专利名称：缀合物制备的改进或与缀合物制备相关的改进的制作方法
技术领域：
本发明涉及间接标记分子的方法、在所述方法中使用的试剂和试剂盒以及由所述
方法产生的缀合物。
背景技术：
在生物科学研究、诊断学和医学的所有领域都存在用标记物缀合生物分子的需 要。与生物分子连接的标记物包括蛋白质(如酶、荧光蛋白、链霉亲和素)、寡核苷酸和 通常分子量小于1000的小分子配体(SMLs ;单数为SML)(如生物素、荧光染料、金属离子 螯合剂、光反应基团、可碘化分子、光敏剂、猝灭剂、短肽和药物)。用于缀合反应中的SML 通常(但并非总是)具有促使所述SML与所述生物分子连接的反应性(通常是胺反应 (amine-reactive)[AR])基团。例如，荧光素的引入通常是使用异硫氰酸酯衍生物(FITC ; 异硫氰酸荧光素)或N-羟基马来酰亚胺(NHS)衍生物。 在缀合反应中使用的大多数活性SML是NHS酯，其具备许多有吸引力的特征，如在 生理pH值易于与胺偶联。该偶联生成既强又不可逆转的酰胺键。不利的是，NHS酯在存储 中容易分解，特别是如果有水分混入产物，则它们很容易在水溶液中水解。由于SML的反应 部分是单价的，因而任何反应基团的损失都会减少可以参与缀合反应的SML比例。由于在 存储时可能分解和竞争水解反应， 一般使用显著摩尔过量的SML。由于很多生物分子含有大 量胺官能团，因而通常用不同摩尔比和/或不同的反应时间来进行小规模的试验，以优化 条件和避免过度标记。最后，由于需要使用显著过量的SML，最终产物难免受到大量非缀合 SML和/或水解产物的污染，因而需要对缀合物进行纯化。 另一种化学试剂可避免使用NHS酯所遇到的一些问题，其涉及巯基介导的分子缀 合。巯基反应性(TR)SML相对稳定，但由于其工业效用较为有限，而且因为许多生物分子本 身缺少游离的巯基，所以在缀合反应中不太经常使用TR-SML。虽然在生物分子中引入巯基 的方法是众所周知的，但加入巯基的操作往往使得缀合过程在技术上更为复杂。在市售的 SML中发现的与巯基反应的官能团包括马来酰亚胺、碘乙酰基、溴乙酰基、氮异环丙烷、环 氧基、丙烯酰基和巯基_ 二硫键互换剂(如吡啶二硫化物)。 本发明尤其涉及制备缀合物的方法，所述方法能避免至少一些与反应性SML(特
别是NHS酯)和那些反应官能团为单价的其它SML相关的问题。这些方法将在下文中更详
细地描述。 发明简述 通常在本发明中，在合适条件下，使一种、两种或更多种反应性SML各以有限量与 具有多个亲核基团的大支架分子溶液接触。这些基团可能是同一类型或是多种类型。在摩 尔量方面，所述亲核基团大大地超过SML，因此只有一部分亲核基团会发生反应。然后，余下 的基团与在多个位点发生反应的另一种分子("激活剂")接触，以使显著数量的巯基反应 性(TR)官能团连接到所述支架上。所产生的活性SML-支架缀合物平均包含O-n个SML(其 中n > 0)，并具有多价TR官能团。通过脱盐或透析纯化多TR支架，然后在接近生理pH值 且在2-亚氨基硫杂环戊烷存在下，将该多TR支架与具有胺官能性的分子或生物分子(如
5抗体)连接。2-亚氨基硫杂环戊烷在需要有效缀合至所述支架的生物分子上原位产生巯基 官能团(参见W02007/068906)。 在第一个方面，本发明提供了用于将小分子配体间接缀合到欲用该配体标记的分 子上的方法，所述方法包括以下步骤 使连接有至少一个小分子配体的支架分子与所述待标记的分子接触，所述支架 分子具有至少一个基团能与所述待标记分子上存在或原位形成的接收部分(receiver moiety)发生反应，以在所述支架分子和所述待标记分子之间成键，从而将该小分子配体与 所述待标记分子间接偶联。所述小分子配体、支架和待标记分子的连接组合可被统称为"缀 合物"。 所述支架分子优选包含多个能与所述待标记分子上存在或原位形成的接收部分 发生反应的基团。在优选的实施方案中，所述支架分子包含一个或多个(优选多个)巯基 反应性("TR")基团，这些基团能与所述待标记分子上存在或原位形成的巯基接收部分发 生反应。 在优选的实施方案中，通过巯基产生剂(thiol generator，"TG")作用在待标记分 子形成巯基接收部分，该巯基产生剂含有至少一个硫原子并与待标记分子发生反应，以在 该分子上产生共价连接的硫氢基即巯基，所述硫氢基包含由巯基产生剂贡献的硫原子。该 巯基化反应通常涉及亲核基团(例如胺(尤其是伯胺)或羟基)的巯基化作用。最合宜的 是采用W0 2007/068906中介绍的技术在原位进行待标记分子的巯基化。优选的TG是2-亚 氨基硫杂环戊烷(2-IT)(也被称为Traut试剂)，它可与例如多肽中存在的胺(待被间接标 记的分子通常包含胺)发生反应。2-IT能完全溶于水，并在pH值7到10的范围内与伯胺 发生反应。在传统的缀合物形成反应中，2-IT在约pH 8下使用，在该条件下2-IT高效和迅 速地与伯胺(例如存在于肽、多肽和蛋白质中的赖氨酸残基中的伯胺)发生反应。对于与 伯胺的反应，现已发现优选在低于常规值8的pH下使2-IT反应。因此，当使用2-IT时，缀 合反应优选在以下pH值下进行小于pH 8，优选小于pH 7.8，更优选小于pH 7.7。优选的 pH值范围为7.0-7.5。由于巯基与许多类型的巯基反应性基团的反应在pH 6.5至pH7.5 间有效进行，所以在高PH值下使用2-IT是不合乎需要的，在高pH值下竞争性水解反应会 产生不需要的游离巯基。此外，巯基反应性基团还可在碱性PH下被水解，或可表现出对巯 基的选择性减少，这种情况会在常见的马来酰亚胺官能团中出现。 用于巯基化步骤的合适缓冲组分是磷酸盐缓冲剂，特别是磷酸钠、N(2-羟乙基) 哌嗪基-N' - (2-乙磺酸)(HEPES) 、2-吗啉代乙磺酸(MES) 、3- (N-吗啉代)丙磺酸(M0PS)、 碳酸氢盐和其它缓冲剂，这些缓冲剂不与巯基产生剂发生反应，或与TG同待标记分子上的 官能团的反应速率比较，其反应相对缓慢。因此所列举的缓冲剂中可能包括以适当缓慢的 速率反应的含胺缓冲剂。 最后的缀合反应混合液中的其它组分可包括盐(如NaCl)和其它无机或有机组 分，它们不直接参与反应，但提供使组分稳定的合适环境，或以一些其它方式促进所需的反 应，或尽量减少损失如在容器表面上的损失。 由于TG具有反应性，所以它可与缀合混合物中其它亲核试剂发生反应。虽然水是 弱亲核试剂，但它通常以高浓度存在，因此水解反应可增加没有与待标记分子共价连接的 巯基的浓度，特别是在pH值显著高于pH 7时。
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优选地，TG包括很少或根本没有游离巯基，适宜水平是低于5%摩尔，优选低于 3%摩尔，更优选低于1%摩尔。 商业来源的2-IT可含有大量游离巯基，在存储一段时间后也可产生游离巯基。游 离巯基可与待标记分子上形成的巯基竞争支架上的巯基反应性基团，从而降低缀合效率。 在2-亚氨基硫杂环戊烷的情况中，一个供应商标明其游离巯基的污染为"至多5%"。本文 所述工作中使用批次被测定出巯基含量约为1%摩尔。 优选仔细选择反应物的摩尔比，以使可能存在于TG中的少量游离巯基不会显著 影响缀合效率。 2-IT比用来引入巯基或保护巯基的大多数其它分子更稳定，因此不需要使用大量 的摩尔过量。 一些含NHS基团的胺反应性异双功能性试剂在水溶液中的半衰期较短，需使 用大量过量以补偿迅速水解。通常是按合理过量来使用TG，如相对于待标记分子上存在的 有关化学功能性(如胺)的IO倍摩尔过量，以保证所有分子均被巯基化。然而，在选择合 适的TG浓度时，使用者必须考虑可能的反应速率，溶液的pH会对其产生影响。在固定pH 值下的TG适宜浓度很容易通过检测不同TG浓度对所产生的缀合物性能的作用来确定。优 选的是，反应条件使待间接标记的分子被有效巯基化，但避免过度巯基化以免损害所述分 子的任何生物活性。同样，也不应该使过量的支架分子与待间接标记分子连接，否则可能会 导致次优的缀合物性能。支架分子通常以适度过量存在，例如相对于待间接标记分子达到 约5倍摩尔过量，但最佳摩尔比可取决于缀合物的具体应用。通过用例如低、中、高的比例 进行初步试验反应，然后再通过试验和误差"微调"所述比例，可以容易地确定用于任何特 定缀合物的最佳反应物比例。 所述支架分子优选包含多个能与所述待标记分子上存在或形成的接收部分起反 应的反应基团。这些基团可自始就存在于支架分子中，或可作为本发明方法的一部分被引 入到支架分子中。合宜地，所述支架分子包含多个能与所述小分子配体上存在的官能团发 生反应的反应基团。跟小分子配体起反应的反应基团与跟述待标记分子上存在或形成的接 收部分起反应的反应基团可为同一类型或不同类型。 在优选的实施方案中，所述支架分子包含多个亲核基团。在优选的实施方案中，所 述支架分子包含多个胺基，其可以与"激活"剂反应(见下面更详细的解释)以引入巯基反 应性基团。在优选的实施方案中，在与所述小分子配体偶联之前，所述支架分子的分子量为 至少5kD，更优选为至少10kD，最优选为至少20KD。 在优选的实施方案中，所述支架包括聚合物，其为是自然存在的或人工制造的。在 优选的实施方案中，所述聚合物具有多个亲核基团(或可经过改性以使其包含所需数量和 类型的亲核基团)。支架可具有单一类型的亲核基团或可具有多样性的亲核基团，如通常在 一些天然生物分子(如蛋白质)中存在的亲核基团。 优选的聚合物包括多肽、胺化葡聚糖或衍生性(如胺化)葡聚糖、巯基化聚合物、 活性聚乙二醇、树状大分子、活性珠、纳米粒子或其它粒子。特别优选的聚合物是多肽(即 氨基酸多聚体)，多肽是引人注目的，因为其具有大量的和多样的官能团(胺基、羧基、酚基 (phenolate))，为连接SML和其它分子提供了选择多样性。在一些实施方案中，卵清蛋白是 优选的，因为(i)其在匿S0中的溶解度非常高，这使得与疏水SML的NHS酯的反应可以在 水/有机混合物中进行而不出现SML或卵清蛋白的沉淀；和(ii)其具有最佳或接近最佳数
7目的可用于反应的游离外露基团(online group)。另一特别优选的支架是葡聚糖或葡聚糖 衍生物(如胺化葡聚糖)，因为其能容易地被引入合适的官能团以及其具有广范围的可利 用的大小。就本文而言，"葡聚糖衍生物"是指这样的葡聚糖分子，其中聚合物中的一些(但 通常不是所有)侧链已被其它部分(如胺基或烷氧基等等)所取代。 所述小分子配体可合宜地选自荧光团、发色团、生物素、抗生物素蛋白、金属离子 螯合剂、光反应基团、可碘化部分、光敏剂、猝灭剂、肽和低分子量药物。特别地，可使用的 SML反应性形式包括NHS酯、异硫氰酸酯、三嗪、磺酰氯、酰叠氮、卤代芳烃、醛类、四氟苯基 酯、亚氨基酯、马来酰亚胺、卤代乙酰基衍生物和酰肼。以上列举并非旨在限制，而是可使用 能与合适支架偶联的带其它官能团(如伯胺)的任何SML。优选SML包含荧光染料。合适 的荧光染料和其他分子选自(这样的列举也不是为了限制)5(和6)-羧基荧光素、5(和 6)-羧基罗丹明110、5(和6)-羧基罗丹明6G、5(和6)-羧基四甲基罗丹明、5(和6)-羧 基-X-罗丹明、5-羧基荧光素(5-FAM) 、 5-羧基罗丹明110 、 5-羧基罗丹明6G、 5-羧基四甲基 罗丹明、5_羧基-X-罗丹明、6-((7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰基)氨基)己酸、6-(荧 光素-5_甲酰胺基)己酸、6-羧基-2"，4，4"，5"，7，7"-六氯荧光素、6-羧基-4"，5"-二 氯-2"，7"-二甲氧基荧光素(J0E)、6-羧基荧光素(6-FAM)、6-羧基罗丹明110、6_羧基 罗丹明6G、6-羧基四甲基罗丹明、6-羧基-X-罗丹明、7-羟基香豆素-3-羧酸、7-甲氧基 香豆素、Alexa Fluor 350、 Alexa Fluor 405、 Alexa Fluor430、 Alexa Fluor 488、 Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AMCA(7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸)、 ATTO 390、ATT0 425、ATT0 465、ATT0 488、ATT0 495、ATT0 520、ATT0 532、ATT0 550、ATT0 565、ATT0 590、ATT0 594、ATT0 610、ATT0 611X、ATT0 620、ATT0 633、ATT0 635、ATT0637、 ATTO 647、ATT0 647N、 ATTO 655、ATT0 680、ATT0 700、ATT0 725、ATT0 740、 Bodipy染料、 Cascade蓝、Cascade黄、Chromeo488、 Chromeo 494、Chromeo 546、Chromeo 642、双Cy2、单 Cy3、单Cy3. 5、单Cy5、单Cy5. 5、单Cy7、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 549、DyLight 649、 DyLight 680、 DyLight 800、荧光素、肌yteFl丽488、肌yte Fluor 555、肌yte Fluor 647、肌yte Fluor 680、肌yteFluor 750、 IRDye 700DX、 IRDye 800CW、 IRDye 800RS、 Uicifer黄、Marina蓝、Oregon绿488、 Pacific蓝、Pacific橙、PF_415、 PF_488、 PF-488-LSS、 PF-500-LSS、 PF_505、 PF-510-LSS、 PF_514_LSS、 PF-520-LSS、 PF_546、 PF_555、 PF-590 、 PF-610 、 PF-633 、 PF-647 、 PF-680 、 PF-700 、 PF-750 、 PF-780 、 PURETME 14 、 PURETME 20、PURETME 22、PURETME 325、芘(及相关类似物)、罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹 明B(Lissamine罗丹明)、四甲基罗丹明。其它有用的SML包括生物素、生物素的长链类 似物、亚氨基生物素和螯合剂如N「(对-异硫氰酸酯基苄基)_ 二亚乙基三胺N2， N3， N3-四乙酸(DTTA)。 虽然将SML连接到支架会大大增加SML的有效分子量(通常增至100倍或更多)， 但通常并不用大的生物分子来进行结合反应。例如，在免疫诊断学领域最常用的标记物之 一是辣根过氧化物酶(HRP)，其大小类似于卵清蛋白支架(40， 000对比46， 000)。其它常用 的高分子量标记物包括别藻蓝蛋白(分子量105， 000)、碱性磷酸酶(分子量=160000)和 藻红蛋白(分子量=240,000)。已证明巯基化学试剂对这些反应特别有用，所述标记物首先用TR基团(通常是马来酰亚胺)修饰，其它的生物分子被修饰以引入游离巯基。
本文所用术语"巯基反应性"和"胺反应性"旨在分别指定在适当条件下与巯基 (-SH)或胺基(特别是伯胺基团_NH2)发生反应的部分或者尤其是化学基团。应该注意的 是，"巯基反应性"基团不一定只与巯基反应，而"胺反应性"基团不一定只与胺基反应。具 体而言，化学基团可能既是"巯基反应性"又是"胺反应性"化学基团，但它可能会例如根据 当时的pH值或其它环境因素而表现出一种反应性比另一种反应性更强的趋势。
在优选的实施方案中，使用异双功能性激活剂以将巯基反应性基团引入到所述支 架分子中。合宜的是，所述支架分子包含多个可与激活剂反应的胺基。胺反应性和巯基反 应性异双功能性试剂的实例包括3-(2吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺(SPDP);具有长 间隔物的SPDP变体(LC-SPDP ;LC ="长链")和具有增加水溶性的磺基的SPDP变体(磺 基-LC-SPDP);琥珀酰亚胺基氧基羰基-a -甲基-a - (2-妣啶基二硫基)甲苯(SMPT);磺 基-LC-SMPT ;4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺(SMCC);磺基-SMCC ; 间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS);磺基-MBS ; (4-碘乙酰基)氨基 苯甲酸N-琥珀酰亚胺(SIAB);磺基-SIAB;4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺 (SMBP);磺基-SMBP ;N-( y -马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBS);磺基-GMBS ; 6-((碘乙酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺(SIAX)及其长间隔物形式SIAXX ;4-(((碘乙酰基) 氨基)甲基)环己烷-l-甲酸琥珀酰亚胺(SIAC)以及其长间隔物形式(SIACX);碘乙酸对 硝基苯酯(NPIA)。还有许多其它相关实例，如羰基和硫氢基反应性接头、!3-马来酰亚胺基 丙酰肼(BMPH)。 待间接标记的分子可为任何感兴趣的分子，但通常是相当大的(分子量为至少 25kD，更通常为至少35kD，最通常为至少45kD)。具体而言，待间接标记的分子常常包括多 肽例如酶、或结构蛋白、受体或细胞表面标志、或抗体或其抗原结合片段或变体(如Fv、Fab、 scFv、单结构域抗体、双特异性抗体或嵌合抗体等)。 本发明方法中的一个、两个或更多个步骤(通常是所有步骤)是用溶液中的一种 或多种试剂(通常是所有试剂)来进行。所述溶液可为完全水溶液(即该溶液中水是基本 上唯一的溶剂)，或可为部分水溶液(即该溶液中可存在一种或多种其它溶剂)，或为完全 有机溶液(即该溶液中基本上唯一的溶剂不是水)。优选所述溶液是完全或部分水溶液。 特别合宜是包含任何所需比例的水和匿S0的溶液。特别地，所述配体、待间接标记的分子 和支架分子各自优选在溶液中是游离的，而不是以固相存在或被固定在支持体上等等。这 将赋予最佳的反应动力学。 在第二个方面，本发明提供用于本发明第一个方面方法的支架分子，所述支架包 含一个或多个被连接的小分子配体和一个或多个能与所述待标记分子上存在或原位形成 的接收部分发生反应的基团。 小分子配体可共价(这通常是优选的)或非共价地连接到支架上。如果需要，可 有两个或更多个不同类型的小分子配体连接到所述支架(例如两种不同的荧光团；或一种 类型的荧光团和生物素和/或链霉亲和素等)。 支架适宜包含多个能与接收部分(优选其本身在待标记的分子上大量存在或形 成)反应的基团。 支架分子通常处于"激活"状态，即已接触了激活剂以引入所需的反应基团，因此，
9所述支架分子可通常包含因与激活剂(如SMCC等等)反应而被引入的基团。 在与小分子配体连接和/或被激活后，可将支架分子从低分子量物质(包括未反
应的SML或其水解产物)中分离出来，如果需要，将其换到缓冲液中，所述缓冲液是更适用
于随后的缀合反应或支架的暂时储存或长期储存。所述交换和/或分离步骤可以通过那些
本领域技术人员已知的技术来实现，最适宜的方法通常(至少部分)依赖于合成的规模。本
发明人已发现，采用市售脱盐柱的分离方法是适当的(例如来自GEHealthcare的S印hadex
G-25 "NAP-5"柱或"PDI0"柱)。对更大规模(> 100毫克支架)，可用水合S印hadex
G-25(可单独作为干粉使用)填装具有增加容量的空玻璃柱或聚丙烯柱。 在与SML连接和/或被激活后，可合宜地以冻结或冷冻干燥形式提供支架分子用
于贮存目的，通常是以约50 iU至约5ml，优选为约100 iU至2ml的等份。合宜的是，所述
支架分子被作为试剂盒的一部分来提供，该试剂盒适用于并被指定用于实施本发明方法。 优选的支架分子包括卵清蛋白。所述支架分子优选包含已知的预定平均数目的被
连接的小分子配体。除此以外或作为选择，所述支架分子可包含已知的预定平均数目的反
应基团(优选是巯基反应性基团)/分子，所述反应基团可用于与待标记分子上的接收部分
发生反应。 另一种优选的支架分子是葡聚糖，它可以很容易地转换为能与AR-SML反应的胺 衍生物。此外，分子的大小可根据需要来改变(1000-2， 000， 000道尔顿范围内的葡聚糖是 市售的)，这为改变SML/支架分子的数目提供了相当大的范围，而不必改变标记密度。这对 于一些荧光SML而言具有相当大的益处，因为如果所述荧光SML被引入到接近的邻近位置 时，它们可能会猝灭(见下文)。 用于本发明的葡聚糖通常为40， 000道尔顿或更大。假设葡聚糖呈球状的话，那么 伴随体积(分子大小)改变的半径/表面积变化可容易地用标准数学公式来确定。例如， 通过由150kDa葡聚糖转换成450kDa葡聚糖可以实现表面积增至2倍；由40kDa葡聚糖转 换成500kDa葡聚糖可以使表面积增至5倍。当需要对待标记的生物分子进行单点连接时， 由上述缘由可明显推知较大的葡聚糖可用于引入更多SML。 为了在本发明方法中使用，所述支架分子优选存在于溶液中，所述溶液为完全水
溶液或部分水溶液，并且通常包含适宜的缓冲剂。在与SML的反应中，溶液优选是相对浓
縮，浓度为至少10mg/m，更优选为至少20mg/ml，最优选为40mg/ml或更高。 在第三个方面，本发明提供用于实施本发明方法的试剂盒。该试剂盒包含上文界
定和/或所述的支架分子，和用于实施本发明方法的说明。该试剂盒可优选包含2-巯基产
生剂，如2-亚氨基硫杂环戊烷，和/或一种或多种缓冲剂。试剂盒的一种或多种试剂组分
可以按冷冻干燥的形式提供。该试剂盒可任选包含一种或多种下述组分一种或多种小分
子配体；一种或多种激活支架分子的激活剂；以及一种或多种待标记的分子。
在第四个方面，本发明提供一种缀合物，所述缀合物包含间接标记的分子、与所
述间接标记的分子连接的至少一个支架分子和与所述支架分子连接的至少一个小分子配
体标记物。有利的是，所述缀合物由本发明第一个方面的方法制备。 优选但非必须，所述至少一个小分子配体与支架分子共价连接。优选但非必须，所 述支架分子与间接标记的分子共价连接。优选所述小分子配体、支架分子和间接标记的分 子均如前文所界定和描述。特别地，所述支架分子优选包括卵清蛋白或胺基葡聚糖。
在一个实施方案中，本发明提供包含间接标记分子的缀合物，所述分子与多个支 架分子连接，各支架分子又与至少一个小分子配体连接。 在另一个实施方案中，本发明提供包含间接标记分子的缀合物，所述分子与单个 支架分子连接，该支架分子与多个小分子配体(可能是相同或不同的)连接。
在优选的实施方案中，小分子配体在其结合支架分子的能力方面是单价的。
本发明的一个特征在于，可用预先确定和预先优化数目的被连接的SML来合成支 架(尤其是巯基反应性支架)，然后作为整体与待标记的生物分子连接。这样，本发明方法 使得可以精确控制标记物(或配体)与待标记分子的比例、标记的绝对数量以及标记密度 和分布。有利的是，通过支架中间体掺入SML比用单价反应性SML直接标记生物分子更容 易控制，这是因为(i)支架与生物分子的摩尔比相对较低，和(ii)位阻因素起到限制可物 理连接的支架分子数目的作用。这种生物缀合的方法确保标记密度更具可预测性，并很容 易避免过度标记或猝灭(在荧光SML的情况中)。("猝灭"是多个荧光部分处于相近的邻 近位置并干扰彼此荧光的现象)。在大多数情况下，没有必要纯化最后的缀合物，这是因为 不需要使用大量过量的多TR支架，因为TR基团比典型的NHS酯更稳定，并且因为官能团的 冗余意味着TR官能团的水解不一定会阻止支架的连接。 所述支架方法还使得在缀合物设计和优化方面有相当大的灵活性。例如，三个支 架分子(各荷有一个SML)与抗体的连接将总共引入3个SML。同样地，一个荷有3个SML 的支架分子的连接将引入相同数量的SML。然而，所述缀合物显然在分子水平上并不等同， 并且特定类型缀合物的性能优势可在某些测定情况下表现出来。针对特定应用的优化可能 包括例如，制备具有低、中、高SML密度的三种支架，并与三种浓度的待标记生物分子缀合， 得到9种类型的缀合物。然后基于特定免疫测定中的性能选定最佳的缀合物。
在涉及抗原结合后接洗涤步骤的免疫测定中，在抗体缀合物中少量未缀合支架的 存在是没有多大意义的，因为过量的标记物将会被洗去。但是，如果未缀合支架的存在被认 为是有问题的，则可以选择抗体/支架的摩尔比以尽量减少游离支架的浓度。在这些情况 下相对高密度的SML/支架可能也是有利的，但受到对可能应用的标记密度的任何限制(例 如该密度可能受到猝灭效应或容纳后来结合在支架上的其它分子的需要所限制)。
在支架与生物素(在缀合反应中经常使用的SML)连接的情况下，有两种可能的应 用。在第一种中，生物素化的支架与结合实体(如抗体)缀合，然后后者与抗原非共价结 合。在洗去过量的生物素_支架_抗体缀合物后，生物素配体用于募集掺入了可以很容易 被测量的标记(如HRP)的链霉亲和素缀合物。生物素和链霉亲和素分子通常以这种方式 使用来建立使分子非共价地连接的联系(bridge)。在这种测定类型中，任何未缀合的生物 素_支架在洗涤步骤中被除去，对最后的测定不造成任何影响。 在第二种应用中，生物素化缀合物的生物素组分用于使该缀合物定位在链霉亲和 素所连接的表面上。在这种应用类型中，少量未缀合的生物素支架可与生物素_支架_抗 体缀合物竞争结合固定化的链霉亲和素，从而减少表面捕获的缀合物数量。这可能被预期 导致测定的灵敏度降低。然而，本发明的方法使得可迅速制得缀合物并使其适用于特定应 用而一般无需洗涤步骤。 通过建立一系列与一种(或多于一种)类型SML连接的多TR支架，所述支架方法 使得能够充分利用到全范围的市售AR-SML(主要是NHS激活的SML)。由于任何类别的反应性SML(例如NHS酯类别)中的所有成员都显示基本上相同的反应性，因此本发明方法可以
适用于该类别中的任一成员。与许多AR-SML不同的是，SML修饰的支架上的TR官能团是
相对稳定的，可长期以冷冻干燥形式储存而不必担心其活性功能的过度损失。 在本发明的优选的实施方案中，AR-SML首先与含胺的支架分子发生反应。在特别
优选的实施方案中，使用了衍生自SML的NHS酯。通过用限量的SML与支架分子浓縮液进
行反应，然后通过脱盐或透析分离为与支架连接的形式和游离的形式，可以很方便地确定
掺入到支架中的反应性SML的百分比。当可以确定在使用相对低廉的支架分子时需要多少
SML来达到特定的配体密度时，则很少人会去关注通常并不清楚SML在储存中的分解速率
和在溶液中的水解率的事实。 优选在支架与NHS酯类反应的情况下，使用约pH 7. 2来尽量减低水解率，并使用 相对高浓度的支架以在面对竞争性水解反应下推动与含胺的NHS酯的反应。例如，支架的 浓度优选是> 10mg/ml，更优选是〉20mg/ml，甚至更优选是〉40mg/ml。高浓度支架(即小 体积)还具有下述优势其有利于在支架与目标生物分子连接前进行的后续脱盐或透析步 骤。 对本领域任何技术人员显而易见的是，在适当条件下，也可使用其它胺反应性衍 生物(如异硫氰酸酯、三嗪、磺酰氯、酰叠氮、卤代芳烃、醛类、四氟苯基酯和亚氨基酯)来代 替NHS衍生物，以有效地使SML与胺化支架分子偶联。还显而易见的是，TR-SML(马来酰亚 胺、卤代乙酰基衍生物)可用于巯基化支架，并且SML的肼衍生物或含胺SML可以与醛(例 如由用高碘酸盐处理葡聚糖或糖蛋白支架而产生的醛)缀合。 支架上可利用的胺官能团总数决定了可以连接的AR-SML数目上限。激发和发射 光谱大幅重叠的荧光SML更有可能猝灭，因此与斯托克斯频位移较大的荧光SML相比，可能 需要以更低的密度来掺入。通过增加支架的大小或通过优化胺官能团的排布，可以容纳数 目更多的荧光SML而不发生猝灭效应，因为荧光猝灭程度与分子间的距离有关(即荧光团 越靠近，则越有可能发生猝灭)。虽然较小的支架能够容纳的荧光团比较大的支架少，但可 在不影响生物活性下将更多数目的小支架连接在生物分子上。 只有一部分胺(或其它可能的连接点)被用于与SML反应，以确保剩余足够的基 团能与TR官能团连接。因此，在选择或设计合适的支架时，可利用的胺的总数是重要考虑 内容。如果支架上胺的总数不能满足特定应用，则可选择不同的支架，或者对支架进行化学 修饰反应以改变反应中心的数目或类型。在使用葡聚糖的情况下，已被开发的化学试剂可 以简单地应用到更大的分子。 在科学文献中全面描述了引入新官能团的方法。如果支架上存在羧基官能团，那 么可在碳二亚胺存在下与含胺分子缀合。与二胺(或多元胺)的縮合引入新的表面胺，其 提供用于缀合AR-SML的潜在位点。合适的二胺包括(但不限于)乙二胺和2，2-(乙二氧 撑)双(乙胺)[EDBA]。 羧甲基葡聚糖为用二胺引入胺官能性提供了便利的起点。二胺和单胺的结合提供 了同时引入表面胺和修饰葡聚糖性质的便利方式。可充分利用单胺来控制胺总数和/或提 供其它表面特征(如极性、疏水性或带电基团)。例如，碳二亚胺介导的与乙醇胺的縮合引 入了极性但相对非反应活性的羟基，并为每个连接分子消除一个负电荷。类似地，通过碳二 亚胺介导的縮合，羟苯基甘氨酰胺、精胺和牛磺酸可分别用于引入酰胺基(中性)，胍基(带正电荷)和磺基(带负电荷)。这样的引入可用于减少缀合物的非特异性结合或改变固定 化SML所处的环境，例如，影响/提高荧光SML的荧光性质。 还可利用羧基官能团来引入用于随后与TR-SML(例如碘乙酰胺衍生物)发生反应 的巯基官能团。由碳二亚胺介导的过量胱胺与支架的反应引入受保护的巯基，所述巯基可 以通过用DTT或其它还原剂处理来释放。以这种方式利用羧基的一种可能的优势是，所述 支架上的胺官能团仍可用于其它反应。如果胺总数有限和/或如果反应性SML只能作为TR 衍生物被利用，那么这种方法可能是有用的。任何过量的巯基可用单马来酰亚胺覆盖(c即) 或用于通过同双功能TR交联剂(如双马来酰亚胺基己烷，BMH)引入TR官能团。
胺基还可用于引入巯基，前提是此操作需留有足够的胺基，以完成随后通过引入 例如TR官能团对支架的构建。例如，胺可以与2-亚氨基硫杂环戊烷反应产生游离巯基，或 与S-乙酰基巯基乙酸N-琥珀酰亚胺(SATA)或S-乙酰基巯基乙酸N-琥珀酰亚胺(SATP) 反应生成可用羟胺释放的被保护的巯基，或与3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺 (SPDP)反应，在用还原剂(如二硫苏糖醇)处理后释放巯基。如果支架具有醛官能团，则可 以用2-乙酰氨基-4-巯基丁酰肼来引入所需的巯基。 如果支架具有太多胺，则可利用与限量乙酸酐或乙酸NHS的反应，以不可逆地封 闭部分所述基团。琥珀酸酐和戊二酸酐也能消除胺官能团并为每个被修饰的胺引入一个羧 基官能团。可用马来酸酐或柠康酸酐实现对过量胺的可逆性封闭。 因此，化学修饰反应可用于引入新的反应中心和/或改变支架和由它们制成的缀 合物的理化性质，例如，提高测定信号和尽量减低非特异性相互作用。 —旦SML与支架反应，粗混合物(优选未经纯化)即可与另一种分子("激活剂") 反应，以引入能与待标记分子上存在的接收部分反应的一种或多种基团(如巯基反应性基 团)。用NHS化学试剂来引入SML的优点在于，可用相同的缓冲条件并借助异双功能试剂 来引入巯基反应性功能，所述异双功能试剂的一个末端能与胺反应(通过NHS酯)而另一 末端能与硫醇反应。许多这样的试剂都具有NHS部分，如4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己 烷-l-甲酸琥珀酰亚胺[SMCC]，该试剂是优选的，因为马来酰亚胺官能团被相邻的脂肪环 稳定化。具有类似化学反应性的其它试剂包括MBS(间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基 琥珀酰亚胺酯)；SIAB[(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺];GMBS[N_( Y -马来酰 亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯];SIAX[6-((碘乙酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺];和 SIAC[4-(((碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-l-甲酸琥珀酰亚胺]。在某些情况下也可采 用磺基类似物(如磺基-SMCC)，其在水溶液中显示比非磺化形式更大的溶解度。
在制备支架所采用的条件下，并且在缺少巯基的情况下，异双功能试剂的NHS基 团与胺发生选择性反应，并且TR官能团被展示在支架表面上。所产生的多TR SML-支架组 合优选通过脱盐或透析来纯化，并立即使用或者优选与2-IT和任选的其它合适赋形剂结 合来冷冻干燥，以便可按照WO 2007/068906中详述的方法来进行与生物分子的高效一步 缀合。 如果SML的连接不涉及NHS酯的使用，那么在巯基反应性官能团的连接前可能需 要进行SML-支架的脱盐或透析。这是因为与大多数其它胺反应性基团的反应需要较高的 pH值。例如，异硫氰酸酯的最有效反应是在pH 9.0左右。这对于使用大多数异双功能试 剂来引入TR官能团来说不是理想的，因为"巯基反应性基团"在高pH值下也会与胺起反应或衰减得非常快。然而，本发明的优点在于，样品的脱盐和透析步骤因高浓度/小体积而简 单，因此可用不同的化学试剂来连接SML和TR官能团，只要在每个阶段为样品更换适当的 缓冲液即可。 无论怎样构建多TR SML支架，都有必要依据最终应用目的在使用该缀合物前猝灭 过量的反应基团。WO 2007/068906介绍了可用于多肽标记物(如HRP、藻红蛋白)的几种 猝灭策略。例如，用甘氨酸来攻击2-亚氨基硫杂环戊烷，从而中止待标记的生物分子或在 使用缀合物时可能存在的其它生物分子的进一步巯基化。次要效应是由此释放的低分子量 硫醇也可灭活TR官能团。在本发明中，两个意想不到的观察结果提示，在染料标记的葡聚 糖支架的情况中，优选使用不同的方法。第一个观察结果是，高水平的SMCC修饰(其非常 优选用于W02007/068906描述的原位巯基化方法中)被发现与荧光素化的葡聚糖支架中的 荧光显著减少有关。第二个观察结果是，使用巯基乙醇来阻断荧光素化多马来酰亚胺基葡 聚糖/抗体缀合物与巯基化表面的不合乎需要的反应性，被发现能增加与所述抗体特异性 结合其抗原相关的荧光。在不同的试验中，阻断性硫醇在增强荧光中的作用都显示出对支 架起直接作用，所述硫醇明显缓解对来源于SMCC的马来酰亚胺官能团的荧光染料的猝灭 效应。通过减少溶液的离子强度(如加水稀释)和通过添加10% DMSO，能降低所述猝灭效 应，这表明猝灭(至少部分)起因于疏水相互作用。 在本发明中，优选使用甘氨酸和硫醇的组合来终止缀合反应。在具体优选的实施 方案中，所述组合试剂的PH值足够低以保护硫醇(即通过阻止氧化成二硫化物)，并且缓 冲能力也足够低，以至于在该溶液加入到缀合混合物时维持缀合混合物的接近中性pH值， 从而提供有利条件以封闭TR官能团和灭活过量的2-亚氨基硫杂环戊烷。特别优选的制备 液是含约10mM硫醇的50mM甘氨酸(pH 2. 3)，其被加入后甘氨酸和硫醇的终浓度分别为约 5mM和lmM。发现许多种硫醇能使多马来酰亚胺基荧光素化支架的荧光提高60-100% ，这些 硫醇包括二硫苏糖醇、巯基乙胺、巯基乙醇、巯基丙酸、L-半胱氨酸和巯基琥珀酸。还引入 了羧团的硫醇是特别有效的，巯基琥珀酸的增强效果最大。
现在，将进一步用阐述性实施例并参照附图
来描述本发明，其中
图l是显示本发明方法关键步骤的示意图。在第一阶段(i)中，使具有多个官能团 (X和任选的W)的支架与限量的SML接触，在某些X官能团与SML之间形成共价键。通常X 是胺基。W是在需要的情况下可以转换为X的基团，或用于其它用途的基团，或根本不被利 用的基团。在步骤(ii)中，使支架-SML分子与双功能试剂(BFR)(通常是异双功能试剂) 接触，后者具有X-反应性功能和巯基反应性(TR)功能并将X功能团转换为TR功能团。在 最后的步(iii)中，使所述多TR支架-SML分子、巯基产生剂(通常为2-亚氨基硫杂环戊 烷；2-IT)和待标记生物分子(例如抗体；Ab)同时相互接触。所述巯基产生剂作用于所述 待标记生物分子，并将胺功能团转换为高度亲核的巯基，后者立即与多TR支架反应，通过 一步缀合反应在抗体与支架之间建立连接(并因此使抗体与SML间接连接)。过量的反应 基团会自动衰减，该过程可以通过合适的猝灭剂(依据WO 2007/068906中描述的方法)来 加速； 图2是柱形图，显示在使用不同量的"巯基产生剂"(即2-亚氨基硫杂环戊烷)所 制成的缀合物的测定中检测到的荧光量(以任意的荧光单位)； 图3显示了4组柱形图(A-D):图A和B显示了ELISA中测定的吸光度(在405nm处)，在该ELISA中使用了兔IgG包被的微量滴定板和包含用生物素间接标记的山羊抗兔 IgG的缀合物(通过中间卵清蛋白支架进行偶联)；图C和D显示用链霉亲和素包被板捕获 相同缀合物的试验中测定的吸光度(在405nm处)。对于图A和C是采用恒定抗体浓度进 行，而对于图B和D是采用恒定支架浓度进行。C6-C8代表使用不同IgG :卵清蛋白比例形 成的缀合物，C5是对照缀合物(无IgG); 图4显示了ELISA中测定的吸光度(在405nm处)，在该ELISA中使用了兔IgG包 被的滴定板和包含用生物素通过中间卵清蛋白支架进行偶联间接标记的山羊抗兔IgG的 缀合物。缀合物是采用不同浓度的生物素制成(空心圆-ImM ;三角形_3mM ;实心圆_6mM ; 实心方形_无生物素)，并以一系列稀释液来进行试验；禾口 图5显示了类似于图4所示的实验中的吸光度(在405nm)，不同之处在于此处的 测试缀合物是用不同浓度的激活剂制备(实心正方形_零；三角形_5mM ;空心圆_10mM ;实 心圆-20mM)。 图6显示了用固定量(lOOyg)的两种多马来酰亚胺基荧光素化葡聚糖(150kDa 和400-500kDa)制备的各种山羊抗兔缀合物所产生的荧光单位，当进行测定时所用得黑色 聚苯乙烯板用兔IgG包被(A-D)或者未用兔IgG包被(E-F) 。 A、 C、 E和G显示150kDa葡 聚糖支架的数据，B、 D、 F和H显示400-500kDa支架。A禾P B(以及它们各自的对照E和F) 中固定的葡聚糖抗体摩尔比为1 : l，B和D(以及它们各自的对照G和H)中固定的葡聚
糖抗体摩尔比为3 : i。 图7是显示输出自固定量的多马来酰亚胺基荧光素化400-500kDa葡聚糖支架的 荧光的时间进程图，其中用水(对照；实心圆)或200mM H印es/lmM EDTA(pH 7.0)溶解冻 干材料，随后用各种试剂处理1.43mM巯基乙醇/5mM甘氨酸(实心方形)、0. 143mM巯基乙 醇/5mM甘氨酸(空心方形)、甘氨酸5mM(三角形)，或水(空心圆)。
实施例 实施例l.制备多马来酰亚胺基荧光素化OVA 使含40mg/ml (约0. 87mM ;lml)卵清蛋白(OVA) (A5505 ;批号076K7045)的lOOmM 磷酸钠溶液(PH 7. 2)，与限量(就卵清蛋白胺而言，每分子20个赖氨酸，其中有16个通常 是可用的；Battra PP， Int JBiochem.星，1375-84， 1991)的100 ii 1含22. 5mM 5_(禾口6_) 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(Mocular Probes C1311 ;批号25547W)的DMSO溶液反应。于 25。C在黑暗中30分钟后，再加入50iil含200mM 4_(N_马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-甲 酸磺基琥珀酰亚胺(sSMCC)的匿SO存贮液，使sSMCC和卵清蛋白的终浓度分别为8. 7mM 和约0. 76mM。在黑暗中中进一步孵育30分钟后，将多马来酰亚胺基荧光素化OVA样品在 S印hadex G_25 (PD10柱；GE Healthcare)上脱盐到10mM磷酸钠缓冲液(pH 5. 8)中。取 125 ii 1等份用775 ii 1磷酸钠缓冲液(pH 5. 8)和100 y 133%海藻糖存贮液(用1克海藻 糖加2ml水配制)进行稀释。依据W02007/068906介绍的方法，将等份(100 yl ;250y g) 的海藻糖/多马来酰亚胺基荧光素化OVA混合物用液氮快速冻结并冷冻干燥。
实施例2.制备包被板 用纯化的IgG (20 ii g/ml)或链霉亲和素(5 ii g/ml)以50 iU/孔包被96-孔 Maxisorp板(Nunc)，于4"C下持续至少16小时。使用前，用50mMTris/150mM氯化钠(pH值8. 0) (TBS)洗涤包被板5次，并用含0. 1 % BSA的TBS(封闭剂)封闭30-60分钟。用TBS 洗涤封闭板5次，随后与缀合物孵育(可根据需要用封闭剂稀释缀合物)。
实施例3.山羊抗兔IgG与多马来酰亚胺基荧光素化卵清蛋白的缀合
将50iil含山羊抗兔IgG(lmg/ml)的200mM H印es/lmM EDTA(pH 7.5)与 5 110mg/ml多马来酰亚胺基荧光素化OVA (将来自实施例1的材料重悬在25 水中)混 合。将四份11 Pi的所述混合物分别与1 P 1不同浓度的2-亚氨基硫杂环戊烷(8mM、4mM、 2mM和ImM)进行孵育，2-亚氨基硫杂环戊烷的终浓度分别为667 y M、333 y M、 167 y M和 OiiM。于25t:孵育过夜后，将样品以1/100稀释于50mM Tris/150mMNaC1/0. 1 % BSA(封 闭剂)中，并在包被了兔IgG的96孔Maxisorp微量滴定板(实施例2)上于25。C下孵育1 小时。用TBS洗涤5次后，每孔加入100 1 TBS，然后使用485/535nm的激活/发射设置和 11720的CW灯能量设置在Wallac Victor上读数(1秒/孔)。 这些数据显示在图2中。可以看出，所测试的2-IT最低浓度与其最高浓度同样有 效。在独立实验中结果发现，即使非常高浓度的2-IT(终浓度为8mM)仍然有效，但观察到 其缀合效率与800 i!M 2-IT的相比略有降低(数据未显示)，这可能是因为在该2-IT制备 物中有污染性硫醇和/或胺的过度修饰。因此，可以在广泛的浓度范围内使用2-IT。在缺 少2-IT的情况下，缀合效率低，因为在缺少巯基时，所述抗体只缓慢地(经由胺)与支架上 的TR官能团反应。 实施例4.制备多马来酰亚胺基_生物素_卵清蛋白支架 使含40mg/ml (约0. 87mM ;125 ii 1 ;5mg)卵清蛋白(A5505 ;批号076K7045)的 100mM磷酸钠溶液(pH 7. 2)，与6. 25 ii 1含60mMNHS_LC-生物素(Pierce 21335)的DMSO反 应。于25。C下l小时后，再加入14iil含200mM 4_(N_马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-甲 酸磺基-琥珀酰亚胺(sSMCC)的匿SO存贮液，使sSMCC和卵清蛋白的终浓度分别为19. 3mM 和约0. 75mM。于25°CT 1小时后，将多马来酰亚胺基荧光素化卵清蛋白样品在S印hadex G-25 (NAP-5柱；GEHealthcare)上脱盐到300 ii 1 lOmM磷酸钠缓冲液(pH 5. 8)中。用60 ii 1 磷酸钠缓冲液(PH 5. 8)和40 iU 33%海藻糖存贮液(用1克海藻糖加2ml水配制)稀释 所述样品。将等份(10 yl ;125 ii g)的海藻糖/多马来酰亚胺基荧光素化OVA混合物用液 氮快速冻结。 实施例5.优化抗体与支架的比例 将等分(10 ii 1)多马来酰亚胺基_生物素_卵清蛋白支架(实施例4)，与下述物 质以终体积50iil(根据需要加水补足)于25t:孵育过夜5iU2M H印es/10mM EDTA(pH 7. 5) 、5 iil 1. lmg/ml 2-IT (8mM存贮液)和不同量(5 ii 1、 10 ii 1或20 ii 1 ;55 ii g、 110 ii g 或220iig)的山羊抗兔IgG(llmg/ml)，使摩尔比(支架抗体)(假设抗体的分子量 为150,000而支架的分子量为约50,000)为6. 8 : 1 (缀合物6 ;C6) 、3. 42 : 1 (C7)和 1.7:1 (C8)。还设置了没有抗体的对照缀合(C5)。取一部分各缀合物按1/10， 000用封闭 剂稀释(即得到恒定的支架浓度)，制备另一组稀释液以得到恒定的0. 1 ii g/ml抗体浓度 (按1/10， 000稀释或更高，视缀合物而定)。样本测试在两个测定实验中进行，(i)兔IgG 板ELISA。在与缀合物于25t:下孵育1小时后，用TBS洗板，然后于25t:下1/2， 500链霉亲 和素-HRP(Innova Biosciences#857-0005)孵育各孔1小时。洗涤后，用ABTS试剂(lmM ABTS于pH5. 0的50mM乙酸钠中，每ml试剂含有1 P 1过氧化氢)检测HPR， (ii)链霉亲和素板捕获测定。在与缀合物于25t:下孵育1小时后，用TBS洗板，然后于25t:下用蛋白质 A HRP孵育1小时。洗涤后，用ABTS底物检测与被捕获的山羊抗体支架缀合物结合的蛋白 A-HRP。所得结果如图3所示。 从图A中可以看出，在兔IgG ELISA中，当缀合物被稀释到恒定的抗体浓度时，支 架与抗体的最高比例产生了最大信号。兔lgG包被孔上的缀合物8(C8)产生相对适度的 信号，大概是因为每个抗体分子只连接了较少的支架单元。在所有情况下对照孔(未包被 IgG)的结合都很低。在图B中，在固定的支架浓度下，与C7和C6相比C8中更高的抗体浓 度超过了对较少数目的支架单元/抗体分子的补偿，并且所有三种缀合物都产生了相对高 的吸光度值。在用固定抗体浓度的链霉亲和素捕获测定中(图C)，大小趋势与图A中所观 察到的相反。作为从缀合物C8到C6 —致的进展的该观察结果最有可能由以下两个方面解 释，(i)游离支架数量的增加，游离支架可能与抗体缀合物竞争结合固定化的链霉亲和素， 和(ii)支架单元/抗体数目的增加，支架单元可能阻止抗体Fc结构域与蛋白A-HRP的结 合作用。然而，由于C6能有效地结合固定化的兔IgG(图A)(但不是通过Fc区)，因此更 可能应该用游离生物素化支架的水平来解释C6与链霉亲和素板的少量结合；事实上，所述 三种缀合物的SDS凝胶(数据未显示)揭示，其中支架与抗体的比例相对较高的C6中有显 著水平的游离支架。由于链霉亲和素表面对支架-抗体缀合物的捕获只需要一个支架和一 个有利定向的生物素分子即可，因此在这种类型的应用中较低的支架与抗体摩尔比是优选 的。另一方面，如果是用生物素化支架来捕获基于链霉亲和素的检测试剂，则优选相对高的 支架与抗体摩尔比以提高测定的灵敏度，并且在此情况下，任何未缀合的支架都能地简单 被洗去。这些数据说明，缀合的性能取决于测定的配置，而且可以通过简单的摩尔比变化来 优化其性能和在不需要进一步纯化下制备缀合物。
实施例6.优化卵清蛋白支架上的生物素密度 使多份含40mg/ml(约0. 87mM ;125ii 1 ;5mg)卵清蛋白(A5505 ;批号076K7045) 的100mM磷酸钠溶液(pH 7. 2)各自分别与12. 5 yl含3种浓度NHS-LC-生物素((Pierce 21335)的DMS0(10mM、30mM或60mM)或仅DMSO(对照支架)混合。于25。C下1小时后，再加 入13. 5iil含200mM 4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷_1_甲酸磺基-琥珀酰亚胺(sSMCC) 的DMSO存贮液，使sSMCC和卵清蛋白的终浓度分别为17. 9mM和约0. 72mM。于25"C下1小 时后，将样品(151 y 1)在S印hadexG-25 (NAP-5柱；GE Healthcare)上脱盐到400 ii 1 10mM 磷酸钠缓冲液(pH 5. 8)中，并用50iU磷酸钠缓冲液(pH 5. 8)和50 yl 33%海藻糖存贮 液(用1克海藻糖加2ml水配制)补足到500 iU 。取等分(5 y 1)的各种类型的支架与下述 物质混合:5 y 1山羊抗兔IgG(10mg/ml) 、2 y 1 2MH印es/10mM EDTA(pH7. 5) 、6 yl水和最后 加入的2 ii 1 2-IT (8mM)。于25。C孵育过夜后，使缀合物在兔IgG板(实施例2)上于25°C 下孵育1小时。洗涤后，按1/10， 000用链霉亲和素HRP于25t:下孵育各孔1小时，再次洗 涤，然后依据实施例5用ABTS底物检测HRP。 在图4中可以看出，在支架上缺少生物素下(方形)，仅能观察到背景的结合。用 lmM(空心圆)、3mM(三角形)或6mM(实心圆)的生物素NHS酯制备的支架所制成的缀合 物，在1/10， 000缀合物稀释度下全部都显示出显著的结合，但用6mM生物素制备的缀合物 产生最高的吸光度值，大概是因为它能够比其它缀合物捕获更多的链霉亲和素HRP。
实施例7.优化sSMCC的量
使4份含40mg/ml (约0. 87mM ;125 ii 1 ;5mg)卵清蛋白(A5505 ;批号076K7045) 的lOOmM磷酸钠溶液(pH 7. 2)各自与12. 5 ii 1含60mMNHS_LC-生物素(Pierce 21335)的 匿S0反应。于25。C下1小时后，使各样品分别与13. 5 ill的含3种浓度4-(N-马来酰亚胺 基甲基)环己烷-l-甲酸磺基-琥珀酰亚胺(sSMCC)的匿S0(200mM、100mM或50mM)或仅 DMSO液混合，得到的sSMCC终浓度分别为约17. 9mM、8. 9mM、4. 5mM和OmM。于25。C下1小时 后，将样品(151 ill)在S印hadex G-25 (NAP-5柱；GE Healthcare)上脱盐到400 ii 1 10mM 磷酸钠缓冲液(pH 5. 8)中，并用50iU磷酸钠缓冲液(pH 5. 8)和50 33%海藻糖存贮 液(用1克海藻糖加2ml水配制)补足到500 。完全按照实施例6所述构建缀合物并用 ELISA进行分析。 如图5所示，可观察到由缺少sSMCC的支架制成的抗体缀合物(正方形)吸光度 值相对较低。为达到接近最大的吸光度值，sSMCC浓度需至少10mM(空心圆)。该浓度产生 的吸光度值显著高于5mMsSMCC(三角形)的，而且该值与在20mM sSMCC(实心圆)中所产 生的相近。 实施例8.用异硫氰酸酯SML制备支架 使含40mg/ml卵清蛋白的碳酸氢钠溶液(pH 9. 2)与2. 5mM异硫氰酸荧光素(取 自25mM的匿SO存贮液)于25t:下在黑暗中反应3小时。该样品经脱盐，并将其缓冲液换 成lOOmM磷酸钠溶液(pH7. 2)并调整为20mg/ml。将取自200mM DMSO存贮液的sSMCC加入 至其终浓度为10mM。于25t:下进一步1孵育小时后，将该样品脱盐到lOmM磷酸钠缓冲液 (pH5. 8)中。 实施例9.制备胺基葡聚糖支架 9A.经由醛衍生物。使分子量为80， 000的葡聚糖(以80mg/ml存在于水中；0. 5ml) (即lmM浓度)与lOOiU高碘酸钠于25t:下在黑暗中反应1小时。将该活化的葡聚糖 (0. 6ml)在S印hadex G-25 (PD10柱)上脱盐到0. 15mM氯化钠缓冲液(最终体积为1. 3ml) 中。加入150111碳酸氢钠/10% (体积比)2，2-(乙二氧撑)双(乙胺)[EDBA] (pH 9.2)。 于25°CT 30分钟后，用50mM硼氢化钠(取自5M的1M氢氧化钠存贮液)还原所产生的席 夫碱。30分钟后，用PD10柱将所述胺化葡聚糖脱盐到0. 15M氯化钠溶液中并收集0. 5ml流 分。合并含有胺(用TNBS测试；生物缀合技术(Bioconjugates techniques) ，GT Hermanson ISBN 0-12-342336-8，第112页)的早期洗脱的高分子量物质。该合并液的胺含量为约25 摩尔胺/摩尔葡聚糖。 9B.经由羧甲基(CM)衍生。将5克葡聚糖(150kDa或400-500kDa)加入到50ml 新鲜配制的1M溴乙酸/2M氢氧化钠溶液中，剧烈震荡1分钟，然后于25t:下温和搅拌24 小时。将CM葡聚糖在S印hadex G_25柱上脱盐到50mM MES(pH 6. 0)(用氢氧化钠调整)。 向10ml含CM-葡聚糖(约67mg/ml)的50mM MES(p朋.0)中加入2ml 0. 5M MES/2M乙二胺 (pH 6.0)和1.3ml 1M EDC[l-乙基_3_(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐]。使反应 于25t:下进行16小时，所产生的胺化葡聚糖在S印hadex G_25柱上脱盐到0. 1M的磷酸钠 溶液(pH7.2)中。胺的取代情况为约17摩尔/摩尔150kDa葡聚糖，和大于61摩尔胺/摩 尔400-500kDa葡聚糖。 实施例IO.修饰羧基官能团以引入额外的胺基到卵清蛋白支架将375 ii 1含卵清蛋白(40mg/ml)的50mM MES(p朋.0)加入到300 ii 1含1M EDBA的50mM MES(pH 6)中。加入75 EDC到50mM MES缓冲液(pH 6)中。通过使用过量二 胺(EDBA)来阻止卵清蛋白的交联，通过限定EDC的量来控制羧基(和因此引入的胺)的转 化率。使用浓度分别为100mM、20mM和4mM(和用于对照的OmM)的EDC存贮液(最终浓度 分别为10mM、2mM、0. 4mM和OmM)。较高的存贮液浓度(500mM或1M EDC)可引入极大量的 胺，但所产生的胺化支架在进一步与sSMCC反应时会沉淀。将胺化支架在PDIO柱上脱盐到 0. 15M氯化钠中以除去过量二胺、EDC和反应副产物。脱盐样品的最终体积为1.25ml。用 TNBS试剂对胺含量的评估显示，在过量二胺存在下，用10mM、2mM和0. 4mM EDC处理分别在 每一支架分子中引入大约6个、1个和0个新的胺基。
实施例ll.制备用于与碘乙酰氨基生物素反应的巯基化卵清蛋白
除了用胱胺替换二胺EDBA之外，完全按照实施例10所述来构建反应。在25t:下孵 育过夜之后，将样品在S印hadex G-25上脱盐到lOOmM磷酸钠溶液(pH8)中。加入125 yl 的40mg/ml DTT，在室温孵育30分钟后，将样品脱盐到100mM磷酸钠溶液(pH7. 2)中。该巯 基化样品立即与2-3倍摩尔过量(相对于巯基)的碘乙酰基-LC生物素(Pierce21333，批 号DG56028)于25t:下在黑暗中反应3小时，并脱盐到100mM磷酸钠溶液(pH7. 2)中，然后 进一步按照对其它支架-SML分子所描述的操作(如实施例7)来进行处理。
实施例12.制备多碘乙酰基荧光素化葡聚糖(40kDa)支架 将含分子量为40，000的氨基葡聚糖(每摩尔含9.3摩尔胺)(Molecular Probes， D1861) (40mg/ml ;lmM)的100mM磷酸钠溶液(pH7. 2)与100 ii 1含10mM 5-(和6-)羧基荧 光素琥珀酰亚胺酯(MolecularProbes C1311 ;批号25547W)的DMSO溶液，于25。C下在黑 暗中反应16小时。使200 ii 1的该支架进一步与20 iil含200mM碘乙酸NHS酯的匿SO于 25t:下在黑暗中反应1小时。220 ii 1样品在NAP-5柱上脱盐到450 y 1 10mM磷酸钠溶液 (pH5. 8)中，并用33 %海藻糖存贮液(用1克海藻糖加2ml水配制)补足到500 iU 。与山羊 抗兔IgG(5mg/ml)的缀合通过按照下列顺序混合下述物质来进行8 y 1水、6 yl支架/缓 冲液混合物[4 ii 1支架+2 ii 1 2M H印es/10mM EDTA (pH7. 5) ] 、4 ii 1 IgG禾P 2 ii 1 8mM 2-亚 氨基硫杂环戊烷，并于25t:下在黑暗中过夜反应。 实施例13.比较由150kDa多马来酰亚胺基荧光素化葡聚糖制成的缀合物与由 400-500kDa多马来酰亚胺基荧光素化葡聚糖制成的缀合物。在所有四种缀合物(柱E、F、 G及H)中，对照孔的荧光信号都低。 使胺化葡聚糖(按实施例9B所描述来制备)0. 25ml与5_(和6_)羧基荧光素琥 珀酰亚胺酯(4. 5 iil的lOOMm匿SO存贮液)(终浓度约1. 8mM)反应。于25。C下1小时后， 加入磺基_SMCC(7. 5 iil的200mMDMS0存贮液)(终浓度约6mM)。将多马来酰亚胺基荧光 素化葡聚糖(150kDa和400-500kDa)在S印hadex G-25柱上(PDIO， GE Healthcare)脱盐 到10mM磷酸钠溶液(pH5. 8) (1. 5ml洗脱体积)中。进一步加入2. 55ml水、0. 45ml海藻糖 (用1克海藻糖加2ml水配制)和22. 5 iil 2-亚氨基硫杂环戊烷(80mM存贮液；约400 y M 终浓度)。将各多马来酰亚胺基荧光素化葡聚糖(约2. 5mg葡聚糖/ml)按等分(40 y 1)冷 冻干燥。 用混合1份2M H印es/10mM EDTA(pH7. 5)与9份水而制成的稀释剂将山羊抗兔 IgG(21. 6mg/ml)稀释至2. 5mg/ml (存贮液X)。进一步制备存贮液X的3倍稀释液，得到 0. 8325mg/ml溶液(存贮液Y)和0. 277mg/ml溶液(存贮液Z)。用40 yl抗体存贮液X (即
19iooiig抗体；抗体葡聚糖的比例为i : i)或存贮液Y(即33.3yg抗体；抗体葡聚
糖的比例为l : 3)，复溶冷冻干燥的多马来酰亚胺基荧光素化150kDa葡聚糖的小瓶。用 40 ii 1抗体存贮液Y (即33 ii g抗体；抗体葡聚糖的比例为1 : 1)或40 iil存贮液z (即
ii.iyg抗体；抗体葡聚糖的比例为i : 3)，复溶冷冻干燥的多马来酰亚胺基荧光素化
400-500kDa葡聚糖的小瓶。5个小时后，用合适体积的TBS/0. 1% BSA稀释缀合物，使其中 的抗体浓度正常化到4 ii g/ml 。 根据实施例3所述，在兔IgG包被板(实施例2)上测试缀合物。如图6所示，在 抗体葡聚糖的摩尔比为l : l下，从400-500kDa葡聚糖缀合物(柱B)获得的信号超过 150kDa葡聚糖缀合物(柱A)信号的两倍，反映其表面积更大和连接的染料分子/分子葡聚 糖数目更多。当葡聚糖支架以3 : l摩尔过量时，差异并不那么明显，但400-500kDa葡聚 糖(柱D)的荧光信号仍然显著性高于150kDa葡聚糖(柱C)的荧光信号。较小支架上的
多个连接(柱c ;葡聚糖抗体的比例为3 : i)所产生的缀合物具有与在葡聚糖抗体的
比例为l : l下用400-500kDa支架制备的缀合物几乎一样大的信号。在所有四种缀合物 (柱E、F、G及H)中，对照孔的荧光信号都低。
实施例14 :SMCC的猝灭效应 将多马来酰亚胺基荧光素化葡聚糖支架样品(实施例13)加入40iil200mM H印es/10mM EDTA(pH7. 0)或者40 yl水(对照，pH 5. 8)中。加入H印es缓冲液中的样品 用4 iil不同的试剂分别进行处理14. 3mM巯基乙醇/50mM甘氨酸(pH 2. 3) 、14. 3mM巯基 乙醇/50mM甘氨酸(pH2.3)、50mM甘氨酸(pH 7.5)或水。将样品稀释至产生的信号在荧光 板读数器的线性范围内。结果如图6所示。巯基乙醇能显著增强荧光，这个过程在30分钟 内完成(1. 43mM终浓度)。高浓度并没有进一步增强荧光(未显示)。0. 143mM的最终浓度 不足以产生最强荧光，并且要用至少120分钟才能达到信号稳定。甘氨酸的加入，既加快了 2_亚氨基硫杂环戊烷的衰减而释放低分子量硫醇，也增强了荧光。该增强作用在30分钟内 完成，但增强效果显著低于高浓度巯基乙醇。在pH5.8下，荧光没有随时间推移而变化；在 中性pH值下，在缺少甘氨酸或巯基乙醇的情况下，观察到5小时后荧光略有增加，这也许可 解释为马来酰亚胺官能团的缓慢衰减。目前还不清楚为什么SMCC能猝灭多马来酰亚胺基 荧光素化支架的荧光，但用灭活2-亚氨基硫杂环戊烷的巯基乙醇/甘氨酸的混合物很容易 就能消除该效应，并通过与硫醇的加成反应迅速解除过量马来酰亚胺官能团的猝灭效应。
权利要求
一种用于将小分子配体间接偶联到欲用该配体标记的分子上的方法，所述方法包括以下步骤使连接有至少一个小分子配体的支架分子与所述待标记的分子接触，所述支架分子有至少一个能与所述待标记分子上存在或原位形成的接收部分起反应的基团，以在所述支架分子和待标记分子之间形成键，从而将所述小分子配体与待标记分子间接偶联。
2. 权利要求1的方法，其进一步包括以下步骤在使所述支架分子与待标记分子反应 前，将至少一个小分子配体连接到所述支架分子上。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述小分子配体被共价连接到支架分子上。
4. 权利要求2或3的方法，其中使所述小分子配体与化学计量过量的支架分子接触。
5. 权利要求2、3或4中任一项的方法，其中所述小分子配体就其与支架分子起反应的 能力而言是单价的。
6. 权利要求2-5中任一项的方法，其中所述小分子配体与支架上存在的胺基反应。
7. 权利要求2-6中任一项的方法，其中所述小分子配体包括N-羟基琥珀酰亚胺衍生 物、异硫氰酸酯衍生物、三嗪、磺酰氯、酰叠氮、卣代芳烃、醛类、四氟苯基酯、亚氨基酯。
8. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述小分子配体选自荧光团、发色团、生物 素、抗生物素蛋白、金属离子螯合剂、光反应基团、可碘化部分、光敏剂、猝灭剂、肽和低分子 量药物。
9. 前述权利要求中任一项的方法，其中在与所述支架连接之前，小分子配体的分子量 小于lkD。
10. 权利要求9的方法，其中在与所述支架连接之前，小分子配体的分子量小于0. 6kD。
11. 前述权利要求中任一项的方法，其中在实施所述方法之前，支架分子包含多个亲核基团。
12. 前述权利要求中任一项的方法，其中在实施所述方法之前，支架分子包含多个游离胺基。
13. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述支架分子包括选自以下的聚合物多肽、 胺化葡聚糖、巯基化聚合物、活性聚乙二醇、树状大分子、活性珠或纳米粒子。
14. 前述权利要求中任一项的方法，其中在与所述小分子配体连接前，支架分子的分子 量为至少5kD。
15. 前述权利要求中任一项的方法，其中在与所述小分子配体连接前，支架分子的分子 量为至少10kD。
16. 前述权利要求中任一项的方法，其中在与所述小分子配体连接前，支架分子的分子 量为至少20kD。
17. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述支架分子包括卵清蛋白、葡聚糖或衍生化 葡聚糖。
18. 前述权利要求中任一项的方法，其中在与所述小分子配体连接后，支架分子包含一 个或多个能与待标记分子上存在或原位形成的巯基反应的巯基反应性基团。
19. 前述权利要求中任一项的方法，其中巯基通过巯基产生剂的作用在待标记分子上 原位形成。
20. 权利要求19的方法，其中所述方法包括以下步骤使连接有一个或多个小分子配体的支架分子、待标记分子和巯基产生剂在单个混合物中接触。
21. 权利要求19或20的方法，其中所述巯基产生剂包括2-亚氨基硫杂环戊烷。
22. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述待标记分子包括多肽。
23. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述待标记分子包括酶、抗体或抗原结合片 段或抗体的变体。
24. 前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括下述步骤在与所述至少一个小分 子配体连接前或后，使支架分子与一种或多种激活剂接触，所述激活剂与支架分子反应而 产生一个或多个能与待标记分子上的接收部分起反应的基团。
25. 权利要求24的方法，其中所述激活剂为异双功能性试剂。
26. 权利要求24或25的方法，其中所述激活剂与支架分子的反应在所述支架分子中引 入巯基反应性基团，所述巯基反应性基团随后可与待标记分子上存在或原位形成的巯基反 应。
27. 权利要求24、25或26中任一项的方法，其中所述激活剂与支架分子中存在的胺基 反应。
28. 权利要求24-27中任一项的方法，其中所述激活剂包括N-羟基马来酰亚胺衍生物。
29. 权利要求24-28中任一项的方法，其中所述激活剂选自4-(N-马来酰亚胺基甲 基)环己烷-l-甲酸琥珀酰亚胺("SMCC")、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚 胺酯("MBS")、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺("SIAB")、N-(Y-马来酰亚胺 基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)、6-((碘乙酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺("SIAX")、 4-(((碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-l-甲酸琥珀酰亚胺("SIAC")以及它们的磺基化 衍生物。
30. 权利要求1-5中任一项的方法，其中所述小分子配体包含亲核基团，所述亲核基团 能与支架分子上存在的部分发生反应，以使配体连接到支架上。
31. 权利要求30的方法，其中所述小分子配体包含胺基。
32. 权利要求30或31的方法，其中所述支架分子包含一个或多个能与小分子配体反应 的醛基。
33. 前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括下述步骤将甘氨酸和硫醇加入反 应混合物中以终止间接偶联反应。
34. 权利要求33的方法，其中以混合物形式加入甘氨酸和硫醇，该混合物包含 25-100mM甘氨酸pH 2. 0-2. 6和5-25mM硫醇。
35. 适用于前述权利要求中任一项方法的支架分子，所述支架具有一个或多个连接的 小分子配体，和一个或多个能与所述待标记分子上存在或原位形成的接收部分起反应的基 团。
36. 权利要求35的支架分子，其中一个或多个小分子配体被共价连接到支架上。
37. 权利要求35或36的支架分子，其具有两个或更多个被连接的不同小分子配体。
38. 权利要求35、36或37中任一项的支架分子，其包含一个或多个巯基反应性基团，所 述基团适用于与待标记分子上存在或原位形成的巯基反应。
39. 权利要求35-38中任一项的支架分子，所述分子包括卵清蛋白、葡聚糖或葡聚糖衍 生物。
40. —种组合物，其包含权利要求35-39中任一项的支架分子的溶液，浓度为至少 10mg/ml，优选为部分或高度纯化。
41. 一种组合物，其包含冻干形式的权利要求35-39中任一项的支架分子，优选为部分 或高度纯化。
42. —种用于实施权利要求1-34中任一项的方法的试剂盒，所述试剂盒包含权利要 求35-39中任一项的支架分子，和实施本发明方法的说明书。
43. 权利要求42的试剂盒，其进一步包含巯基产生剂。
44. 权利要求43的试剂盒，其中所述巯基产生剂包括2-亚氨基硫杂环戊烷。
45. 权利要求42、43或44中任一项的试剂盒，其进一步包含一种或多种下述物质缓 冲剂；一种或多种小分子配体；一种或多种激活剂；和一种或多种待标记分子。
46. 权利要求42-46中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒中的至少一种试剂组分以冻 干形式和/或多个等份存在。
47. 权利要求39-43中任一项的试剂盒，其包含支架分子组合物，所述组合物具有连接 到组合物中每个支架分子的已知平均数目的小分子配体。
48. —种缀合物，其包含间接标记的分子、与所述间接标记的分子连接的至少一个支 架分子、和与所述支架分子连接的至少一个小分子配体标记物。
49. 权利要求48的缀合物，所述缀合物由权利要求1-32中任一项的方法制成。
50. 权利要求48或49的缀合物，其中所述小分子配体与支架分子共价连接，所述支架 分子与被间接标记的分子共价连接。
51. 权利要求48-50中任一项的缀合物，其中所述支架分子包括多肽、葡聚糖或葡聚糖 衍生物。
52. 权利要求48-51中任一项的缀合物，其中所述支架分子包括卵清蛋白。
全文摘要
本发明公开了用于将小分子配体间接偶联到欲用该配体标记的分子上的方法，所述方法包括使连接有至少一个小分子配体的支架分子与所述待标记的分子接触，所述支架分子具有至少一个基团能与所述待标记分子上存在或原位形成的接收部分进行反应，例如通过2-亚氨基硫杂环戊烷，以在所述支架分子和所述待标记分子之间成键，从而将该小分子配体间接偶联到所述待标记分子上。
文档编号G01N33/532GK101790684SQ200880103454
公开日2010年7月28日 申请日期2008年6月12日 优先权日2007年6月14日
发明者N·吉 申请人:创新生物科学有限公司