规方法，例如质谱法、SDS-PAGE或其它已知的根据分子量分离分子实体的方法，根据分子量，鉴定通过阳离子交换层析获得的流分的内容物。因此鉴定出含有连接有所需数目(m)PEG的式I缀合物的流分，将所述流分纯化成无未修饰的GCSF和不具有所连接PEG的其它数目的缀合物。
本发明的另一部分是一种缀合物的组合物，其中包括特定比率的m值不同的缀合物。本发明的一个优选组合物是其中m＝1、2、3和4的缀合物的混合物。其中m＝1的缀合物的百分比为18-25％，其中m＝2的缀合物的百分比为50-66％，其中m＝3的缀合物的百分比为12-16％，而其中m＝4的缀合物的百分比至多为5％。这样的一种组合物可以通过摩尔比为4-6∶1(过量的试剂)的PEG化试剂与GCSF反应而产生。让所述反应于4℃-8℃、pH接近7.5下进行20小时，在所述反应结束时，加入乙酸.然后将缀合物从在反应期间存在的残余的未修饰的蛋白、过量的PEG化试剂和其它杂质以及缓冲液组分中纯化出来。除PEG化蛋白外，还产生作为反应副产物的N-羟基琥珀酰亚胺和聚乙二醇-羧酸。
提供以下实施例以说明本文所描述的发明，而不是以任何方式限制本发明。在这些实施例中使用GCSF突变蛋白。通过例举的方法，也可将其它种类的GCSF与PEG缀合。
实施例1PEG化试剂1.GABA酰胺连接物(P-6GA-1，P-12Ga-1)所述GABA酰胺连接物试剂含有或者为6kDa或者为12kDa的2条PEG链。对于所述结构参见图2-A。2.酰胺连接物(P-5am-1，P-10am-1)产生5kDa和10kDa酰胺连接物。对于所述结构参见图2-B。3.酰胺连接物该试剂是用5kDa、10kDa、15kDa和20kDa PEG分子制备的商品琥珀酰亚胺丙酸(SPA)，其通用结构示于图2-C中。4.脲连接物该试剂用5kDa、10kDa和25kDa PEG分子制备，所述典型结构示于图2-D中。5.氨基甲酸乙酯连接物产生10kDa和20kDa氨基甲酸乙酯连接物，所述结构示于图2-E中。6.氨基甲酸乙酯连接物示于图2-G中的作为商品制备的36kDa PEG试剂的该结构表明，所述PEG试剂的一端用一个叔丁基加帽。该试剂是在本实例中所用的最高分子量的PEG。7.硫代氨基甲酸乙酯连接物该PEG化试剂的结构可以参见图2-F。在该试剂中所用的PEG的分子量为20kDa。
以下试剂由Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.Tokyo，Japan)提供1)G-CSF突变蛋白是指GCSF突变蛋白、与包含或者为6kDa或者为12kDa的2条m-PEG链的支链甲氧基聚乙二醇(m-PEG)试剂(PEG-GABA-NHS，参见图2A)缀合的GCSF突变蛋白、与5kDa和10kDa线性、酯/酰胺的m-PEG试剂(参见图2B)缀合的GCSF突变蛋白。分子量为5kDa、10kDa、15kDa和20kDa的m-PEG-琥珀酰亚胺丙酸-NHS(PEG-SPA)试剂购自Shearwater Polymers(Huntsville，Alabama，参见图2C)。以下蛋白PEG化试剂在Hoffmann-La Roche，Inc制备1)m-PEG-脲连接物(5kDa、10kDa和25kDa，参见图2D)，2)m-PEG-氨基甲酸乙酯连接物(10kDa和20kDa，参见图2E)，m-PEG-硫代氨基甲酸乙酯连接物(10kDa和20kDa，参见图2F)，而平均分子量为36kDa的叔丁基-m-PEG-氨基甲酸乙酯连接物试剂得自DDI Pharmaceuticals，Inc.(Mountainview，CA，参见图2G)。PEG化试剂影响PEG化反应的因素有1)pH，2)温度，3)反应时间，4)蛋白与PEG试剂的摩尔比，和5)蛋白质浓度。通过控制这些因素中的一个或更多个，人们可以指导所述反应向主要产生单、二、三等PEG缀合物的方向进行。例如，用于Shearwater Polymer的SPA-PEG 5000(N-羟基琥珀酰亚胺)试剂的反应条件是1)pH 7.3，2)对于单-PEG和二-PEG，温度为4℃，而对于三-PEG，温度为室温，3)对于单-PEG，反应时间为30分钟，而对于二-PEG和三-PEG，反应时间为4小时，和4)蛋白与试剂的摩尔比为1∶30。对于所有试剂，单独确定产生所需PEG种类的最适反应条件。它们示于表1中。所述反应通过使所述反应混合物酸化并且冷冻于-20℃而终止。从反应混合物中分离修饰的和游离的GCSF突变蛋白(磺丙基(SP)阳离子交换)含有大约5mg蛋白质的反应混合物用水稀释10-20倍，并且用冰醋酸将pH调至4.5。然后将所稀释的样品上样到先前已装填1-2mlFractogel EMD SO3--650S(EM Separations，Gibbstown，New Jersey)柱中，所述柱已用10mM乙酸铵(pH 4.5)平衡。在流通液中去除未吸附的试剂和反应副产物。采用0.15M NaCl的平衡缓冲液，用分级梯度洗脱修饰的GCSF突变蛋白。保留在所述柱上的未修饰的GCSF突变蛋白用0.5M NaCl的平衡缓冲液分级洗脱。将所分离的GCSF突变蛋白-PEG缀合物的混合物用0.2μm滤膜除菌过滤，然后冷冻贮藏于-20℃。GCSF突变蛋白PEG缀合物的表征蛋白含量测定法采用1mg/ml溶液的A280值为0.86，测定所述纯化的GCSF突变蛋白PEG缀合物的蛋白浓度。SDS-PAGE分析按照Laemmli，Nature 227680-685，1970，采用12％和15％聚丙烯酰胺凝胶或8-16％聚丙烯酰胺梯度凝胶，在还原条件下，进行该分析。百分组成测定法根据考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的光密度测量，确定各种GCSF突变蛋白-PEG缀合物的反应混合物中的每种(单、二、三等)的百分组成(参见表2)。GCSF突变蛋白PEG缀合物中PEG质量的测定根据PEG的平均分子量，各个PEG缀合物(单、二等)的鉴定，基于电泳迁移率、所连接的PEG分子的数目、以及基于考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的光密度测量的百分组成，确定各种制备物中取代的PEG总质量。一种特定的制备物的PEG总质量是其各个PEG质量的总和。根据以下公式计算单个PEG质量PEG质量＝PEG分子量×PEG分子数×百分组成其中PEG分子量是5kDa、10kDa、20kDa等。
对于单、二、三，PEG分子数分别为＝1、2、3。
在PEG总质量测定中，也可采用质谱法(MALDI-TOF)。在该情况下，质谱可以鉴定并且确定单个PEG缀合物的分子量。与每个PEG缀合物连接的PEG分子量是单个PEG缀合物的总分子量减去GCSF突变蛋白的分子量(18.9kDa)。这些值乘以百分组成，得到单个PEG质量；它们的和是PEG总质量。
已经采用两种方法测定了各种制备物的PEG质量。结果概述于表2中。内毒素水平的测定采用LAL方法，按照生产商的说明(Associates of Cape Cod，Inc.，Woods Hople，Massachusetts)，测定内毒素水平。生物学活性如先前所描述的方法，对M-NFS-60细胞进行体外生物测定并且在雌性C57BL/6J小鼠中进行体内测定。(参见Asano等，Jpn.Pharmacol.Ther.(1991)192767-2773)。结果和讨论PEG化反应总的来讲，结果说明，活性较低的试剂例如脲连接物需要较高的pH、温度和蛋白试剂的摩尔比以及较长的反应时间，以获得所需量的缀合物(参见表1和表2)。从反应混合物中分离修饰的和游离的GCSF突变蛋白一个典型的洗脱图示于图4中。除阳离交换层析外，可能还需要其它步骤例如凝胶渗透层析以去除微量污染物和内毒素，并且对用于贮藏的终产物进行缓冲液交换。对于20kDa SPA(酰胺)和20kDa氨基甲酸乙酯缀合物，强阳离子交换分离法已经使其放大至30mg规模。用该方法获得大致定量的回收率。百分组成和PEG质量百分组成和PEG质量的结果概述于表2中。在我们的实验中，在高分子量PEG缀合物(例如20kDa SPA二PEG和12kDa GABA)的情况下，基于电泳迁移率以测定反应混合物的百分组成来鉴定PEG种类不是十分可靠。为了测定PEG质量，并且鉴定高分子量和高度取代的PEG缀合物，需要联合SDS-PAGE、SP-HPLC和MALDI-TOF MS分析法。然而，衍生自低分子量PEG试剂(例如，5kDa)的单PEG化和PEG缀合物可以十分准确地从其相应的SDS-PAGE分布图中鉴定出。内毒素水平采用LAL法，除衍生自氨基甲酸乙酯试剂的一种缀合物外，在所有PEG缀合物中都可检测＜1EU/mg的内毒素。在该PEG缀合物中，只在稀释后检测到内毒素。已经证实，这不是由于在稀释期间的污染引起，因此，在该样品中某些未知的物质可能在较高蛋白浓度下在所述LAL测定中引起了抑制。当稀释所述样品，并且在随后稀释抑制性物质时，观察阳性内毒素结果。生物学活性所有GCSF突变蛋白PEG缀合物的体外和体内生物学活性列于表2中。总的来讲，观察到在体外活性和取代的程度以及PEG的分子量之间成反比。相比之下，观察到随着取代的PEG分子量的增加，体内活性的增强。其它人也观察到该结果(Satako-Ishikawa等，Cell StructFunct.17(3)157-60，1992)。推测PEG分子与GCSF突变蛋白的多肽骨架的化学连接产生某些形式的负面影响受体/配体相互作用的构象变化，由此降低结合亲和性。另外，体外测定相对短的温育时间可能不足以达到最高活性。另一方面，注射所述药物后，小鼠的体内测定需更长的时间(天)，并且需数天才结束。这种较长温育时间结合所述PEG-GCSF突变蛋白循环半寿期的增加，代偿了由于PEG化引起的结合亲和性方面的损失。最终结果是达到体内最大生物活性。另一种假说是，当将PEG-GCSF突变蛋白注射到小鼠体内时，它作为前体药物起作用。在这种情况下，PEG-GCSF突变蛋白的PEG部分以某种方式不断地被切下，导致持续释放微量的游离GCSF突变蛋白，这解释了体内活性的维持和增强。然而，所述前体药物假说不能解释首次给药后7天所观察的体内基线活性。由于所述蛋白和PEG之间的酰胺键是稳定的并不容易被裂开，因此所述前体药物机制是不大可能的。
在所研究的15种GCSF突变蛋白PEG缀合物中，P-12GA-1、20kDaSPA、20kDa氨基甲酸乙酯和36kDa氨基甲酸乙酯的体内活性比其余的制备物的活性高得多。
总的来说，观察到PEG分子的分子量和体内活性增加之间成正比。该结果示于图5中，其中表示随酰胺(SPA)和脲连接的PEG缀合物中PEG总质量而变化的PMN计数的增加。GCSF突变蛋白PEG缀合物的选择和特征认真评价所述15种PEG缀合物中的缀合化学、生物学特性和药物开发之后，所选择进行进一步评价的3种缀合物是1)P-12GA-1，2)20kDa SPA和3)20kDa氨基甲酸乙酯。在头-头比较(head-to-headcomparsion)中，评价在SP-纯化的反应混合物中存在的20kDa SPA衍生的单、二和三PEG缀合物，表明所有三种缀合物在用25.2μg单剂的雌性C57BL/6J小鼠中保持高粒细胞生成活性达5天(表3和图4)。相比之下，保持相似活性需要每日多剂的未修饰的GCSF突变蛋白(数据未显示)。在除两种(20kDa SPA和P-12GA-1)外的所有情况下，在小鼠的初次给药后的第7天，体内活性均恢复到正常水平(图6)。20kDaSPA和P-12GA-1缀合物均在8.4μg较低剂量下表现出活性增加，并且在第7天恢复到正常水平(参见表3)。百分组成数据(表3)指出，20kDaSPA和P-12GA-1制备物均含有大约50％二聚体，而剩余的50％在单体和三聚体之间分布。20kDa氨基甲酸乙酯试剂在所用的实验条件下主要产生单-PEG(参见表3)。所评价的所有PEG缀合物(包括主要的单体氨基甲酸乙酯衍生物)的体外活性符合取代程度以及PEG分子量之间成反比的通用模式。显示所评价的PEG缀合物的体内生物学活性与所评价的分子量范围内的PEG分子量成正比(图5)。结论在所检查的15种GCSF突变蛋白PEG缀合物中，P-12GA-1、20kDaSPA和20kDa氨基甲酸乙酯连接物的制备物表现出良好的体内活性图。20kDa PEG-GCSF突变蛋白表现出包括工业生产价值在内的最佳总体特性。表1.用来制备各种PEG缀合物的反应条件
表2.各种PEG-GCSF突变蛋白缀合物的组成、PEG质量和生物学活性数据
基于考马斯蓝染色的SDS-PAGE的光密度测定法(*)，或根据MALDI TOF MAS分析(**)，计算百分组成和加入的PEG的质量。(a)、(b)、(c)每个代表一种独立的生物测定；报告第5天的PMN数据表3.三种主要分子的组成、PEG质量、PEG化位点和生物学活性数据
将8.4μg或25.2μg的或者ND-28日剂量或者单次剂量的PEG缀合物给予雌性C57BL/6J小鼠。在初次给药后的第5天和第7天，取静脉血样品，并且进行白细胞分类分析。*基于考马斯染色的SDS-PAGE的光密度测定。**根据MALDI TOF MS测定。
实施例2与rhG-CSF突变蛋白缀合的20kDa PEG的制备如下进行用20kDa甲氧基-PEG琥珀酰亚胺丙酸(SPA)对G-CSF突变蛋白的修饰。将PEG试剂溶于蒸馏水中，浓度约为200mg/ml，然后以摩尔比为4∶1-6∶1(过量的试剂)加到G-CSF突变蛋白溶液(约5mg/ml)中。让反应于4℃-8℃、pH约7.5下进行20小时。在反应结束时，加入冰醋酸终止反应。然后将PEG化的GCSF突变蛋白(也称为PEGG)从在修饰期间存在的残余的未修饰突变蛋白、过量的PEG试剂和其它杂质和缓冲液组分中纯化出来。除PEG化蛋白外，还产生作为反应副产物的N-羟基琥珀酰亚胺和聚乙二醇-羧酸。
采用阳离子交换层析，然后通过超滤法，对PEGG进行纯化。上样于阳离子交换柱，然后用20mM乙酸钠(pH 4.0)洗涤。用线性氯化钠梯度洗脱，将PEGG从反应混合物中的所有其它组分中分离出来。随后，用超滤法/渗滤法使PEGG浓缩至约4.0mg/ml，并且将缓冲液变为20mM乙酸钠、50mM氯化钠、pH 6.0。
采用阳离子交换层析，分析在以上所列的条件下进行的5轮PEG化和纯化，这证明了所述G-CSF突变蛋白PEG化反应的再现性。证明所述PEG化反应在以下最佳条件下在多轮反应中可再现，至多为2.5g(PEGG最终产量)20kDa-SPA-PEG突变蛋白的比率为4-6∶1；pH约7.5，4℃，20小时。所测定的PEGG混合物的平均百分组成为21.7％单-PEGG(％RSD＝16.6)，60.3％二-PEGG(％RSD＝6.6)，15.1％三-PEGG(％RSD＝4.0)和2.9％四-PEGG(％RSD＝26.1)，如表4中所示。表4阳离子交换分析5轮PEGG合成和纯化中的单、二、三和四-PEGG的相对百分组成
实施例3外周血干细胞的转移已经开发出从骨髓转移原始干细胞和定向前体细胞并且在外周血中增多循环祖细胞的技术。这些受激细胞可能能够介导致死照射以及骨髓或干细胞移植后的早期和持续移入。Neben，S.Marcus，K和Mauch，P给予环磷酰胺和/或粒细胞集落刺激因子后小鼠的造血干细胞和祖细胞亚群从骨髓转移至血液。Blood 811960(1993)。外周血干细胞(PBSC)的募集可能有助于缩短化学疗法诱发的骨髓减少症患者或经历其它重度骨髓抑制治疗的那些患者造血功能恢复的时间。Roberts，AW和Metcalf，D粒细胞集落刺激因子诱导小鼠外周血中祖细胞的选择性升高。Experimental Hematology 221156(1994)。已经用生长因子和化疗药物刺激转移。Bodine，D外周血“干”细胞的转移有烟的地方就有火？Experimental Hematology 23293(1995)。刺激PBSC后，通过白细胞提取法收获转移的细胞，然后低温保存直到需要它们为止。目前临床方案要求在标准高剂量化疗(CHT)和每日重复给予或连续输注生长因子(有时持续2周或更长)后，通过白细胞提取法重复收集PBSC浓缩物。Brugger，W，Bross，K，Frisch，J，Dern，P，Weber，B，Mertelsmann，R和Kanz，L用依托泊苷、异环磷酰胺和顺铂的综合化学疗法后，通过依次给予白细胞介素-3和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子转移外周血祖细胞。Blood 791193(1992)。用两种PBSC转移的小鼠模型，第一种在正常小鼠中，第二种在化疗模型中，进行下文所描述的研究。所述实验证明，与NEUPOGEN(G-CSF)比较，按照本发明的PEG化的G-CSF突变蛋白(PEGG)，实现干细胞转移的效能增加。也明确地确立了PEG化突变蛋白在显著减少且更有效的给药方案方面的优越性。
这些研究评价在7天琼脂集落测定中用多种生长因子体外刺激的转移的未成熟鼠PBSC的扩增能力。除集落形成能力外，还对所有小鼠的血液进行完全的血液学分布型加上绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)的评价。还测定血清G-CSF水平。对测定最优化后，进行数个时程实验，并且检查高剂量和低剂量的G-CSF。实验模型包括G-CSF诱导的和环磷酰胺(Cytoxan)诱导的转移，以及采用CHT和所述细胞因子的联合治疗。
材料和方法在所有实验中使用购自Jackson Laboratory的6-10周龄的雌性C57BL/6J小鼠。在第-1天用或者200mg/kg Cytoxan或者磷酸缓冲盐水(PBS)载体，对所述小鼠进行腹膜内注射。在第0天，给所述动物皮下注射0.1ml的或者NEUPOGEN(GCSF)、PEGG(20kDSPA连接的PEG化突变蛋白，Lot #P20W3)或者含1％正常小鼠血清的PBS载体。接受Neupogen的小鼠每天给予相同剂量的注射，而所有其它小鼠接受载体。在处死的当天，从麻醉小鼠的眶后窦收集外周血，放入含有EDTA的试管中。对于每组动物，将少量合并的全血加入到三个复份的35mm2组织培养皿中，所述培养皿装有补充15％胎牛血清和0.35％和0.35％Difco琼脂、含有1000U/ml重组小鼠(rm)白细胞介素3、100ng/ml rm干细胞因子和1000U/ml rm白细胞介素6的总量为1ml RPMI 1640培养基。将固化的琼脂培养物于37℃、在湿润的5％CO2的空气氛围下温育1周。在暗视野照明下，使用立体解剖显微镜对集落进行计数。
结果在第一项的所示研究中，正常小鼠在第0-5天每天接受注射25μg/只小鼠NEUPOGEN，或者在第0天接受单次注射25μg/只小鼠PEGG。在第3-7天处死小鼠。如图7中所示，通过集落形成证明的转移在第3天和第4天在注射NEUPOGEN的小鼠中显著增加，但在第5天开始逐渐回到基线水平(尽管NEUPOGEN注射持续到第5天)。另一方面，用PEGG注射的小鼠显示出更加高度评价的集落数目，所述集落数目的稳定水平保持到第7天。
化疗模型的变化形式(paradigm)是相似的。CHT组的小鼠在第1天接受一剂Cytoxan的注射。然后某些小鼠在以后日子里只接受载体注射，同时其它小鼠或者在第0-5天接受每天注射NEUPOGEN的联合治疗，或者在第0天接受单次注射PEGG。图8显示在第4天Cytoxan治疗的小鼠的一个峰值，在以后的日子逐渐回到基线水平。NEUPOGEN和PEGG组均在第5天达到峰值，证明集落数目显著升高。然而，直至第6天和第7天Cytoxan+PEGG值保持非常显著地高于Cytoxan+NEUPOGEN组的那些值。图9证明联合治疗的协同效应优于Cytoxan或G-CSF单独治疗的效应。
第二项研究示于图10和图11中。连续10天每天接受注射较低的3μg/只小鼠NEUPOGEN剂量的正常小鼠在所检查的全部时程中，表现出相对低水平的“多阶段(phase)”转移。用单次3μg/只小鼠PEGG剂量注射的动物表现出到第4天为止外周循环中大约5倍的转移的祖细胞数目，虽然所述作用是必需在6天内的一次爆发。
在注射Cytoxan的小鼠中，3μg/只小鼠PEGG的单剂量诱发的PBSC转移量与注射30μg NEUPOGEN/只小鼠(日剂量为3μg/天，连续10天)诱发的量大致相同(图11)。在第5天两组的祖细胞转移达到峰值，并且所述峰的大小相同。看来唯一的区别是NEUPOGEN的延续效应略微长久。在CHT模型中集落的数目比正常小鼠模型中集落的数目高4-10倍。
这些实验证明了PEG化突变蛋白优于NEUPOGEN的两种独特的潜在优势。首先，在正常小鼠和化学疗法治疗的小鼠中，在诱发PBSC转移的能力方面，显然PEGG比NEUPOGEN的效力高。其次，已经显示采用比所述临床制品目前使用的给药方案剂量减少且更为有效的给药方案，在小鼠中所述PEG化突变蛋白比NEUPOGEN更为有效。
权利要求
1.一种具有下式的生理学活性缀合物 其中G是一种粒细胞集落刺激因子，并且其与所述缀合物中的一个聚乙二醇部分形成一个酰胺键的氨基较少；R为低碳烷基；n为420-550的整数；而m为1-5的整数。
2.权利要求1的缀合物，其中R为甲基。
3.权利要求2的缀合物，其中n为450-490。
4.权利要求2的缀合物，其中m为1-4的整数。
5.权利要求4的缀合物，其中m为2。
6.权利要求1的缀合物，其中所述粒细胞集落刺激因子是具有图1中所示序列的GCSF突变蛋白。
7.权利要求1的缀合物，其中n为450-490。
8.权利要求1的缀合物，其中m为1-4的整数。
9.权利要求8的缀合物，其中m为2。
10.权利要求1的缀合物，其中所述粒细胞集落刺激因子是具有图1中所示序列的GCSF突变蛋白。
11.权利要求1的缀合物，它比相应的未缀合的粒细胞集落刺激因子的循环半寿期更长和体内粒细胞生成活性更高。
12.权利要求11的缀合物，其中所述粒细胞集落刺激因子是具有图1中所示序列的GCSF突变蛋白。
13.一种具有下式的生理学活性缀合物 其中R为甲基；n为450-490的整数；m为2；而G为具有图1中所示序列的GCSF突变蛋白，并且其与所述缀合物中的一个聚乙二醇部分形成一个酰胺键的氨基较少。
14.一种包含多种具有下式的生理学活性缀合物的组合物 其中在每种所述缀合物中G为粒细胞集落刺激因子，并且其与所述缀合物中的一个聚乙二醇部分形成一个酰胺键的氨基较少；在每种所述缀合物中的R独立地为低级烷基；在每种所述缀合物中的n独立地为420-550的整数；在每种所述缀合物中m独立地为1-4的整数；其中m为1的缀合物的百分比为18％-25％；其中m为2的缀合物的百分比为50％-66％；其中m为3的缀合物的百分比为12％-16％；而其中m为4的缀合物的百分比至多为5％。
15.权利要求14的组合物，其中在每种所述缀合物中R为甲基。
16.权利要求14的组合物，其中在每种所述缀合物中n和R相同。
17.权利要求14的组合物，其中n为450-490。
18.权利要求14的组合物，其中在每种所述缀合物中所述粒细胞集落刺激因子是具有图1中所示序列的GCSF突变蛋白。
19.一种包含多种具有下式的生理学活性缀合物的组合物 其中R为甲基；在每种所述缀合物中的n相同并且为450-490的整数；G为具有图1中所示序列的GCSF突变蛋白，并且其与所述缀合物中的一个聚乙二醇部分形成一个酰胺键的氨基较少；在每种所述缀合物中m独立地为1-4的整数；其中m为1的缀合物的百分比为18％-25％；其中m为2的缀合物的百分比为50％-66％；其中m为3的缀合物的百分比为12％-16％；而其中m为4的缀合物的百分比至多为5％。
20.一种产生PEG-GCSF缀合物的方法，所述PEG-GCSF缀合物比相应的未缀合的GCSF的循环半寿期更长并且体内粒细胞生成活性更高，所述方法包括将一种具有下式的试剂与所述GCSF共价连接，以产生所述缀合物
21.权利要求21的方法，其中所述GCSF是具有图1中所示序列的GCSF突变蛋白。
全文摘要
本发明描述了具有式(I)的生理学活性PEG－GCSF缀合物,以及含有各种缀合物的混合物的组合物,其中在所述组合物中对于所述缀合物m和n可以为不同的整数。
文档编号C08G65/333GK1376164SQ00809241
公开日2002年10月23日 申请日期2000年1月19日 优先权日1999年1月29日
发明者P·S·拜伦 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司