专利名称：用于炎性关节病抗白介素-17a治疗的关节破坏生物标记的制作方法
用于炎性关节病抗白介素-17A治疗的关节破坏生物标记本申请要求保护于2007年6月20日申请的美国临时专利申请60/945239的权益。 发明领域总的来讲，本发明涉及用白介素-17A(IL_17A)拮抗剂治疗炎性关节病。更准确地 讲，本发明涉及与IL-17A拮抗剂对类风湿性关节炎和相关关节炎性皮疹中关节破坏的抑 制功效有关的生物标记。
背景技术：
类风湿性关节炎(RA)是由免疫系统调节障碍引起的一种炎症性疾病，导致关节 炎症，引起关节疼痛、不适、肿胀和僵硬，并伴有进行性骨和软骨侵蚀。炎症和结构性关节损 伤共同引起功能丧失，可导致永久性失能。IL-17A，原名称为细胞毒性T淋巴细胞相关抗原8 (CTLA8)，是一种可与 IL-17RA(也称为IL17R)和IL-17RC结合的同型二聚体细胞因子。据信IL-17A的功能性受 体是多聚体受体复合物，包含IL-17RA和IL-17RC两者或其中之一(例如IL-17RA同型二 聚体、IL-17RC同型二聚体或IL-17RA/IL-17RC异型二聚体)，并可能包含第三种尚未知道 的蛋白质(Toy，D.等(2006) J. of Immunol. 177(1) :36_39 ；未发表数据)。IL-17A是由被称为Thl7细胞的T细胞亚类产生的，这些细胞的分化是在促炎细 胞因子(尤其是IL-6、IL-1-β和TNF-α)存在下由TGF-β信号转导而引发的，其维持 和存活依赖于白介素-23(IL-23) (Langrish, C. L.等(2005)，J. Exp. Med 201 :233_240 ； Harrington,L. Ε.等(2005) ,Nat. Immunol. 6 1123-1132 ；Veldhoen,M.等(2006) Immunity 24 179-189)。IL-23是包含pl9和p40两个亚基的异型二聚体细胞因子，其中pl9是IL-23 所特有的；而P40与IL-12共享。IL-23通过与包含IL-23R和IL-12R0 1(IL12RB1)的异型 二聚体受体结合而介导信号转导，该受体与IL-12受体共享。鼠病模型的研究表明，IL-23 依赖性Thl7细胞在自身免疫和慢性炎性疾病中起到致病作用(Langrish等，出处同上， Park, H.等(2005)，Nat. Immunol. 6 1133-1141)。IL-17A在疾病最早期与其它已知炎性介质(例如TNF和IL-1 β ) 一起存在于RA 滑液中。发炎关节内的IL-17A表达调节异常，单独刺激或与TNF和IL-I β —起以协同方 式刺激多种下游蛋白酶、趋化因子和促炎细胞因子，它们共同导致软骨和骨侵蚀。多种啮齿 类关节炎模型中所使用的各种IL-17A生物拮抗剂已经证明，IL-17A阻断可抑制关节炎进 程和所导致的关节破坏，要特别强调的是这样的破坏是发生在骨多余(bone sparing)的情 况下(参见例如 Koenders MI 等(2006) Ann. Rheum. Dis. 65 (增刊 3) :29_33)。至少一种抗 IL-17A抗体正在人类RA患者临床试验中做测试。目前，抗风湿药对关节破坏进展的效果评价主要依赖于放射摄影评价。然而， 对于如何使用临床试验的放射摄影数据，还有颇多争议(van der Heijde, D.等(2002) Arthritis Rheum 47 ；215-218) 0除了耗费时间之外，放射摄影术在RA早期是不实用 的，此时反映炎性过程的症状通常比关节破坏相关症状更显著(Morozzi，G.等(2007) ClinRheumatol.).的确，传统上用作RA—线疗法的非甾体抗炎药(NSAID)对改善炎症的体征和症状相当有效，但在延迟关节破坏上却几乎无效，导致炎症和后续关节破坏可 能是不偶联(uncouple)的推测(van denBerg, WB(2001), Semin Arthritis Rheum. 30 7-16 ；Geusens, P. P.等(2006), Arthritis&Rheumatism 54(6) :1772_1777)。因此，随 着目前集中于软骨和/或骨代谢的各种标记(与正常受试者相比，这些标记在RA患者 血清或尿中升高)的研发工作，已经确切知道在临床上需要更好的工具来预测抗风湿 药对结构性关节损伤的效果(Crnkic, M.等(2003)ArthritisRes. Ther. 5 :R181_R185 ； Valleala, H.等(2003)Eur. J. Endocrinol. 148 527-530) ；Ziolkowska, M.等(2002) Arthritis&Rheumatism46(7) 1744-1753)。关节中的关节软骨是由以下成分组成蛋白聚糖即软骨聚集蛋白聚糖 (proteoglycan aggrecan)、胶原(三条α链形成三股螺旋)和其它非胶原蛋白(例如软 骨寡聚基质蛋白(COMP)和人类软骨糖蛋白-39(HCgp-39，也称为YKL-40)。I型胶原是骨和 其它组织的主要成分，而II型胶原则特别位于关节的关节软骨上。在I型和II型胶原末 端，螺旋是短的、非螺旋N-端和C-端端肽，其含有与同一三聚体内和与邻近三聚体的其它 α -链相连的共价交联。MMP或组织蛋白酶K对胶原的生理性和病理性裂解，导致产生降解 产物或新表位(例如I型胶原的C2C、C1、2C、C-端交联端肽(CTX-I)，II型胶原的C-端交 联端肽(CTX-II)，I型胶原的N-端交联端肽(NTX-I))，它们释放到滑液、血清和尿液中。胶 原三股螺旋断裂也释放先前掺入到胶原原纤维中的非胶原蛋白(例如C0MP、YKL-40、软骨 聚集蛋白聚糖)。在正常重建和病理性软骨破坏的条件下，这些分子在滑液和血清中升高。软骨破坏也导致软骨细胞的胶原合成的代偿性增加。I型和II型胶原以前分子 (pro-molecule)形式合成，一旦到细胞外，前胶原(pro-collagen)断裂释放N-端和C-端 前肽(pro-p印tide)。II型胶原C-端前肽(CPII)水平与新的II型胶原合成相关。软骨 破坏也增加了软骨聚集蛋白聚糖的合成和具有CS846表位的“胎儿型”软骨聚集蛋白聚糖 的出现。血清中CS846水平的上升反映了新软骨聚集蛋白聚糖的合成(相对于“老”软骨 聚集蛋白聚糖的断裂)。骨破坏是通过产生过量破骨细胞而发生，这些破骨细胞重吸收矿化骨并降解脱矿 骨的有机基质。NFK B受体激活蛋白(RANK)配体(RANKL)是由活化T细胞、成纤维细胞样 滑膜细胞(FLS)和成骨细胞所表达的细胞表面分子，是促进前破骨细胞(pre-osteoclast) 分化为成熟破骨细胞中至关重要的，这样的破骨细胞是能够逐渐侵蚀骨的细胞。RANKL可因 蛋白水解性裂解而脱落(细胞表面RANKL和可溶性RANKL都具有活性)，并且在小鼠关节炎 和人类RA血清中升高。膜RANKL或可溶性RANKL与前破骨细胞上的RANK结合并递送分化 信号。护骨蛋白(OPG)是该系统的天然拮抗物，即通过与RANKL结合并阻止其与前破骨细 胞上的RANK相互作用。酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRACP)同工型(isoform)5b是由骨重吸收的破骨细胞 而释放到血清中，因为它们将降解的骨蛋白从重吸收骨表面胞转(transcytose)到骨外。 在骨重吸收疾病中TRACP同工型5b血清水平升高。TRACP5的氨基酸序列可参见检索号 NM 001102405、ΝΜ_001102404 或 NM_007388。在RA患者中，这些骨和软骨代谢(或破坏)血清标记中的某些会升高，并且 对于鉴别处于具有更高侵蚀性骨破坏的较高危险的患者具有某些预后价值。例如，已 经知道软骨寡聚基质蛋白(COMP)水平升高与更具侵蚀性的放射摄影进展相关(denBroeder, Α. A.等(2002)AnnRheum Dis 61(4) 311-318 ；Wollheim, F. A.等(1997)Br J Rheumato136(8) 847-8499 ；Skoumal, M.等(2003)。Scand J Rheumato132(3) 156-161 ； Mansson, B.等(1995)，J Clin Invest 95(3) :1071_1077 ；Lindqvist, E.等(2005)Ann Rheum Dis 64(2) 196-201 ；Forslind,K.等(1992)Br J Rheumatol 31 (9) :593_598 ；Fex, E.等(1997) Br J Rheumato 136 (11) :1161_1165。另外，低 0PG/RANKL 比率预测 5 年放射 摄影进展增加(Geusens，P.P.等(2006) Arthritis Rheum 54(6) :1772_1777)而且 CTX-1 和CTX-II水平升高与早期RA患者中4年Sharp评分增加相关(Garnero, P.等(2002) Arthritis Rheum 46(11) :2847_2856)。然而，本发明的发明人从所有已发表研究中都没有见到关于在严重关节炎动物中 阻断IL-17A可抑制骨侵蚀并调节任何上述蛋白质血清水平的研究结果。因此，存在着对通 过抗IL-17A治疗而抑制关节破坏的相关生物标记进行鉴定的需要。发明概述本发明基于本文所述的以下发现在胶原诱发性关节炎(CIA)小鼠中，在用抗 IL-17A单克隆抗体(Mab)治疗后，C0MP、0PG和RANKL血清水平因抗IL-17A治疗而改变。另 外，本发明的发明人已经发现，经传统组织学和基于μ -CT的技术测定，在CIA小鼠中RANKL 血清水平随抗IL-17A Mab剂量增加而降低，并在抑制CIA小鼠关节破坏的有效抗体剂量时 达到正常水平。根据在小鼠CIA关节炎模型中使用C0MP、0PG和RANKL的这些结果，本发明 的发明人在此相信，这些标记很可能用作抗IL-17A治疗对炎性关节病(例如RA和相关关 节炎性皮疹)中关节破坏的效果的替代标记(surrogate marker)，即生物标记。另外，在 关节炎小鼠中获得的这些数据支持使用在人类RA患者中升高的软骨和骨代谢的其它标记 (包括CTX-I、CTX-II和HC gp-39)作为替代标记，用于监测抗IL-17A治疗对炎性关节病 患者关节破坏的效果。另外，先前已经发现，抗IL-17A治疗在抑制CIA关节炎模型的关节破坏中是有效 的，甚至当治疗对炎症没有产生明显改善时(W02008/021156)。因此，预期抗IL-17A治疗将 可用于抑制先前已接受不同抗风湿药治疗的人类患者的进行性骨侵蚀，而无论先前的药物 是否减少了炎症的体征和症状。因此，本发明对经IL-17A治疗的骨侵蚀抑制相关的非炎症 相关标记的发现，为治疗患者的骨侵蚀提供了新的方法和产品，所述患者对先前的抗风湿 治疗是炎症无反应者或炎症反应者。因此，本发明的一方面是选择炎性关节病患者用IL-17A拮抗剂进行治疗的方 法。患者选择方法包括将采自受试者的血清样品中至少一种关节破坏生物标记(joint destruction biomarker)的水平与该生物标记血清水平的正常范围进行比较，如果受试者 血清样品中关节破坏生物标记的水平在正常范围之外，就选择该患者用IL-17A拮抗剂进 行治疗。另一方面，本发明提供预测IL-17A拮抗剂对炎性关节病患者骨侵蚀的抑制功效 的方法。该功效预测方法包括，在用IL-17A拮抗剂治疗之前和初次治疗周期结束时，测定 采自患者的血清样品中至少一种关节破坏生物标记的水平，并比较这些治疗前后血清样品 中该生物标记的水平。初次治疗周期期间生物标记水平正常化，就预测IL-17A拮抗剂很可 能有效抑制患者的关节破坏。在一个优选的实施方案中，预测方法还包括，在用IL-17A拮 抗剂的后续治疗周期结束时，测定采自患者的第三血清样品中生物标记的水平，如果第三血清样品中所述生物标记的水平比第二血清样品中所述生物标记的水平更正常化，则预测 所述IL-17A拮抗剂能有效抑制患者的关节破坏。优选的初次治疗周期为至少1周、至少2 周、至少4周、至少8周、至少12周、至少24周或至少48周，而优选的后续治疗周期为至少 12周、至少24周或至少48周。在某些实施方案中，患者是患有关节炎的非人类动物，其关 节炎可以是天然存在的或是实验诱发的。优选的非人类患者包括CIA小鼠或患有佐剂诱发 性关节炎(AIA)的大鼠。在其它实施方案中，患者是患有关节炎的病人。再一方面，本发明提供用IL-17A拮抗剂治疗患者的炎性关节病的方法。该治疗方 法包括测定采自患者的第一血清样品中至少一种关节破坏生物标记的水平，在最初治疗周 期期间，根据第一给药方案，将IL-17A拮抗剂给予患者，在最初治疗周期结束时，测定采自 患者的至少第二血清样品中所选生物标记的水平，并比较第一和第二血清样品中所述生物 标记的水平。如果第二血清样品中所述生物标记的水平在规定范围之内，则在至少一个后续治 疗周期期间，按照第一给药方案，用IL-17A拮抗剂对患者进行治疗。然而，如果第二血清样 品中所述生物标记的水平在规定范围之外，例如表明需要更积极的治疗才能达到关节破坏 被抑制，则在至少一个后续治疗周期期间，按照第二给药方案，用IL-17A拮抗剂对患者进 行治疗，其中第二给药方案包括在后续治疗周期期间所给予的IL-17A拮抗剂总量大于初 次治疗周期期间所给予的总量。在该治疗方法的一个优选的实施方案中，规定范围是正常范围，即健康、性别和年 龄匹配的受试者群体中存在的生物标记血清水平的范围。在另一个优选的实施方案中，生 物标记血清水平的规定范围定义为在炎性疾病患者群体中所述生物标记的平均血清水平 的置信区间为至少80%，所述患者已按照相同给药方案用相同IL-17A拮抗剂来治疗一段 时间，治疗时间等于初次治疗周期或者更长一些，其中在等于后续治疗周期或比后续治疗 周期长的时间周期期间，按照第一给药方案，在用IL-17A拮抗剂治疗后，所述群体表现出 关节破坏被抑制。在一个优选的实施方案中，当第二血清样品中的所述生物标记水平表明需要更积 极的抗IL-17A治疗时，则在后续治疗周期期间，用更大总量的拮抗剂对患者进行治疗，即 以比初次治疗周期期间所用的剂量更高和/或间隔更频繁的形式给予IL-17A拮抗剂。在另一优选的实施方案中，治疗方法还包括分别在初次治疗周期期间和后续治疗 周期期间，或仅在后续治疗周期期间给予IL-23拮抗剂。IL-23拮抗剂可抑制细胞因子任 一亚基(IL-23pl9或p40)、功能性受体任一亚基(IL-23R或IL-12 β 1)的表达，或可抑制 IL-23信号转导，即通过直接或间接地与这些多肽中的一种或多种相互作用，以阻止功能性 配体-受体相互作用。在某些优选的实施方案中，IL-23拮抗剂是与IL-23pl9或IL-23R结 合并抑制其活性的抗体或抗体片段。在一个特别优选的实施方案中，IL-23拮抗剂是能与 IL-23pl9特异性结合的单克隆抗体。本发明还提供治疗炎性关节病的药盒。药盒包括IL-17A拮抗剂的药物组合物和 用于测定采自患者的血清样品中至少一种关节破坏生物标记水平的试剂。本发明还提供用于治疗炎性关节病的制造的药物产品，其包含含有IL-17A拮抗 剂的药物制剂和使用说明书，使用说明书用于在用IL-17A拮抗剂治疗之前和治疗期间测 定患者血清中至少一种关节破坏生物标记的水平。
本发明的再一方面是IL-17A拮抗剂在制备用于治疗炎性关节病患者以抑制关节 破坏的药物中的用途，其中患者在用不同的抗风湿疗法进行前期治疗之后具有至少一种关 节破坏生物标记的异常血清水平。在一个优选的实施方案中，药物是用于按照本文所述的 任何治疗方案给予IL-17A拮抗剂。在本发明的上述各方面中，IL-17A拮抗剂可抑制IL-17A或IL-17RA或IL-17RC的 表达或者可抑制IL-17A信号转导，即通过直接或间接地与这些多肽中的一种或多种相互 作用，以阻止功能性配体-受体相互作用。在某些优选的实施方案中，IL-17A拮抗剂是与 IL-17A、IL-17RA或IL-17RC结合并抑制其活性的抗体或抗体片段。在一个特别优选的实 施方案中，IL-17A拮抗剂是能与IL-17A特异性结合的单克隆抗体。在其它优选的实施方 案中，IL-17A拮抗剂是与下列任一组合中的每个成员结合并抑制其活性的双特异性抗体 IL-23pl9 和 IL-17A ；IL_23pl9 和 IL-17RA ；IL-23R和 IL-17A ；IL-23R和 IL-17RA，IL_23pl9 和IL-17RC;或IL-23R和IL-17RC。在另一个特别优选的实施方案中，IL-17A拮抗剂是与 IL-23pl9和IL-17A结合并抑制其活性的双特异性抗体。在本发明的上述各方面中，优选的关节破坏生物标记是COMP、CTX-I、CTX-II、HC gp-39、OPG、RANKL、TRACP)同工型5b和骨钙蛋白(osteocalcin)。可使用这些生物标记中 的任一种或者这些生物标记中的两种或更多种、或所有6种的组合。C0MP、0PG和RANKL是 更优选的生物标记，其中RANKL是最优选的生物标记。可用本发明的上述任一方面治疗的优选炎性关节病是类风湿性关节炎(RA)、银屑 病性关节炎(PsA)或关节强直性脊椎炎(AS)，其中类风湿性关节炎是特别优选的炎性关节病。另外，在本发明的上述各方面中，对IL-17A拮抗剂或不同抗风湿药而言，炎性关 节病患者可以是炎症无反应者、炎症反应者、中等炎症反应者或良好炎症反应者。附图简述图IA显示本发明SEQ ID NO 1的人源化抗IL-17A抗体16C10轻链氨基酸序列。 标明了 CDR。图IB显示本发明SEQ ID NO 2的人源化抗IL-17A抗体16C10重链氨基酸序列。 标明了 CDR。图2A-2D显示抗IL-17A抗体治疗对类风湿性关节炎的CIA小鼠模型病理的效 果。治疗包括给予抗IL-17A抗体JL7. lD10(28mg/kg、7mg/kg和2mg/kg)和给予同种型 (isotype)对照(7mg/kg)。图2A显示目视疾病严重程度评分(disease severity score，DSS)，这是目视脚 爪肿胀和发红的度量，它随抗体治疗而变。评分为0 =脚爪表现出与对照(未经处理)脚 爪相同；1 =给定脚爪上1个脚趾有炎症；2 =给定脚爪上2个脚趾或脚掌有炎症；3 =给定 脚爪上脚掌和脚趾都有炎症；图2B显示软骨损伤(通过组织病理学)随抗体治疗而变。评分为0 =正常；1 = 最小；2 =轻度；3 =中度；4 =严重。图2C显示骨侵蚀(通过组织病理学)随抗体治疗而变。评分为0 =正常；1 =最 小；2=轻度；3=中度；4=严重。图2D显示在目视DSS中评分为2或3的CIA小鼠脚爪(即高度发炎脚爪)的骨侵蚀(通过组织病理学)。rlgGl是同种型对照抗体。评分为0 =正常；1 =最小；2 =轻 度；3 =中度；4 =严重。图3A-3B显示抗IL-17A抗体对关节炎小鼠的血清COMP水平的影响的数据。图3A显示用同种型对照或抗IL-17A抗体(JL7. 1D10)治疗的小鼠的血清COMP水 平。水平实线表示无病动物的平均血清COMP水平(图左侧的灰色圆圈)，两条水平虚线表 示无病小鼠平均值士2标准差。图3AA显示无病(正常)小鼠或用同种型对照或剂量为28mg/kg或7mg/kg的抗 IL-17A抗体(JL7. 1D10)每周治疗、共治疗5周的CIA小鼠的血清COMP水平。图3B显示无病(未操作)小鼠和用短期同种型对照(rlgGl)或抗IL-17A抗体 (JL7. 1D10)治疗的严重关节炎小鼠的血清COMP水平。图4显示未经治疗、用同种型对照治疗、或用3种剂量的抗IL-17A抗体 (JL7. 1D10)中的一种治疗的关节炎小鼠的血清RANKL水平。水平实线表示无病动物的平均 血清COMP水平(图左侧的灰色圆圈)，两条水平虚线表示无病小鼠平均值+/_2标准差。图5显示未经治疗(未给药)、用同种型对照(大鼠IgGl)治疗、或用抗IL-17A抗 体治疗的正常小鼠(灰色圆圈)或者关节炎小鼠的血清OPG水平。图6显示正常小鼠(灰色圆圈)或在短期暴露给同种型对照(rlgGl)或抗IL-17A 抗体(JL7. 1D10)之后的严重关节炎小鼠的血清RANKL和OPG水平。图7显示未发炎小鼠脚爪和用同种型对照抗体或抗IL-17A抗体治疗的关节炎小 鼠的严重发炎脚爪的μ-CT χ射线图。图8显示无病(未操作)小鼠和用长期同种型对照(rlgGl)或抗IL-17A抗体 (JL7. 1D10)治疗的严重关节炎小鼠的血清TRACP水平。图9显示正常小鼠和用抗IL-17A抗体(JL7. 1D10)或同种型对照抗体治疗的CIA 小鼠的血清骨钙蛋白水平。
图10显示通过小鼠CIA模式发展的一组小鼠的血清RANKL(左图)和OPG(右图) 水平的动态变化，水平线表示未操作的健康小鼠的平均值(实线)士 S. D.(虚线)，抗体给药 用箭头标明。图11显示在用大鼠IgGl同种型对照抗体治疗5周的每一周，各正常小鼠或CIA 小鼠的血清RANKL浓度与总动物DSS。图12显示在用大鼠IgGl同种型对照抗体治疗5周的每一周，各正常小鼠或CIA 小鼠的血清OPG浓度与总动物DSS。图13显示在未治疗或皮下给予同种型对照抗体(大鼠IgGl)或者2mg/kg、7mg/ kg，或28mg/kg抗IL-17A抗体(JL7. 1D10)治疗(每周1次，共5周)的各CIA小鼠的血清 RANKL水平。图14显示在未治疗或皮下给予7mg/kg同种型对照抗体(大鼠IgGl)或28mg/kg 抗IL-17A抗体(JL7. 1D10)治疗(每周1次，共5周)的各CIA小鼠的血清OPG图。图15显示患有佐剂诱发性关节炎(AIA)大鼠的脚爪厚度，所述大鼠在佐剂注射之 前已用同种型抗体或用指定剂量的抗大鼠IL-17A抗体(几8. 18E10)进行治疗。图16显示在患有已确定AIA的各大鼠中，在药物暴露后第14天和第25天时抗 IL-17A或抗TNF治疗对血清RANKL水平的影响。
发明详述I.定义为了使本发明更容易理解，下面对某些科技术语作了具体定义。除非在本文件中 另有说明，否则本文所用的所有其它科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员所公知 的含义。除非在上下文中另有说明，否则本文以及所附权利要求书所用的词汇的单数形式 都包括其相应的复数形式。就关节破坏生物标记血清水平而言，“异常”是指血清水平在所述生物标记的正常 范围之外。“关节强直性脊椎炎”或“AS”是脊椎和骶骨关节的一种慢性炎症形式，其位于骶骨 (紧挨着尾骨上方的骨)接触髂骨(臀部上方两侧的骨)的下背部(low back)。在这些区 域的慢性炎症引起脊椎内和脊椎周围的疼痛和僵硬。随着时间推移，慢性脊椎炎症(脊椎 炎)可导致椎骨完全溶接在一起(融合)，该过程称为关节强直(ankylosis)。关节强直导 致脊椎运动性丧失。关节强直性脊椎炎也是一种系统性风湿病，是指它可影响遍及全身的 其它组织。因此，它可引起脊椎内的炎症或脊椎外其它关节损伤，以及眼、心、肺和肾等其它 器官的炎症或损伤。“拮抗剂”是指在体外或体内可阻止、中和、抑制或降低靶向活性(即IL-17A等细 胞因子的活性)的分子。细胞因子拮抗剂包括但不限于拮抗性抗体、肽、肽模拟物、多肽和 小分子，其可与细胞因子(或其任一亚基)或其功能性受体(或其任一亚基)结合，其结 合方式能干扰细胞因子信号转导和下游活性。肽和多肽拮抗剂的实例包括细胞因子受体 的截短形式或片段(例如可溶性胞外结构域)，其可与细胞因子结合，其结合方式降低了 可与其功能性受体结合的细胞因子的数量或以其它方式阻止了细胞因子与其功能性受体 的结合。拮抗剂也包括能阻止细胞因子或其受体的任何亚基表达的分子，例如靶向mRNA 的反义寡核苷酸，和干扰mRNA (参见例如Arenz和Sch印ers (2003) Naturwissenschaften 90 345-359 ；Sazani 和 Kole(2003)J. Clin. Invest. 112 481-486 ；Pirollo 等(2003) Pharmacol. Therapeutics 99 55-77 ；Wang 等(2003)Antisense Nucl. Acid Drug Devel. 13 :169-189)。可通过常规技术检测拮抗剂的抑制效应。例如为了评价对细胞因子 诱导活性的抑制效应，表达细胞因子的功能性受体的人体细胞用细胞因子进行处理，并在 潜在拮抗剂存在或不存在的条件下测定已知被该细胞因子活化或抑制的基因的表达。当与 合适对照相比时，可用于本发明的拮抗剂抑制靶向活性达至少25%、优选至少50%、更优 选至少75%、最优选至少90%。“抗体”是指表现出所需生物活性的任何形式的抗体，所述活性例如抑制配体与其 受体结合，或者通过抑制配体诱导的受体信号转导。因此，“抗体”以其最广泛的含义使用并 且尤其涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例 如双特异性抗体)。“抗体片段”和“抗体结合片段”是指抗体的抗原结合片段和类似物，通常包括亲本 抗体的至少一部分抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留了亲本抗体 的至少某些结合特异性。通常，抗体片段保留了亲本结合活性的至少10%，当活性以摩尔 浓度表示时。优选抗体片段保留了亲本抗体对靶标的结合亲和力的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%以上。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab' 片段；双链抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv ；以及由抗体片段形成的多特异性 抗体。有关工程抗体变体的综述可参见Holliger和Hudson(2005)Nat. Biotechnol. 23 1126-1136。"Fab片段”包括一条轻链和一条重链的ChI和可变区。Fab分子的重链不能与另 一重链分子形成二硫键。“Fe”区含有包含抗体ChI结构域和CH2结构域的两条重链片段。这两条重链片段 通过两个或更多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用连接在一起。"Fab'片段”含有一条轻链和一条重链的一部分，后者含有Vh结构域和ChI结构 域，而且还含有介于ChI结构域与Ch2结构域之间的区域，以致于在两个Fab'片段的两条 重链之间可形成链间二硫键，从而形成F(ab‘ )2分子。"F(ab' )2片段”含有两条轻链和两条重链，后者含有介于C0I结构域与CH2结构 域之间的恒定区的一部分，以致于在两条重链之间可形成链间二硫键。因此，F(ab' )2片 段是由两个Fab'片段通过两条重链间的二硫键连接在一起而组成。"Fv区”包括来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。“单链Fv抗体”(或“scFv抗体”)是指包含抗体Vh区和\区的抗体片段，其 中这些区存在于一条多肽链中。通常，Fv多肽还包含介于Vh区与\区间的多肽接头， 其能使scFv形成所需结构，用于抗原结合。有关scFv的综述可参见PlUCkthim(1994) ThePhaemacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 编著，Springer-Verlag, New York，第269-315页。另见国际专利申请公布号WO 88/01649和美国专利号4，946，778和 5，260，203。“双链抗体(diabody)”是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。该片段包含在 同一多肽链内与轻链可变区(VJ相连的重链可变区(Vh) 或。通过使用太短 而不允许同一链上两个区之间配对的接头，迫使这些区与另一链上的互补区配对而形成两 个抗原结合位点。有关双链抗体的更全面描述可参见例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；和 Holliger 等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444_6448。“域抗体片段(domain antibody fragment) ”是仅含有重链可变区或轻链可变区 的免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或更多个Vh区与肽接头共价连接，产 生二价域抗体片段。二价域抗体片段的两个Vh区可靶向相同或不同抗原。“抗风湿药”是用于治疗类风湿性关节炎的药物。抗风湿药的主要类型描述如下。“非留体抗炎药”或“NSAID”是具有镇痛、解热和抗炎效果的药物，它们能减轻疼 痛、发热和炎症。NSAID用于缓解RA症状，但对类风湿性关节炎相关的进行性骨和软骨损失 仅具有有限效果。NSAID包括水杨酸类、芳基烷酸类、2-芳基丙酸类(洛芬类)、N-芳基邻 氨基苯甲酸类(芬那酸类)、昔康类、考昔类和磺酰替苯胺类(sulphonanilides)。常用的 NSAID包括布洛芬、奈普生和吲哚美辛。“皮质类固醇”是可的松的合成类似物，用于减轻炎症并抑制免疫系统的活性。最 常用的处方药是泼尼松和地塞米松。“疾病调节性抗风湿药(Disease Modifying Anti-Rheumatic Drug) ” 或 “DMARD” 是影响疾病过程本身的药物。DMARD也称为缓解药(remittive drug)，也具有抗炎效果，大多数是从癌症和疟疾等其它疾病的治疗中借用而来的。DMARD包括氯喹、羟氯喹、甲氨蝶呤、 柳氮磺吡啶、环孢菌素、硫唑嘌呤和环磷酰胺、硫唑嘌呤、柳氮磺吡啶、青霉胺和有机金化合 物(例如金硫葡糖、硫代苹果酸金钠和金诺芬)。DMARD也包括针对促炎细胞因子和它们的 受体的药物，例如TNF-α抑制药。已获批准用于治疗RA的TNF-拮抗剂的实例包括英夫 利昔单抗(Remicade , Centocor，Malvern, PA)、依那西普(Enbrel , Amgen，Thousand Oaks, CA)禾口|5可!JiHiit (Adalimumab) ( Humira , AbbottLaboratories, Abbott Park, IL)。IL-17A拮抗剂也归类为DMARD。“慢作用抗风湿药”或“SAARD”是一类特殊的DMARD，这些药物的效果是缓慢起效 的，不如NSAID那样迅速而显著。SAARD的实例是羟氯喹和金硫葡糖。“免疫抑制细胞毒性药”或“免疫抑制药”是通常在用NSAID和SAARD的先期治疗 无效时才用于炎性关节病的抗风湿药。免疫抑制药的实例是甲氨蝶呤、氮芥、环磷酰胺、苯 丁酸氮芥和硫唑嘌呤。“结合化合物(Binding compound) ”是指能与指定靶标结合的分子、小分子、大分 子、抗体或其片段或类似物、或可溶性受体。“结合化合物”也可指能与指定靶标结合的以 下物质分子复合物(例如非共价分子复合物)；离子化分子；和共价或非共价修饰的分子 (例如通过磷酸化、酰化、交联、环化或限制性裂解而修饰的分子)。在结合化合物可溶解或 悬浮于溶液的情况下，“结合”可定义为结合化合物与靶标的缔合，这种缔合导致结合化合 物的正常布朗运动减少。“结合组合物(Binding composition) ”是指结合化合物与至少一种其它物质(例 如稳定剂、赋形剂、盐、缓冲剂、溶剂或添加剂)的组合。“双特异性抗体”是指具有两个具有特异性的抗原结合位点分别针对两个不同表 位的抗体，这两个表位可以位于同一抗原上或位于两个不同抗原上。双特异性抗体包括双 特异性抗体片段。参见例如 Hollinger 等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 :6444_48， Gruber 等，J. Immunol. 152 5368 (1994)。本说明书全文和权利要求书所用的术语“基本上由...组成”或其变体例如“基本 由...组成”是指包括任何所述要素或要素组，并任选包括与所述要素特性相同或不同的其 它要素，其在本质上并不改变所指定的给药方案、方法或组合物的基础或者新性质。作为一 个非限制性实例，基本上由所述氨基酸序列组成的细胞因子或抗体链还可包含一个或多个 本质上并不影响细胞因子或抗体链性质的氨基酸。“炎性关节病(inflammatory joint disease) ”是指任何具有以下性质(a)和 (b)的疾病或病症(a)炎症存在于任何关节内；和(b)炎症是免疫应答中需要IL-17或由 IL-17促进的一部分。炎性关节病的非限制性实例包括关节强直性脊椎炎、银屑病性关节 炎、类风湿性关节炎。对抗风湿药的“炎症反应”是指用本领域已知的目标炎性关节病的任何可接受 标准测定，炎症的体征和症状方面有减少。例如，比较基线与治疗期间不同时间点之间的 压痛和肿胀关节数量，是评价关节状态和反应的常用方式。在美国风湿病学院(American College ofRheumatology,ACR)的RA关节计数(Felson等(1995)Arthritis&Rheumatology 38 ；727-735)中，评价了 68个关节压痛和66个关节肿胀(没有评价髋关节肿胀)。在主要 用于欧洲的疾病活性评分(DiseaseActivity Score, DAS)中，44个或28个关节计数都用于RA。在PsA中，最近的抗风湿药试验采用了 78个压痛和76个肿胀关节计数，以便适应 频繁涉及的远端指(趾)节间和腕掌关节。除了关节计数之外，ACR评价标准包括具有复 合评分的以下要素患者整体(在目视模拟量表[VAS]上)、患者疼痛、医师整体、健康评定 问卷调查表(HAQ ；是功能的度量)和急性期反应物(C反应蛋白或沉降速率)。ACR 20反 应指定为压痛和肿胀关节计数有20%改善和复合标准中其它五要素中至少三要素有20% 改善。ACR 50和70反应表示这些要素中至少有50%和70%改善。ACR系统仅代表变化， 而DAS系统代表疾病活性和变化的现有状态。DAS评分系统使用来自RA临床试验的加权数 学公式。例如，DAS 28 是 0.56 ( V T28)+0. 28 ( V SW28)+0. 70 (LnESR)+0. 014GH，其中 T 代 表压痛关节数，Sff是肿胀关节数，ESR是红细胞沉降速率，GH是整体健康状况。DAS的不同 值代表高或低的疾病活性以及缓解，而变化和终点评分的结果是通过反应程度给患者分类 (无、中等、良好)。对抗风湿药的“炎症反应者(inflammatory responder)，，是指这样的受试者其 用药物治疗3个月后，在ACR压痛关节计数上相对于基线(例如前期治疗)而言具有至少 > 20%改善，而且在ACR肿胀关节计数上相对于基线而言具有至少> 20%改善。“良好炎症反应者”是指这样的受试者其用药物治疗3个月后，在ACR压痛和肿胀 关节计数上相对于基线而言分别具有至少70%改善。“中等炎症反应者”是指这样的受试者其用药物治疗3个月后，在ACR压痛和肿胀 关节计数上相对于基线而言分别具有至少50%改善。对抗风湿药的“炎症无反应者(inflammatory non-responder) ”是指这样的受试 者其用药物治疗3个月后，在ACR压痛关节计数上相对于基线而言具有<20%改善，或在 ACR肿胀关节计数上相对于基线而言具有< 20%改善，或者其因无法忍受的不良反应或症 状恶化而没能完成3个月的抗风湿药治疗。“白介素-12R β 1”或“IL12RB1”是指基本上由人IL12RB1序列组成的单一多肽 链，所述序列描述于NCBI蛋白质序列数据库检索号ΝΡ714912、ΝΡ005526或其天然发生的变体。“白介素-17”或“IL-17”或“IL-17A”是指由一条或两条多肽链组成的蛋白质，所 述各链基本上由以下序列(1)或⑵或⑶组成(1)人IL17A序列，描述于NCBI蛋白质 序列数据库检索号 ΝΡ002181、ΑΑΗ67505、ΑΑΗ67503、ΑΑΗ67504、ΑΑΗ66251、ΑΑΗ66252 中的任 一个，或(2)这些序列的天然发生的变体，包括多肽链的成熟形式，即缺乏信号肽，或(3)非 人类IL-17A序列，包括小鼠IL-17A序列或大鼠IL-17A序列。“IL-17R”或“IL-17RA”是指基本上由人IL-17RA序列组成的单一多肽链，所述序 列描述于WO 96/29408或NCBI蛋白质序列数据库检索号NP 055154、Q96F46、CAJ86450中 的任一个，或这些序列的天然发生的变体，包括多肽链的成熟形式，即缺乏信号肽。“IL-17RC”是指基本上由人IL-17RC序列组成的单一多肽链，所述序列描述于WO 238764A2或NCBI蛋白质序列数据库检索号NP703191、NP703190和NPl 16121中的任一个， 或这些序列的天然发生的变体，包括多肽链的成熟形式，即缺乏信号肽。“白介素-23”(或“IL-23”)是指由2条多肽链组成的蛋白质。一条链基本上由 人IL23亚基pl9 (也称为IL23A)序列组成，所述序列描述于NCBI蛋白质序列数据库检索号 NP057668、AAH67511、AAH66267、AAH66268、AAH66269、AAH667512、AAH67513 中的任一个，或这些序列的天然发生的变体，包括多肽链的成熟形式，即缺乏信号肽。另一条链基本上由人 IL12亚基p40(也称为IL12B和IL23，亚基p40)序列组成，所述序列描述于NCBI蛋白质序 列数据库检索号 NP002178、P29460、AAG32620、AAH74723、AAH67502、AAH67499、AAH67498、 AAH67501中的任一个或这些序列的天然发生的变体，包括多肽链的成熟形式，即缺乏信号肽。“白介素-23R”或“IL-23R”是指基本上由人IL23R序列组成的单一多肽链，所述 序列描述于NCBI蛋白质序列数据库检索号NP653302或其天然发生的变体，包括多肽链的 成熟形式，即缺乏信号肽。“关节(Joint)”是指为了身体各部分运动目的而使两骨相连的区域。关节通常由 纤维结缔组织和软骨构成。articulation (关节)或arthrosis (关节)与Joint (关节) 同义。“单克隆抗体”或“mAb”是指得自基本上均质抗体群体的抗体，并且不得视为需要 通过任何特殊方法制得的抗体。就血清生物标记水平而言，“正常范围”是指健康、性别和年龄匹配的受试者群体 中存在的该生物标记血清水平的范围。用标准统计学测量，可确定该健康群体的最小规模， 例如医师可考虑普通群体的发病率和结果中所需要的统计学必然水平。优选从至少有5 个、10个或20个受试者的群体，更优选至少有40个或80个受试者的群体，甚至更优选有 100个以上受试者的群体确定关节破坏生物标记血清水平的正常范围。就血清生物标记水平而言，“正常化”是指在用IL-17A拮抗剂治疗后，生物标记 血清水平的上下变化使得改变的血清水平更接近所述生物标记的正常范围或优选落入正 常范围之内。在关节炎患者中，骨和软骨代谢或破坏的某些血清标记的水平会上升(例如 COMP和RANKL)；因此对于这些标记，正常化是指用IL-17A拮抗剂治疗后的血清水平相对于 治疗前的血清水平有下降。然而，在关节炎患者中，骨和软骨代谢或破坏的其它血清标记有 下降(例如骨钙蛋白)；因此，对于这些标记，正常化是指用IL-17A拮抗剂治疗后的血清水 平相对于这样的治疗之前的血清水平有上升。“胃肠外给药”是指静脉内、皮下或肌内注射。“小分子”是指分子量小于10kD、通常小于2kD、优选小于IkD的分子。小分子 包括但不限于无机分子、有机分子、含无机成分的有机分子、含放射性原子的分子、合成 分子、肽模拟物和抗体模拟物。抗体和细胞因子的肽模拟物是本领域已知的。参见例 如 Casset 等(2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307 198-205 ；Muyldermans (2001) J. Biotechnol. 74:277_302 ；Li (2000)Nat. Biotechnol. 18 1251—1256 ；Apostolopoulos 等 (2002)Curr. Med. Chem. 9 :411-420 ；Monfardini 等(2002)Curr. Pharm. Des. 8 :2185_2199 ； Domingues 等(1999)Nat. Struct. Biol. 6 :652_656 ；Sato 禾口 Sone (2003)Biochem. J. 371 603-608 ；美国专利号 6，326，482 (授予 Stewart 等)。“银屑病性关节炎”或“PsA”是特征为皮肤(银屑病)和关节(关节炎)炎症的一 种慢性病。银屑病的特征是皮肤炎症部位出现斑块、凸起、发红并伴有鳞屑，常常累及肘尖 和膝盖、头皮、肚脐以及生殖器区或肛门周围。大约有10%的银屑病患者也会发展其关节的 相关炎症。同时患有炎性关节炎和银屑病的患者就诊断为患有银屑病性关节炎。银屑病性 关节炎是系统性风湿病，其也可引起远离关节和皮肤的机体组织的炎症，例如眼、心、肺和肾的炎症。“血清”是指血清或血浆。“受试者”是指任何动物。在某些优选的实施方案中，根据上下文，技术人员显而易 见的是受试者是患有或未患实验性诱发性关节炎的研究动物，例如啮齿类(包括小鼠或大 鼠(arts))。在其它优选的实施方案中，技术人员显而易见的是受试者是人类。“治疗”是指将治疗药给予(内用或外用)需要治疗药的患者，所述治疗药例如含 有本文所述任何IL-17A拮抗剂的组合物。通常，给予预防或减轻一种或多种疾病症状、或 者用不同治疗药治疗的一种或多种不良反应的有效量的药物，无论是以任何临床可检测程 度来预防症状或不良反应的发展、诱导其消退或抑制其进程。有效减轻任何具体疾病症状 或不良反应的治疗药的量(也称为“治疗有效量”)可因诸如以下的因素而异疾病状态、 患者年龄和体重、以及治疗药引发患者所需反应的能力。通过医生或其它卫生保健提供者 常用的任何临床测定，通过评价症状或不良反应的严重程度或进行状态，来评价疾病症状 或不良反应是否已减轻。当将治疗药给予患有活动性疾病的患者时，治疗有效量通常导致 所测症状减少至少5 %，通常至少10 %，更通常至少20 %，最通常至少30 %，优选至少40 %， 更优选至少50 %，最优选至少60 %，理想的是至少70 %，更理想的是至少80 %，最理想的是 至少90%。尽管本发明的实施方案(例如治疗方法或药物产品)不可能有效预防或减轻 每个患者的目标疾病症状或不良反应，但是通过本领域已知的任何统计学检验检测，它在 统计学显著数量的患者中应当减轻这样的症状或效应，所述统计学检验例如斯图登t-检 验(Student，s t-test)、χ 2_ 检验(chi2_test)、按照曼-惠特尼(Mann and Whitney)的 U-检验、Kruskal-Wallis检验(H-检验)、Jonckheere-Terpstra检验和威尔科克森检验 (ffilcoxon-test)。II.概要如以下实施例更详细描述的，本发明是基于以下发现在RA小鼠模型中，抗 IL-17A治疗(1)抑制骨侵蚀，甚至当抗IL-17A治疗对炎症无明显效果时，和(2)降低软骨 和/或骨代谢的若干标记的血清水平。这些发现对于人类炎性关节病的抗IL-17A治疗具 有下列意义 其疾病的外表体征(outward sign)(例如压痛和肿胀关节计数、血清IL-6、血 清CRP、急性期反应物、HAQ、患者和医生整体评价、ACR20/50/70复合评分系统)并未被其它 抗风湿药适当地控制住的患者可从阻断IL-17A中获得关节保护性益处； 用IL-17A拮抗剂治疗但通过疾病的这些外表体征评价得出几乎没有到完全没 有获得益处的患者，通过X射线(骨侵蚀的度量)或MRI (滑液炎症的度量)评价，仍然可 以达到关节破坏被抑制； 表现出加速关节破坏潜力并具有疾病标记血清水平的患者(例如C0MP、 CTX-II, CTX-I, RANKL, OPG、TRACP, YKL-40或者其它软骨和/或骨破坏标记的血清水平上 升，或者骨钙蛋白血清水平降低)可从抗IL-17A治疗获得最大的关节保护益处，无论这样 的治疗是否改变疾病的外表体征；和 骨和软骨破坏血清标记(例如 COMP、CTX-I、CTX-II、HCgp-39、OPG 和 RANKL)水 平上升或骨破坏血清标记(例如骨钙蛋白)水平下降的短期改变，可用于评价IL-17A阻断 是否能保持作为关节保护性治疗的长期希望，即作为基于X射线功效测量的药效动力学标记或替代标记。因此，本发明提供针对使用关节破坏生物标记来指导用IL-17A拮抗剂治疗 的方法、药盒和药物产品。使用本领域已知的任何技术，可以完成对本发明中所用的关节破坏生物标记血清 水平的测定。COMP、CTX-I、CTX-II、HC gp_39、OPG和RANKL的测定可以是市售的或描述于 文献中。COMP IlJ^ =AnaMar Medical, Lund, Sweden(Crnkic, Μ.等，Arth. Res. Ther. 2003 ； 5 :R181-R185) ；AnaMar Medical, Lund, Sweden(Mundermann, A.等，Osteo and Cartilage 2005 ；13 34-38) ；AnaMarMedical，Lund, Sweden(Skoumal, M.等，Arth. Res. Ther. 2004 ； 6:73-74) ；AnaMar Medical, Lund, Sweden(Skoumal Scand J. Rheum. 2003) ；AnaMar Medical, Lund, Sweden(Lindqvist, E.等，Ann. Rheum. Dis 2005 ；64 196-201) ；Lab WM ELISA(ffislowska, Clin. Rheumatol 2005;24:278-284) ；Lab ELISA(Mansson, J. Clin. Invest. 1995) ；Lab ELISA(Senolt Physiological Res. 2007) ；Ana Mar Medical, Lund, Sweden(Morozzi, G.等，Clin Rheum 2007) ；AnaMar Medical, Lund, Sweden(Andersson, M. L. E.等，Ann Rheum Dis 2006 ；65 1490-1494)。HC gp39测定Quidel，US(Hetland，ACR2006) ；Lab测定(denBroeder，A. Α·等，Ann Rheum Dis 2002 ；61 :311_318) ；Lab RIA测定(Johansen, J. S.等，Rheumatology 1999 ；38 618-626)。RANKL 测定AMGEN 内部 ELISA(Geusens，P.P.等，Arth Rheum2006 ；54(6) 1772-1777) ；ELISA(Immun-diagnostik, Germany, VisArd. bmj journals, com 2006)。OPG 测定:Biomedica Medizinprodukte, Vienna, Austria (Geusens, Arth Rheum 2006;出处同上)；ELISA (Immundiagnostik，Germany) (VisArd. bmj journals, com 2006)； ELISA (Immunodiagnostik,Bensheim,Germany) ； (Valleala,H.等，Eur. J. Endocrinology 2003 ； 148 527-530)。CTX-I测定CrossLaps ELISA(Osteometer Biotech,Herlev,Denmark) (Garnero, P.等，Arth Rheuma 2002 ；46 (11) :2847_2856) ；CrossLaps (Rosch, Mannheim, Germany) (Lange, U.等，Rheumatology2005 ；44 :1546_1548)。CTX-II IlJ ^ :CartiLaps ELISA (Osteometer Biotech, Herlev, Denmark) (Garnero, P. Arth Rheuma2002 ；出^h同± ) ；CartiLapsELISA(Osteometer Biotech, Herlev, Denmark) (Garnero, Arth Rheuma2002 ；46 :21_30) ；PC-Cartilaps (Nordic Biosciences Diagnostics, Herlev, Denmark)(Olsen, A. K.等，Osteoarth. and Cartilage 2007；15 335-342)。本发明可用的拮抗剂抑制、阻断或中和IL-17A活性，其包括在局部区域在促进嗜 中性粒细胞积累中抑制IL-17A活性，和在促进嗜中性粒细胞活化中抑制IL-17A活性(参 见例如Kolls，J.等(2004) Immunity第21卷，467-476)。依据细胞类型的不同，IL-17A可 诱导或促进下列任一种促炎细胞因子和嗜中性粒细胞动员细胞因子的产生IL_6、MCP-U CXCL8 (IL-8)、CXCL1、CXCL6、TNF α、IL-1 β、G-CSF, GM-CSF, MMP-I 和 ΜΜΡ-13。本发明可用的IL-17A拮抗剂包括含有IL-17A的功能性受体胞外结构域的可溶 性受体。可溶性受体可按照标准方法制备和使用(参见例如Jones等(2002)Biochim. Biophys.Acta 1592 251-263 ；Prudhomme 等(2001)Expert Opinion Biol.Ther. 1 359-373 ；Femandez-Botran(1999)Crit. Rev. Clin. Lab Sci. 36 165-224)。本发明所用的优选IL-17A拮抗剂是这样的抗体或双特异性抗体所述抗体可特 异性结合IL-17A、IL-17RA、IL-17RC中的任一种和包含IL-17RA和IL-17RC的异型聚合体 复合物(heteromeric complex)并抑制它们的活性。更优选地，IL-17A拮抗剂的靶标是 IL-17A或IL-17RA。特别优选的IL-17A拮抗剂与IL-17A特异性结合并抑制其活性。一种 特别优选的IL-17A拮抗剂是包含具有SEQ ID NO=I的轻链和具有SEQ ID NO 2的重链的 人源化单克隆抗体。本发明所用的另一优选IL-17A拮抗剂是也能拮抗IL-23活性的双特异性抗体或 双特异性抗体片段。这样的双特异性拮抗剂与下列任一组合中的每个成员特异性结合并抑 制其活性:IL-17A 和 IL-23 ；IL-17A 和 IL_23pl9 ；IL-17A 和 IL_12p40 ；IL-17A 和 IL-23R/ IL12RB1 复合物；IL-17A 和 IL-23R ;IL_17A 和 IL12RB1 ；IL17RA 和 IL-23 ；IL-17RA 和 IL-23pl9 ；IL-17RA 和 IL_12p40 ；IL-17RA 和 IL-23R/IL12RB1 复合物；IL-17RA 和 IL-23R ； IL-17RA 和 IL12RB1 ；IL17RC 和 IL-23 ；IL-17RC 和 IL_23pl9 ；IL-17RC 和 IL_12p40 ； IL-17RC 和 IL-23R/IL12RB1 复合物；IL-17RC 和 IL-23R ； IL-17RC 和 IL12RB1 ；IL-17RA/ IL-17RC 复合物和 IL-23 ；IL-17RA/IL-17RC 复合物和 IL_23pl9 ；IL-17RA/IL-17RC 复合物 和 IL-12p40 ； IL-17RA/IL-17RC 复合物和 IL-23R/IL12RB1 复合物；IL-17RA/IL-17RC 复合 物和IL-23R ；以及IL-17RA/IL-17RC复合物和IL12RB1。本发明所用的双特异性抗体靶向 的优选组合是IL-17A 和 IL-23 ；IL-17A 和 IL_23pl9 ；IL17RA 和 IL-23 ；以及 IL-17RA 和 IL-23pl9。一种特别优选的双特异性抗体与IL-17A和IL_23pl9中的每一个特异性结合并 抑制其活性。优选的IL-23 拮抗剂是与 IL-23、IL-23pl9、IL-12p40、IL23R、IL12RBl 和 IL-23R/ IL12RB1复合物中的任一个结合并抑制其活性的抗体。另一个优选的IL-23拮抗剂是基本 上由IL-23R胞外结构域(例如GenBankAAM44229的氨基酸1-353)组成的IL-23结合多肽 或其片段。可以通过本领域已知的制备抗体的任何方法来制备本发明所用的抗体拮抗剂。 单克隆抗体、多克隆抗体和人源化抗体的制备可参见Sheperd和Dean (编著)(2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY ；Kontermann 禾口 Dubel (编 著)(2001)AntibodyEngineering, Springer-Verlag, New York ；Harlow 禾口 Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,第 139-243 页；Carpenter 等(2000)J. Immunol. 165 6205 ；He 等 (1998)J. Immunol. 160 1029 ；Tang 等(1999)J. Biol. Chem. 274 :27371_27378 ；Baca 等 (1997)J. Biol. Chem. 272 10678-10684 ；Chothia 等(1989)Nature 342 :877_883 ；Foote 和 Winter (1992) J. Mol. Biol. 224 487-499 ；和美国专利号 6，329，511 (授予 Vasquez 等)。所需靶标的任何抗原形式都可用于产生抗体，可对其筛选具有所需拮抗活性的抗 体。因此，诱导用的抗原可以是含有一个表位或多个表位的肽，或者它可以是完整蛋白，可 单独或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。为了改善抗原性肽的免疫原 性，可将肽与载体蛋白缀合。抗原也可以是分离的全长蛋白、细胞表面蛋白(例如用转染了 至少部分抗原的细胞来免疫)或可溶性蛋白(例如只用蛋白质的胞外结构域部分来免疫)。 可由遗传修饰的细胞来表达抗原，所述细胞中编码抗原的DNA是基因组或非基因组(例如在质粒上)DNA。基本上由预测高抗原性区组成的肽可用于产生抗体。例如，通过使用载体NTI 组套(Informax, Inc, Bethesda, MD)的Parker plot分析而测定，人pl9的高抗原性区 发生在 GenBank AAQ89442 (gi 37183284)的氨基酸 16-28 ；57-87 ；110-114 ；136-154 ；禾口 182-186 ；而人IL-23R的高抗原性区发生在GenBank AAM44229 (gi =21239252)的氨基酸 22-33 ；57-63 ；68-74 ；101-112 ；117-133 ；164-177 ；244-264 ；294-302 ；315-326 ；347-354 ； 444-473 ；510-530 ；和 554-558。任何合适的免疫接种方法都可使用。这些方法可包括使用佐剂、其它免疫刺激 剂、重复加强免疫和使用一种或多种免疫途径。也可通过DNA载体免疫来进行免疫接种， 参见例如Wang等(1997)Virology228 :278-284。或者，可用携带目标抗原的细胞来免 疫动物，这可提供比用纯化抗原进行免疫接种产生更优良的抗体(Kaithamana等(1999) J. Immunol. 163 :5157_5164)。优选的抗体拮抗剂是单克隆抗体，可通过技术人员熟知的各种技术来获取。单 克隆抗体的制备方法的一般性描述可参见Stites等(编著)BAsreAND Clinical I_ma;Y(第 4 版)Lange Medical Publications, Los Altos，CA 和其中引用的参考文献；Harlow 和 Lane (1988) Antibodies :A Laboratory Manual CSH Press ；Goding (1986) Monoclonal Antibodies (Principles and PeagtigE(第2版)Academi c Press, New York，NY。通常，通过使从免疫哺乳动物宿主 分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤，从而使脾细胞成为无限增殖化细胞。参 见 Kohler 和 Milstein (1976)Eur. J. Immunol. 6 :511_519 ；Meyaard 等(1997) Immunity 7 283-290 ；Wright 等(2000)Immunityl3 233~242 ；Preston 等(1997)Eur. J. Immunol. 27 1911-1918。无限增殖的替代方法包括用EB病毒(Epstein Barr Virus)、癌基因或逆转录 病毒来转化，或本领域已知的其它方法。参见例如Doyle等(编著，1994和定期增刊)C皿 細 Tissue Cultuee ^aboeatoey Procedures' Johnffiley and Sons, New York, NY。禾丨J用合适的结合测 定和生物学测定，对来自单一无限增殖化细胞的集落进行筛选，从中筛选出能产生具有所 需特异性、亲和性和抑制活性的抗体的集落。例如，可通过表面等离子共振(Karlsson等 (1991)J. Immunol. Methods 145 :229_240 ；Neri 等(1997)Nat. Biotechnol. 15 1271-1275 ； Jonsson 等(1991)Biotechniquesll :620_627)或通过竞争性 ELISA(Friguet 等(1985) J. Immunol. Methods77 :305_319 ；Hubble (1997) Immunol. Today 18 :305_306)等方法，测定 抗体对靶标的结合特性。或者，可通过筛选来自人B细胞的DNA文库，来分离编码单克隆抗体或其结合片 段的DNA序列，参见例如Huse等(1989) Science246 1275-1281。其它合适技术包括筛 选噬菌体抗体展示文库。参见例如Huse等，Science 246 1275-1281 (1989)；和Ward等， Nature341 :544_546 (1989) ；Clackson 等(1991) Nature 352 :624_628 ；和 Marks 等(1991) J. Mol. Biol. 222 :581_597 ；Presta(2005)J. Allergy Clin. Immunol. 116 :731。本发明所用的优选单克隆抗体是“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中可变区来自实 验哺乳动物(例如大鼠或小鼠)中产生的亲本抗体，而恒定区得自人抗体，致使所得嵌合抗 体与亲本哺乳动物抗体相比，在人类受试者中将会更少地引起不良免疫应答。更优选，本 发明所用的单克隆抗体是“人源化抗体”，其中可变区中的所有或几乎所有超变环(例如互 补决定区即CDR)相当于非人类免疫球蛋白的超变环，而可变区中的所有或几乎所有构架(FR)区是人类免疫球蛋白序列的FR区。一种特别优选的用于本发明的单克隆抗体是“完 全人抗体”，例如仅包含人免疫球蛋白序列的抗体。完全人抗体可含有来自其来源细胞种类 的碳水化合物链，例如，如果是在小鼠、小鼠细胞或源自小鼠细胞的杂交瘤中产生的话，完 全人抗体通常就会含有鼠碳水化合物链。本发明所用的单克隆抗体也可包含骆驼化单域抗体。参见例如Muyldermans等 (2001) Trends Biochem. Sci. 26 230 ；Reichmann等(1999) J. Immunol. Methods 231 25 ；WO 94/04678 ；WO 94/25591 ；美国专利号 6，005，079。本发明所用的拮抗性抗体可具有修饰(或封闭)的Fc区，以提供改变的效应子功 能。参见例如美国专利号 5，624，821 ；W02003/086310 ；W02005/120571 ；W02006/0057702。 Fc区的改变包括氨基酸改变(取代、缺失和插入)、糖基化或脱糖基化以及添加多个Fe。Fc 的改变也可改变治疗性抗体的半衰期，导致更少的给药次数，因而更加便利并减少对材料 的使用。参见 Presta(2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116 :731，第 734-35 页。可将抗体与改进抗体在贮存期间的稳定性或延长抗体的体内半衰期的分子缀合 (例如共价结合)。延长半衰期的分子实例是白蛋白(例如人血清白蛋白)和聚乙二醇 (PEG)。可采用本领域众所周知的技术来制备连接白蛋白和PEG化的(PEGylated，加入聚乙 二醇的)抗体衍生物。参见例如 Chapman，A. P. (2002)Adv. Drug Deliv. Rev. 54 :531_545 ； Anderson 禾口 Tomasi(1988)J. Immunol. Methods 109 37-42 ；Suzuki 等(1984)Biochim. Biophys. Acta 788 :248_255 ；禾口 Brekke 禾口 Sandlie (2003) Nature Rev. 2 :52_62)。也可通过本领域已知的任何技术生产同时拮抗IL-17和IL-23活性的双特异性抗 体。例如，可采用两个免疫球蛋白重链/轻链对共表达，重组生产双特异性抗体。参见例如 Milstein等(1983)Nature 305:537-39。或者，可使用化学连接来制备双特异性抗体。参 见例如Brennan等(1985) Science 229:81。这些双功能抗体也可制备如下即通过二硫化 物交换(disulfide exchange)产生杂合杂交瘤(四杂交瘤(quadroma))；通过转录和翻译 产生单一多肽链，使双特异性抗体具体化；或者通过转录和翻译产生不止一条多肽链，它们 可共价缔合产生双特异性抗体。所提出的双特异性抗体也可完全通过化学合成而制备。双 特异性抗体可包含两个不同的可变区，两个不同的恒定区，一个可变区和一个恒定区，或其 它变化。本发明所用抗体的结合性通常至少Kd为约ΙΟ—Ι更通常至少IO-6M,典型的 是至少10_7M，更典型的是至少10_8M，优选至少约10_9M，和更优选至少ΙΟ,Μ，和最优选 至少 IiT11M (参见例如 Presta 等(2001) Thromb. Haemost. 85 379-389 ；Yang 等(2001) Crit. Rev. Oncol. Hemato 1. 38 17-23 ；Carnahan 等(2003)Clin. Cancer Res.(增刊)9 3982s-3990s)。通常将IL-17A拮抗剂和IL-23拮抗剂以药物组合物的形式给予患者，其中拮抗 剂与药学上可接受的载体或赋形剂混合在一起，参见例如Remington' s Pharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia :National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA(1984)。可按适于预定给药途径的任何方式来配制药物组合物。药物制剂的 实例包括冻干粉针剂、膏剂(slurry)、水性溶液剂、混悬剂和缓释制剂(参见例如Hardman 等(2001)Goodman and Gilman’ s The Pharmacological Basisof Therapeutics， McGraw-Hill, New York，NY ；Gennaro(2000)Remington :The Science and Practice ofPharmacy, Lippincott, Williams 和 Wilkins，New York, NY ；Avis 等(编著)(1993) Pharmaceutical DosageForms-Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY ；Lieberman 等(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms :Tablets,Marcel Dekker,NY ;Lieberman 等(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms :DisperseSystems, Marcel Dekker, NY ； Weiner 禾口 Kotkoskie(2000)ExcipientToxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY)。给药途径取决于拮抗剂或用于药物组合物的其它治疗药的特性。优选地，含有 IL-17A拮抗剂和IL-23拮抗剂的药物组合物通过以下方式系统给予口服，通过静脉内、腹 膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内、脑脊髓内、病灶内或肺部途径的注射或输注，或通过持续释 放系统，例如植入物。也已描述了将基因传递载体注射到中枢神经系统中(参见例如Cua 等(2001) J. Immunol. 166 :602_608 ；Sidman 等(1983) Biopolymers 22 :547_556 ；Langer 等 (1981)J. Biomed. Mater. Res. 15 167—277 ；Langer (1982)Chem. Tech. 12 98-105 ；Epstein 等(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :3688_3692 ；Hwang 等(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4030-4034 ；美国专利号 6，350466 和 6，316，024)。可以按照改善或预防关节破坏的任何治疗方案给予本发明所用的药物组合物。 选择治疗方案将取决于若干依赖组合物的因素和依赖患者的因素，包括但不限于拮抗剂 的半衰期、患者症状的严重程度和任何不良反应的类型或长度。优选地，给药方案使递送 到患者的治疗药的量最大化，同时又具有可接受的副作用水平。选择治疗性抗体和小分 子的合适剂量的指南是可获得的(参见例如Wawrzynczak(1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub.Ltd, Oxfordshire, UK ；Kresina(ed. )(1991)Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, MarcelDekker, New York, NY ；Bach (编著)(1993)Monoclonal Antibodies andPeptide Therapy in A utoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY ；Baert ^ (2003)New Engl. J. Med. 348 :601_608 ;Milgrom 等(1999)New Engl. J. Med. 341 :1966-1973 ；Slamon 等(2001)New Engl. J. Med. 344 :783_792 ；Beniaminovitz 等(2000) New Engl. J. Med. 342 :613_619 ；Ghosh 等(2003) New Engl. J. Med. 348 :24_32 ； Lipsky 等(2000)New Engl. J. Med. 343 1594-1602)。可通过连续输注或间隔给药方式提供生物拮抗剂例如抗体，所述间隔给药例如每 天1次，每周1次，或每周2-7次，每两周1次，或每月1次。抗体总的周剂量通常为至少 0. 05 μ g/kg体重，更通常为至少0. 2 μ g/kg，最通常为至少0. 5 μ g/kg，典型的为至少1 μ g/ kg,更典型的为至少10 μ g/kg,最典型的为至少100 μ g/kg,优选至少0. 2mg/kg,更优选至 少1. Omg/kg，最优选至少2. Omg/kg，优化为至少10mg/kg，更优化为至少25mg/kg，最优化为至少50mg/kg(参见例如Yang等(2003)New Engl. J. Med. 349 427-434 ；Herold 等(2002) New Engl. J. Med. 346 1692-1698 ；Liu 等 (1999)J.Neurol. Neurosurg. Psych. 67 451-456 ；Portielji 等(20003)Cancer Immunol. Immunother. 52 :133-144)。小分子治疗药(例如肽模拟物、天然产物或有机化学物质)的 所需剂量大致与每千克体重的抗体或多肽摩尔数相同(单位mol/kg)。由临床医生使用例 如本领域已知或怀疑会影响治疗或预测会影响治疗的参数或因素，对合适剂量作出判定。 通常，开始的剂量略小于最佳剂量，然后少量递增，直到相对于任何不良副作用而言达到所 需或最佳效果。
在一个优选的实施方案中，IL-17A拮抗剂是包含具有SEQ IDNO 1的轻链和具有 SEQ ID NO :2的重链的人源化单克隆抗体。该人源化Mab优选给予皮下，每周2次，每周1 次，每2周1次或每月1次，剂量介于IOmg至2，OOOmg之间，更优选每月1次或2次，剂量 介于20mg至400mg之间，甚至更优选每月1次，剂量介于40mg至IOOmg之间。在一个优选 的实施方案中，该人源化Mab按照达到0. 1-100 μ g/mL或更优选1_10 μ g/mL血清浓度的给 药方案来给予。使用IL-17A拮抗剂的治疗方案通常由治疗医生来确定，会综合考虑患者年龄、医 疗史、疾病症状以及对不同类型药物和给药方案的耐受性。通常，设计治疗方案以抑制过度 攻击的免疫系统，让身体最终重新调节自身，其结果通常是在患者已持续系统给药以抑制 不合适免疫应答达有限时间长度(例如1年)之后，然后如果没有复发自身免疫攻击时就 可逐渐减少和停止用药。有时可发生重新攻击，在这种情况下必须对患者进行重复治疗。因此，在某些情况下，医生将给患者开出在规定时间周期内要使用的一定量的 IL-17A拮抗剂剂量的处方，在此之后终止用拮抗剂的治疗。优选在一种或多种疾病急性症 状消失的初次治疗周期之后，医生将会继续一段时间的拮抗剂治疗，其中给予拮抗剂的用 量和/或频率在治疗终止前将会逐渐减少。本发明也提出了 IL-17A拮抗剂与IL-23拮抗剂联合使用的治疗方案。这样的方案 尤其可用于治疗急性期炎性关节病，其中IL-17A拮抗剂抑制现有作17细胞的活性，而IL-23 拮抗剂阻止新Th17细胞的产生。这样的联合治疗用较低剂量的IL-17A拮抗剂和/或给予较 短时间的IL-17A拮抗剂就可提供有效治疗。随着症状的改善，优选终止用IL-17A拮抗剂的 治疗，同时继续给予IL-23拮抗剂以防新的自身反应性Th17细胞的产生，这样的新Th17细胞 产生可导致疾病复发。这两种拮抗剂可在同一组合物中或在单独的组合物中同时给予。另 外，这两种拮抗剂可按单独间隔给予。也可使用不同剂量的拮抗剂。同样，抗IL-17A/IL-23 双特异性抗体可在急性期期间给予并逐渐撤药，接着用抗IL-23抗体治疗以维持对疾病的 抑制。治疗方案也可包括使用其它抗风湿药或其它治疗药，以改善一种或多种炎性关节 病症状或者预防或改善拮抗剂治疗的不良反应。用于治疗炎性关节病症状的治疗药的实例 是 NSAID 和 DMARD。在本文所述的使用两种或更多种不同治疗物质(例如IL-17A拮抗剂和IL-23拮 抗剂，或IL-17A拮抗剂和不同抗风湿药)的任何治疗中，可以理解，不同治疗物质彼此联合 给予，也就是说，它们可以在同一药物组合物中或在单独的组合物中同时给予，或者可在单 独的时间和按照不同的顺序给予这些物质。可用诊断学测定例如炎性症状的减少或发生(例如肿胀和压痛关节计数)；患者 疼痛评价；患者和评价者对疾病活性的整体评价和基础关节病理学的其它外周表现，来确 定IL-17A拮抗剂治疗在特定患者中抑制关节破坏的有效性。可将待治疗或已按本发明治 疗的患者的诊断学测定与得自对照受试者或对照样品的数据进行比较，这样的对照数据可 作为预定值，例如得自统计学合适的对照受试者组。实施例1抗IL-17A抗体的NHDF测定通过监测正常人(成年)皮肤成纤维细胞(NHDF)原代细胞系中rhIL-17A诱导的IL-6表达，来测定用于本发明的抗IL-17A抗体对IL-17A生物活性的阻断能力。简而言之， 将待测的不同浓度抗IL-17A抗体与rhIL-17A —起孵育，再将所得混合物加入到NHDF细胞 培养物中。然后测定IL-6的产生，作为所述抗体对IL-17A活性的抑制能力的度量。更详 细的方案如下。开始用40 μ g/ml贮液制备一系列2倍稀释的目标抗IL-17A抗体(一式两份)。 制备120ng/ml rhIL_17A贮液。将70 μ 1 rhIL_17A贮液与70 μ 1抗IL-17A抗体稀释液在 微量滴定板的孔中混合并在室温下孵育20分钟。然后将这些混合物各100 μ 1加入到前晚 已接种IX IO4NHDF细胞/孔(100 μ 1)并在37°C孵育的微量滴定板的孔中。NHDF细胞(传 代 4 次)得自 Cambrex Bioscience (Baltimore, Maryland, USA)。rhIL-17A 的所得终浓度 为30叫/1111(11^)，抗体范围按2倍间隔从1(^8/1111向下。将各板在37°C孵育24小时，然 后收获上清液并取出50 μ 1用于IL-6ELISA。检测人IL-6的ELISA进行如下。试剂通常来自R&D Systems (Minneapolis, Minnesota, USA)。将hIL-6捕获抗体(50 μ 1/孔，4 μ g/ml溶液)移至微量滴定板的孔中， 将其密封并在4°C孵育过夜。将滴定板洗涤3次，然后用100 μ 1/孔的封闭缓冲液封闭1小 时以上。再将滴定板洗涤3次。将实验样品(50μ 1培养上清液)和对照(系列稀释的IL-6 蛋白)加入到各孔中(50 μ 1)并孵育2小时。将各板洗涤3次，再加入50 μ 1/孔生物素化 抗IL-6检测抗体(300ng/ml)。将各板在室温下孵育2小时，洗涤3次，然后加入100 μ 1/ 孔链霉抗生物素HRP并孵育20分钟。再次洗涤滴定板。加入ABTS (BioSource, Carlsbad, California, USA) (100 μ 1/孔)并孵育20分钟。加入终止液(100 μ 1/孔)并测定405nm 处的吸光度。目标抗IL-17A抗体的IC50是在不存在任何添加抗IL-17A抗体时所观察到的将 rhIL-17A诱导的IL-6产生水平降低至50%所需的抗体浓度。实施例2包皮成纤维细胞测定抗IL-17A抗体通过监测HS68包皮成纤维细胞细胞系中rhIL_17A诱导的IL_6表达，来测定用于 本发明的抗IL-17A抗体对IL-17A生物活性的阻断能力。为响应rhIL_17A而减少IL-6的 产生可用作本发明所用的抗IL-17A抗体的阻断活性的度量。分析在人包皮成纤维细胞细胞系HS68(ATCC CRL1635)中鉴定为潜在IL-17A应答 细胞系的一组成纤维细胞细胞系中IL-17RC(IL-17A受体)的表达。这通过以下实验得以 证实通过用多克隆山羊抗人 IL-17R 抗体(R&D Systems, Gaithersburg，Maryland, USA)， 接着用藻红蛋白(PE)-F(ab，)2 驴抗山羊 IgG(Jackson Immunoresearch, Inc. ,WestGrove, Pennsylvania, USA)的间接免疫荧光染色，并在流式细胞仪(FACScan，Becton-Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA)上分析PE免疫荧光信号。作为模型的进一步验证， IL-17A(腺病毒衍生的rhIL-17A和市售大肠杆菌(E. coli)衍生的IL-17A，R&D Systems) 在HS68细胞中诱导IL-6的剂量响应性诱导，其EC50为5 lOng/ml，与市售多克隆抗 IL-17A抗体和单克隆抗IL-17A抗体(R&D Systems) 一起预孵育可阻断这样的诱导。IL-17A抑制测定进行如下。将T-75瓶中汇合的HS68细胞(约2Χ IO6细胞)用 Dulbecco氏PBS (不合Ca++和Mg++)洗涤，然后与5ml细胞解离培养基(Sigma-Aldrich， St. Louis, Missouri, USA)在37°C 5% CO2培养箱孵育2 5分钟。然后用5ml组织培养(TC)培养基收获细胞并在IOOOrpm离心5分钟。TC培养基是Dulbecco氏改良Eagle氏培 养基(含有谷氨酰胺)、10%热灭活胎牛血清(Hyclone)UOmM !fepes、ImM丙酮酸钠、青霉 素和链霉素。将细胞重悬于2ml TC培养基中，用锥虫蓝稀释1 1并计数。将细胞浓度在 TC培养基中调整为1 X IO5细胞/ml，并将0. Iml/孔的等分试样加入到装有0. Iml TC培养 基的平底板的各孔中。让细胞生长过夜后，吸出上清液，细胞用0. 2ml新鲜TC培养基洗涤。将待测抗IL-17A抗体进行2倍或3倍系列稀释步骤，得到一系列贮液，其可用于 在IL-17A抑制测定中产生1 0.001yg/ml的抗体终浓度。每次测定都使用大鼠IgG对 照和仅含培养基的样品作为对照，以测定HS68细胞中自发的IL-6产生。从装有HS68细 胞的板的各孔中吸出TC培养基。将等分试样的不同浓度抗IL-17A抗体(各0. Iml)在各 孔中与HS68细胞在37°C预孵育5分钟，然后加入0. Iml 20ng/mlrhIL_17A，得到rhIL_17A 终浓度为lOng/ml (约330pM IL-17A 二聚体)。将细胞在37°C孵育24小时，收获上清液 (50 100 μ 1)并测定 IL-6，例如使用来自 Pharmingen (OptEIA-BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey, USA)的人 IL-6ELISA 试剂盒。实施例3Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR 增殖测定通过监测rhIL_17A诱导的细胞系增殖，来测定用于本发明的抗IL-17A抗体对 IL-17A生物活性的阻断能力，所述细胞系经工程改造后能响应IL-17A刺激而增殖。具体地 讲，修饰Ba/F3细胞系(IL-3依赖性鼠前B细胞)以表达包含与小鼠粒细胞集落刺激因子 受体(GCSFR)跨膜结构域和胞质区融合的人IL-17A受体(hIL_17RC)胞外结构域的融合蛋 白。所得细胞系在本文中称为Ba/F3hIL-17Rc-mGCSFR。同型二聚体IL-17A与胞外IL-17RC 结构域结合引起hIL-17Rc-mGCFR融合蛋白受体的二聚化，其通过它们的mGCSFR胞质结构 域转导Ba/F3细胞增殖的信号。这类细胞能响应IL-17A而增殖，为IL-17A拮抗剂(例如 抗IL-17A抗体)提供了方便的测定。Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR增殖测定对IL-17A刺激的敏感性，使得用比其它实验相 对低浓度的rhIL-17A (例如3ng/ml，IOOpM)来进行实验成为可能，同时还能保持强烈和容 易测定的增殖响应。这意味着在测定中需要较低浓度的抗IL-17A抗体来达到摩尔浓度过 量超出rhIL-17A。用较低抗体浓度进行的实验，使鉴别用其它方法无法鉴别的高亲和性 抗体成为可能(即可在接近抗体-IL-17A结合曲线的线性范围内、而不是在平台内进行实 验)。实施例4使用抗IL-17A抗体治疗胶原诱发性关节炎胶原诱发性关节炎(CIA)是人类类风湿性关节炎的广泛接受的小鼠模型。将以高 亲和力与小鼠IL-17A结合的大鼠抗IL-17A抗体JL7. 1D10给予表现CIA的小鼠，以评价抗 IL-17A疗法治疗类风湿性关节炎的的能力。程序如下。在第0天，用在完全弗氏佐剂中乳化的牛II型胶原，在雄性B10. RIII 小鼠尾根部皮内进行免疫接种。在第21天，在小鼠尾根部皮内给予在不完全弗氏佐剂中乳 化的牛II型胶原，进行攻击。当免疫组中出现严重关节炎的最初体征时(第21天后)，将 所有余下的免疫小鼠都随机分为不同治疗组。动物用以下成分来治疗800yg、200yg或 50 μ g抗IL-17A抗体JL7. 1D10 ；200 μ g同种型对照抗体；或稀释剂。JL7. 1D10是替代物，中和对小鼠IL-17A (和人IL-17A)(在下文称为1D10)具有特异性的非常高亲和力的大鼠 抗体。在免疫小鼠中，在疾病发作的第一天皮下给予治疗，然后每周4次以上治疗。在第35 天处死小鼠，将脚爪固定在10%中性缓冲的福尔马林中，进行组织处理和制作切片。由病 理学家分析脚爪的以下组织病理学参数反应性滑膜、炎症、关节翳形成、软骨破坏、骨侵蚀 和骨形成。用以下疾病等级对各参数分级0 =无病；1 =最小；2 =轻度；3 =中度；4 =严 重。此外，用目视疾病严重程度评分(DSS)评价脚爪，其用0-3的等级来度量肿胀和发红， 其中0为正常脚爪，1为脚爪上1个脚趾有炎症，2为脚爪上2个脚趾或脚掌有炎症，3为脚 爪上脚掌和脚趾都有炎症。评分为2和3在本文是指有严重或高度发炎的脚爪。结果见图2A-2C。每个数据点表示1个脚爪，而不是动物所有4个脚爪的平均值 或所有动物的平均值。通过用所测试的较高抗IL-17A1D10浓度(28mg/kg和7mg/kg)的3 种病理测定(目视DSS-脚爪肿胀和发红、软骨损伤和骨侵蚀)，显示出高病理学评分的脚爪 数目减少具有统计显著性。具有最低浓度(2mg/kg)的结果对于骨侵蚀而言具有统计显著 性，目视DSS和软骨损伤下降。在发炎脚爪内软骨降解酶的产生减少中观察到了同样的益 处(基质金属蛋白酶匪 -2、匪 -3、匪 -13)。然而，脚爪炎症的目测评价可能低估了 CIA小鼠的抗IL-17A治疗的治疗益处，例 如降低的骨侵蚀。在其它实验中，使用组织病理学或微型计算机断层扫描术(μ-CT)分析 了 CIA小鼠高度发炎脚爪(DSS评分为2或3)的骨侵蚀。该研究是可行的，因为即使抗 IL-17A治疗的动物的高度发炎脚爪的百分率急剧下降(参见例如图2Α)，但仍然有大量高 度发炎脚爪，有可能比较所有治疗组(包括无抗体对照)的高度发炎脚爪(DSS = 2或3)。 图2D显示稀释剂治疗、同种型对照(rlgGl)治疗和抗IL-17A抗体治疗的动物中的高度发 炎脚爪的骨侵蚀图。经组织病理学测定，当与无抗体对照相比时，用抗IL-17A治疗的动物 的脚爪中骨侵蚀显著减少，尽管它们具有类似的DSS评分。结果表明，通过DSS评分来测定， 用抗IL-17A治疗可达到免于骨侵蚀，甚至在炎症没有明显改善的脚爪中。当用μ -CT测定CIA小鼠高度发炎脚爪中关节的骨矿物质密度(BMD)时，可得到 类似结果。表1提供了来自用抗IL-17A抗体IDlO或同种型对照(25D2)治疗的CIA动物 的疾病严重程度评分为0或3的脚爪的BMD。甚至对于具有相同目视疾病严重程度的关节 而言，与同种型对照治疗的动物相比，IDlO抗体治疗的小鼠在骨矿物质密度上大约仅具有 一半下降。魁CIA小鼠中关节的骨密度
治疗DSSBMD(mg/cc)25D239525D23108IDlO3288 如同骨侵蚀的情况一样，在IDlO治疗的CIA小鼠中也减少了软骨破坏和关节翳形 成(滑膜内衬增殖形成发炎组织的过度褶皱)。组织病理学显示，根据目测检查(DSS评分 为2和3)，当与稀释剂或同种型治疗对照相比时，抗IL-17A抗体治疗不仅减少了表现出严 重病理的脚爪数，而且也减少了出现同样发炎的脚爪的病理。在关节炎症的CIA模型中用抗IL-17A抗体治疗显著减少骨侵蚀的观察结果表明， 这样的疗法可用于预防人类RA的最糟糕和不可逆效果之一。另外，甚至在高度发炎脚爪中 骨侵蚀也减少的观察结果表明，关节炎症的简单目测评价不能准确测定疗效。骨侵蚀的直 接或间接测定可能是追踪治疗性治疗效果所必需的。直接方法包括但不限于标准2-D X射 线检测、计算机断层扫描术(CT)、磁共振成像(MRI)、超声波(US)和闪烁扫描术。参见例如 Guermazi 等(2004) Semin. Musculoskelet. Radiol. 8 (4) :269_285。间接方法包括本文所述 的关节破坏生物标记。实施例5抗IL-17A治疗对CIA小鼠中血清COMP水平的调节作用关节炎的CIA小鼠模型可用于评价抗体IDlO对COMP血清水平的影响，所述COMP 是掺入到软骨基质内的非胶原蛋白并在软骨蛋白水解后释放到滑液和血清中。滑液COMP 和血清COMP也可通过从头合成而产生(即与软骨破坏无关)。BIO. RIII小鼠用II型胶原进行免疫和加强免疫。在免疫/加强免疫小鼠群组 中第一只小鼠出现严重发炎脚爪之后，所有小鼠都随机接受治疗。将同种型或大鼠抗小鼠 抗体IDlO经SC每周给予1次，共5周。在第2、3、4和5次给药之前，然后在处死时，给小 鼠放血。给未操作小鼠放血，以测定无病时血清COMP的正常范围。使用市售的动物COMP ELISA(MD Biosciences, St. Paul, Minnesota)测定 CIA 小鼠的血清 COMP 水平。结果见图3A 水平实线表示无病动物平均血清COMP (图左侧的灰色圆圈)，两条水 平虚线表示无病小鼠平均值士2标准差。注意一个异常无病小鼠值将水平虚线明显拖离 平均值。该实验结果表明，与无关节炎小鼠中所观察到的血清COMP水平范围相比，关节炎 小鼠的血清COMP水平升高了，但是经致敏而获得CIA的小鼠在接触抗IL-17A抗体后使升 高的血清COMP水平降低了。使用标准组织学方法，由得自相同实验的关节组织学数据证 实，这样的COMP水平降低与软骨破坏减少有关(数据未显示)。为了评价抗IL-17A治疗对血清COMP水平的剂量依赖性，如上所述地进行了第二 次实验，只是抗IL-17A抗体IDlO的每周剂量为28mg/kg、7mg/kg或2mg/kg。在2mg/kg剂 量时未观察到COMP水平的变化；然而，在用两种较高剂量中的任一种治疗的CIA小鼠中观 察到COMP水平的下降趋势，见图3AA。在严重关节炎小鼠中研究了短期抗IL-17A治疗对血清COMP水平的影响。B10.RIII小鼠用II型胶原进行免疫和加强免疫。检查每只小鼠，当其表现出严重发炎脚爪时， 用单剂量的同种型(大鼠IgGl)或抗体IDlO (28mg/kg)进行治疗。抗体治疗后7天处死小 鼠。给未操作小鼠放血，测定无病时血清COMP的正常范围。结果见图3B。IDlO治疗小鼠 在药物暴露7天后具有血清COMP下降的趋势；因此，可能需要更长时间的药物暴露，从而使 COMP水平降至未操作水平。通过标准组织学方法测定，在经致敏而获得CIA的小鼠和严重关节炎小鼠中进行 的这些实验的结果，与IDlO对软骨破坏的抑制能力是一致的。因此，IL-17A拮抗作用对软 骨的保护特性与软骨破坏的该血清标记相关，而且血清COMP很可能用作抗IL-17A治疗对 人类RA患者中关节破坏的效果的生物标记。实施例6抗IL-17A治疗对CIA小鼠中血清RANKL水平的调节作用关节炎的CIA小鼠模型可用于评价抗IL-17A治疗对RANKL血清水平的影响， RANKL是由活化T细胞、滑膜细胞和成骨细胞所表达的细胞表面分子，它可调控前破骨细胞 发育性转化为成熟破骨细胞。在人类RA中血清RANKL升高。BIO. RIII小鼠用II型胶原进行免疫和加强免疫。在免疫/加强免疫小鼠群组中 第一只小鼠出现严重发炎脚爪之后，所有小鼠都随机接受治疗。将溶媒、同种型抗体或3种 不同剂量的抗体IDlO中的一种经SC每周给予1次，共5周。在第2、3、4和5次给药之前， 然后在处死时，给小鼠放血。给未操作小鼠放血，以测定无病时血清RANKL的正常范围。结 果见图4 水平实线表示无病动物平均血清RANKL水平(图左侧的灰色圆圈)，两条水平虚 线表示无病小鼠平均值士2标准差。无病小鼠(实线，灰色圆圈)具有可检测的血清RANKL水平，而关节炎小鼠具有 升高的水平(溶媒)。与同种型(大鼠IgGl)相比，经致敏而获得CIA的小鼠在接触抗体 IDlO后使升高的血清RANKL水平降低了，其最高剂量(28mg/kg)能使各动物的血清RANKL 水平处于正常范围之内。显然，通过标准组织学方法测定，该剂量的IDlO在抑制骨侵蚀时 也是有效的。因此，因为IL-17A拮抗作用对骨的保护特性与骨破坏的该血清标记相关，所 以RANKL很可能用作抗IL-17A治疗对人类RA患者中关节破坏的效果的生物标记。这些结 果也表明，内源IL-17A在CIA小鼠的RANKL产生上起到主要作用，而且抗IL-17A IDlO抗 体对RANKL表达的抑制作用可以部分地解释为什么该抗体能抑制关节骨侵蚀，甚至在变得 严重肿胀的少数脚爪中。实施例7抗IL-17A治疗对CIA小鼠中血清OPG水平的调节作用关节炎的CIA小鼠模型可用于评价抗IL-17A治疗对OPG血清水平的影响，OPG是 可溶性因子，它与细胞表面RANKL和可溶性RANKL结合并拮抗RANKL，阻止RANKL递送发育 信号给前破骨细胞。在人类RA血清中OPG升高，正如RANKL —样，这反映了有机体试图消 除减少升高RANKL的效应。BIO. RIII小鼠用II型胶原进行免疫和加强免疫。在免疫/加强免疫小鼠群组中 第一只小鼠出现严重发炎脚爪之后，所有小鼠都随机接受治疗。将同种型或IDlO经SC每 周给予1次，共5周。在第2、3、4和5次给药之前，然后在处死时，给小鼠放血。给未操作 小鼠放血，以测定无病时血清OPG的正常范围。结果见图5。
无病小鼠具有可检测的血清OPG水平(图左侧的灰色圆圈)，而关节炎小鼠具有 升高的水平(无给药图表)。抗体IDlO暴露能使经致敏而获得CIA的小鼠升高的血清OPG 水平降低，而同种型对照则不能。因此，IL-17A拮抗作用对骨的保护特性与骨破坏的该血 清标记相关，OPG很可能用作抗IL-17A治疗对人类RA患者中关节破坏的效果的生物标记。实施例8短期抗IL-17A治疗对CIA小鼠中血清RANKL水平的调节作用也评价了严重关节炎小鼠中抗IL-17A抗体IDlO对血清RANKL和OPG的短期效果。BIO. RIII小鼠用II型胶原进行免疫和加强免疫。检查每只小鼠，当其表现出严重 发炎脚爪(DSS ^ 2)时，用单次7mg/kg剂量的同种型或JL7. IDlO进行静脉内治疗。抗体治 疗后7天处死小鼠。给未操作小鼠放血，以测定无病时血清RANKL和OPG的正常范围。在 实验过程中定量测定血清几7. IDlO浓度，以证实整个实验期间的药物暴露(数据未显示)。 用成对t-检验进行了统计学分析，用ρ值为0. 05来描述各组间的显著性差异。结果见图 6.在严重关节炎小鼠(DSS彡2的小鼠)中，在抗体治疗的时间时，血清RANKL和OPG 浓度已经升高。治疗后第7天，IDlO治疗使同种型对照组(ρ <0.01)中观察到的血清RANKL 水平的升高最小化(左图)。同样的IDlO暴露对升高的血清OPG没有直接影响(右图)， 表明代偿性OPG降低需要超过7天的IDlO暴露才会触发。这些结果进一步支持以下预期 RANKL和OPG都能用作抗IL-17A治疗在抑制炎性关节病中关节破坏的功效的替代生物标 记。当用皮下(SC)给药途径进行同样的实验时，观察到在有或无IL-17A中和作用时， 血清RANKL明显进一步升高。这些实验结果间的差异可能是因为一个或多个下列原因造成 的给药途径、抗体批次或加强免疫后疾病严重程度的改变。实施例9在炎症无反应者中，抗IL-17A抑制关节破坏上述实施例证明，通过组织病理学，用抗体IDlO的IL-17A拮抗作用减少了骨侵 蚀，甚至在严重发炎脚爪中，而且通过IDlO暴露使升高的RANKL和OPG变得正常起来。对 来自对照抗体治疗动物和IDlO治疗动物的脚爪进行μ -CT分析，作为评价IDlO对骨代谢 的影响的另一种方法。BIO. RIII小鼠用II型胶原进行免疫和加强免疫。在免疫/加强免疫小鼠群组中 第一只小鼠出现严重发炎脚爪之后，所有小鼠都随机接受治疗。通过μ-CT X射线分析，比 较来自几7. IDlO治疗小鼠的少数严重发炎脚爪和来自对照抗体治疗小鼠的更多严重发炎 脚爪，结果见图7。未发炎脚爪在关节表面上没有骨侵蚀证据；然而，来自对照治疗小鼠的严重发炎 脚爪在存在免疫原II型胶原的关节表面上具有广泛的骨侵蚀。通过在骨两端用关节周围 的无定型X射线致密区替代非常确定的X射线致密骨结构就可证实这一点。来自IDio治 疗小鼠的少数几个严重发炎关节具有骨侵蚀证据，但骨侵蚀的程度比来自对照治疗小鼠的 “同样发炎”脚爪低得多。这些μ -CT X射线结果支持这一基本原理通过压痛关节计数和肿胀关节计数评 价，与安慰剂相比，IL-17A在RA患者中的拮抗作用将导致关节中骨侵蚀减少，甚至在继续有活动性疾病的患者中。换句话说，IL-17A拮抗作用可以将炎症的外表体征与关节破坏过 程分开。实施例10抗IL-17A治疗对CIA小鼠血清TRACP水平的影响也评价了长期抗IL-17A治疗对血清TRACP水平的影响。BIO. RIII小鼠用II型胶原进行免疫和加强免疫。在免疫/加强免疫小鼠群组 中第一只小鼠出现严重发炎脚爪之后，所有小鼠都随机接受治疗。将同种型大鼠IgGl或 JL7. IDlO经SC每周给予1次，共5周。在处死时给小鼠放血。给未操作的首次用于实验的小 鼠放血，以测定无病时血清TRACP的正常范围。使用市售的小鼠TRACP测定(IDS，Fountain Hills, AZ)测定CIA小鼠和未操作小鼠的血清TRACP水平。与无病(未操作)小鼠相比，在用同种型rlgGl对照治疗的关节炎小鼠中，血清 TRACP水平升高(图8)，这些升高的TRACP水平与关节炎小鼠肿胀脚爪中的骨破坏水平相 关(数据未显示)。在用IDlO治疗的关节炎小鼠中观察到血清TRACP水平下降的轻微趋 势，但该结果没有统计学意义(图8)。本发明的发明人相信，在该实验中没有看到统计学显 著的TRACP水平的下降，可能是因为最终处死放血时间点所致，为了以下讨论的原因，此时 测定了 TRACP水平。实施例11抗IL-17A治疗对CIA小鼠血清CTX-I和CTX-2水平的影响BIO. RIII小鼠用II型胶原进行免疫和加强免疫。在免疫/加强免疫小鼠群组中第 一只小鼠出现严重发炎脚爪之后，所有小鼠都随机接受治疗。将同种型或JL7. IDlO (28mg/ kg、7mg/kg或2mg/kg)经SC每周给予1次，共5周。治疗后第35天在处死时给小鼠放血。 给未操作B 10. RIII小鼠放血，以测定无关节炎时CTX-I的正常范围。使用识别小鼠CTX-I 的 RatLaps CTX-I ELISA(IDS, Fountain Hills，AZ)测定血清 CTX-I 水平。使用血清临床 前CartiLaps CTX-II ELISA(IDS, Fountain Hills, AZ)测定 CTX-II 水平。结果(未显 示)表明(I)CTX-I存在于未操作小鼠血清中，但在关节炎小鼠血清中不升高，和(2)在无 关节炎(正常)小鼠和关节炎小鼠的血清中，CTX-II低于检测限。JL7. IDlO不能可检测性 地改变CTX-I或CTX-II的基础水平。实施例12抗IL-17A治疗对CIA小鼠血清骨钙蛋白水平的影响BIO. RIII小鼠用II型胶原进行免疫和加强免疫。在免疫/加强免疫小鼠群组 中第一只小鼠出现严重发炎脚爪之后，所有小鼠都随机接受治疗。将同种型或22mg/kg JL7. IDlO经SC每周给予1次，共5周。治疗后第35天在处死时给小鼠放血。在10周龄、 14周龄和26周龄，给未操作小鼠放血，以测定这个关节炎模型中骨钙蛋白的正常范围。用 市售小鼠骨钙蛋白夹心 ELISA 测定(Biomedical Technologies Inc.，Stoughton，ΜΑ)来测 定血清骨钙蛋白水平。结果见图9。与未操作(正常)小鼠的水平相比，用同种型对照治疗的关节炎小鼠的骨钙蛋白 水平下降。尽管用几7. 1D10抗体的治疗没有显著地调节这些水平，但是具有使受几7. 1D10 抑制的骨钙蛋白水平正常化的趋势。实施例13
在CIA模型中随着小鼠进展，血清RANKL和OPG水平的动力学在诱导期，雄性BIO. RII小鼠用在CFA中的CII免疫后放血，每周1次，共3周 (Untxt)。然后，小鼠用在IFA中的CII加强免疫并在最初出现严重脚爪肿胀体征时，随机分 为不同治疗组。一些小鼠皮下给予7-30mg/kg对照抗体25D2或27F11，每周1次，共5周。 将5次独立实验的结果合并，表示为关节炎组的平均值士SEM(η = 10-30)。结果见图10。如图10的左图所示，与未操作对照小鼠(水平线)相比，在加强免疫之后，免疫/ 加强免疫小鼠群组的血清RANKL水平在效应期(疾病进展)第二周开始升高并持续升高4 周。相比之下，升高的血清OPG水平出现在诱导期的第一周，而在效应期的第二周回到基线 (图10，右图)。这些结果表明，在严重肿胀关节炎脚爪内发生关节骨侵蚀时，在模型疾病进 展期期间，血清RANKL水平升高了。RANKL的天然拮抗物OPG在诱导期期间一直升高，而在 前破骨细胞RANKL在血清中开始出现上升时，回到正常生理水平。无论所检测的时间点如 何，血清OPG水平都比血清RANKL水平高出5-10倍。增加的血清RANKL最有可能与更高血 清OPG水平复合并被中和。实施例14在CIA小鼠中，RANKL升高与脚爪肿胀的相关性实施例13中讨论的数据表明，在CIA模型中血清RANKL升高一段时程，而且前期 数据表明脚爪肿胀也发生在同样的时程。为了评价血清RANKL水平与脚爪肿胀间的相关程 度，给小鼠进行免疫和加强免疫，在出现最初的严重脚爪肿胀体征时，随机进行治疗，然后 用大鼠IgGl同种型对照抗体进行皮下治疗，每周1次，共5周。将4次独立实验的各小鼠 的每周血清RANKL浓度与总动物DSS汇集起来，用非参数Kruskal-Wallis分析对数据进行 统计学分析。图11显示在同种型对照抗体治疗的CIA小鼠中所得血清RANKL水平与疾病活性 的关系的每周快照。只有在第2周具有至少一个严重肿胀脚爪(DSS = 2-3)或在第3-5周 具有多个严重肿胀脚爪(DSS >3)的小鼠中，血清RANKL水平才会升高。重要的是，经免疫 和加强免疫的小鼠没有发生任何脚爪肿胀反应(DSS = 0)或仅在一个脚爪中发生轻度脚爪 肿胀反应(DSS= 1)，这表明在任何时间点都没有血清RANKL升高的体征。当小鼠用不同对 照抗体(小鼠IgGl抗体27F11)进行治疗时，在CIA小鼠中观察到血清RANKL水平与疾病 活性之间的类似的每周图像(weekly profile) 0用这两种对照抗体的数据支持以下结论 在第2周或超过第2周，一旦小鼠显示出至少一个严重肿胀脚爪时，CIA小鼠血清RANKL水 平就升高，而相反则不只是攻击后时间的反映，即没有脚爪肿胀体征的免疫/加强免疫小 鼠也就没有升高的血清RANKL。伴生(companion)脚爪组织学评价研究的结论是明显骨侵蚀只发生在严重肿胀 脚爪(DSS = 2-3)中，而不发生在最小肿胀脚爪(DSS = 1)中，也不发生在“其它脚爪”严 重发炎的小鼠的未发炎脚爪(DSS = O)中。因此，本发明的发明人在此相信，CIA模型中血 清RANKL升高与正在发生的骨侵蚀直接相关，而且血清RANKL可用作PK-PD标记，以追踪针 对影响破骨细胞形成的实验性治疗或已批准治疗的反应，而且可在使用标准关节组织病理 学技术确定治疗结果之前进一步评价该标记，或使用该标记来替代使用标准关节组织病理 学技术以确定治疗结果。实施例15
具有多个严重肿胀脚爪的小鼠具有升高的血清OPG水平为了评价血清OPG水平与脚爪肿胀间关系的时程，采用大鼠IgGl同种型对照抗体 或小鼠IgGl同种型对照抗体并测定血清OPG水平而不是RANKL抗体，重复了实施例14所 述的实验。用大鼠IgGl同种型对照的结果见图12。在第1周，部分尚无关节炎的小鼠(DSS = 0)具有升高的血清OPG水平，这还会因 来自模型诱导期的OPG升高而存在。与从第2周起“免疫和加强免疫”小鼠群组的平均血 清OPG水平已降至生理范围的实施例13中所得数据(图10，右图)形成对比，图12显示出 不同的图像。在第2周，在具有多个严重肿胀脚爪的少数小鼠中血清OPG水平“重新升高”， 超过尚无关节炎群组中的更多其它成员。在较晚时间点具有多个严重肿胀脚爪的小鼠没有 表现出血清OPG的大的升高。当小鼠给予小鼠IgGl同种型对照时，得到了血清OPG水平和小鼠DSS的类似的每 周图像(数据未显示)。具体地讲，仅在具有多个严重肿胀脚爪的小鼠中观察到血清OPG水 平升高，其水平在第2周具有统计学显著性，并在第3-4周可观察到明显趋势。仅当根据疾病严重程度分别分析免疫和加强免疫小鼠群组时，才观察到严重脚爪 肿胀与血清OPG升高间的上述关系。这是因为CIA模型中的OPG双相反应，其中OPG在诱 导期升高，而在整个效应期降低，该效应期覆盖了在具有多个严重肿胀脚爪的小鼠中重新 升高的第二图像。实施例16JL7. IDlO降低关节炎相关的血清RANKL水平上述实施例中讨论的结果表明(1)在已发展为具有至少一个严重肿胀脚爪的小 鼠中可观察到血清RANKL和OPG升高，和(2) IL-17A中和作用能抑制骨侵蚀，甚至在已观察 到的少数严重肿胀脚爪中。为了评价抗IL-17A中和作用是否能调节RANKL水平的严重关节炎相关性升高， 对小鼠进行免疫接种，攻击，在首次出现严重脚爪肿胀体征时随机进行治疗，然后用7mg/kg 大鼠 IgGl 同种型对照(2OT2)mAb、或者 2mg/kg、7mg/kg 或 28mg/kg JL7. IDlOmAb 经皮下治 疗，每周1次，共5周。在实验过程中定量测定血清药物浓度，证实药物暴露贯穿整个实验 过程。将各小鼠的血清RANKL水平对时间作图，结果见图13。在CIA模型的未治疗小鼠和同种型对照小鼠中血清RANKL水平随时程而升高(图 13，左上图和右上图)，也可见图10(左图)。给予彡7mg/kg JL7. 1D10，每周1次，共5周， 能减缓血清RANKL水平的关节炎相关性上升(图13，中下图)。这些结果表明，内源IL-17A 在CIA小鼠的RANKL产生上起到主要作用，而且JL7. IDlO对RANKL表达的抑制作用可以部 分地解释为什么几7. IDlO抑制关节骨侵蚀，甚至在变得严重肿胀的少数脚爪中。对图11和图13所示数据进一步分析表明，与临床上同样的对照治疗小鼠相比，在 JL7. IDlO治疗组有许多不太严重的关节炎小鼠和更多非关节炎小鼠，其血清RANKL水平下 降，甚至在的确发展为具有多个严重肿胀脚爪的少数几7. IDlO治疗小鼠中(数据未显示)。 该结果在第4周具有统计学显著性，而在第2、3和5周观察到无显著性趋势。实施例17JL7. IDlO在疾病进展阶段早期使血清OPG水平正常化如上所讨论，通过OPG表达的双相性成分(即在诱导期上升，而在疾病进展期缓慢下降)证实，对小鼠CIA模型中血清OPG水平的调节是非常复杂的，所述水平与疾病进展期 血清OPG的多个严重肿胀脚爪相关性增加相重叠。为了评价该复杂调节作用中IL-17A的 中和作用是否显示出任何令人信服的调节作用，给小鼠进行免疫接种，攻击，在首次出现严 重脚爪肿胀体征时随机进行治疗，然后用7mg/kg大鼠IgGl同种型对照(25D2)mAb或28mg/ kg JL7. IDlOmAb经皮下治疗，每周1次，共5周。在实验过程中定量测定血清药物浓度，证 实药物暴露贯穿整个实验过程。各小鼠的每周血清OPG图像见图14。在研究疾病进展期的最初时间点，在未治疗小鼠和同种型对照小鼠中血清OPG浓 度仍然上升，而小鼠群组中平均OPG水平随时间而下降，但在群组内具有非常不均勻的图 像。每周1次注射28mg/kgJL7. 1D10，共5周，在加强免疫后第2周能将血清OPG水平显著 降低至接近生理范围内的均一水平(图14，右图)。为了评价IL-17A中和作用在打断抗IL-17A治疗的少数“多个严重肿胀脚爪”小鼠 中是如何影响OPG水平“重新升高”，对图12和图14所示的数据进行了进一步分析，测定了 IL-17A中和作用对血清OPG浓度与“多个严重肿胀脚爪”小鼠间关系的影响。JL7. IDlO在 第5周在统计学意义上降低了具有多个严重肿胀脚爪的小鼠(DSS > 3)的血清OPG水平， 并在更早时间点就具有趋势(数据未显示)。实施例18IL-17A对无病小鼠的血清RANKL和OPG水平的影响以上讨论的数据表明，IL-17A对关节炎小鼠中的RANKL和OPG产生起到重要作 用，并且IL-17A中和作用可抑制小鼠的关节炎相关性骨侵蚀，推测是由抑制破骨细胞分化 /活性而引起的。为了评价内源IL-17A对正常骨体内平衡是否具有重要作用，在用28mg/ kg JL7. IDlO每周1次地经皮下治疗(共5周)之前和期间，测定正常BIO. RIII小鼠的血 清RANKL或OPG水平。IDlO治疗不改变这些正常小鼠的生理血清RANKL或OPG水平，这个 结果与以下结论一致内源IL-17A对正常小鼠生理性、非炎性RANKL和OPG介导的骨生物 学而言并非是至关重要的。实施例19抗IL-17A治疗在大鼠佐剂诱发性关节炎中是有效的大鼠佐剂诱发性关节炎(AIA)是严重骨侵蚀模型的另一实例。该模型是由在尾根 部单次注射完全弗氏佐剂(CFA)而引起的，在第10-13天开始出现对称性关节肿胀反应，到 第21天可见严重骨侵蚀。为了在AIA模型中研究IL-17A的作用，鉴定了能结合并中和大鼠IL-17A的抗体 (JL8. 18E10)。在CFA注射之前开始，每周1次地给予同种型抗体或0. 8mg/kg、4mg/kg或 20mg/kg JL8. 18E10，来治疗深色Agouti大鼠。示于图15的数据表明，各剂量的JL8. 18E10 完全阻止了关节炎的发生。使用大鼠AIA模型的类似实验已确定，无论在第10天(疾病发 生)还是在第12天(确定疾病)给予时，几8. 18E10都能抑制关节肿胀，并且还能抑制严 重体重减轻，这是AIA大鼠的特性(数据未显示)。为了研究IL-17A中和作用是否影响大鼠AIA模型中的RANKL水平，将JL8. 18E10 或同种型对照预防性地或在疾病发生时给予大鼠，在处死时收获血清，测定血清RANKL。与 同种型治疗大鼠相比，在两种治疗模式中，JL8. 18E10都降低了血清RANKL(数据未显示)。实施例20
在大鼠佐剂诱发性关节炎中，抗IL-17A治疗降低了血清RANKL的关节炎相关性升
高为了评价IL-17A中和作用对AIA模型中的RANKL的影响，已确定患病的大鼠用以 下成分进行治疗20mg/kg同种型对照、单次4mg/kg或20mg/kg剂量的JL8. 18E10、或25mg/ kg剂量的TNF拮抗剂(依那西普)，每3天给予1次。在第8天(关节肿胀之前)、第14天 (抗体治疗后3天)和在第25天处死时，给大鼠放血。在各时间点测定血清RANKL，结果见 图16。仅需3天的JL8. 18E10治疗就可抑制血清RANKL的关节炎相关性升高，而3天的 TNF拮抗作用却不能有效调节血清RANKL。应当注意的是，在第14天，JL8. 18E10大鼠仍然 患有关节炎，但它们的血清RANKL水平已经正常了。上述出版物或文件的引用并不是承认任何上述文献都是现有技术，也不是承认这 些出版物或文件的内容或日期。以上引用的所有参考文献(出版物、检索号、专利申请和专 利)都特意通过引用结合到本文中，其程度如同每个出版物、检索号、专利申请或专利具体 而单独地指明通过引用结合到本文中一样。
权利要求
一种选择炎性关节病患者用IL 17A拮抗剂进行治疗的方法，所述方法包括a.将采自受试者的血清样品中至少一种关节破坏生物标记的水平与所述生物标记血清水平的正常范围进行比较；和b.如果所述受试者血清样品中所述关节破坏生物标记的水平在正常范围之外，就选择所述患者用IL 17A拮抗剂进行治疗。
2.权利要求1的方法，其中所述关节破坏生物标记选自软骨寡聚基质蛋白(C0MP)、I型 胶原的C-端交联端肽(CTX-I)、II型胶原的C-端交联端肽(CTX-II)、人软骨糖蛋白-39 (HC gp-39)、护骨蛋白(OPG)、NF κ B受体激活蛋白配体(RANKL)、骨钙蛋白和酒石酸抗性酸性磷 酸酶(TRACP)同工型釙。
3.权利要求1的方法，其中所述患者对用不同抗风湿药的先期治疗是炎症无反应者。
4.权利要求1的方法，其中所述患者对用不同抗风湿药的先期治疗是炎症反应者。
5.权利要求1的方法，其中所述关节破坏生物标记是RANKL、COMP或0PG。
6.权利要求5的方法，其中所述关节破坏生物标记是RANKL。
7.权利要求1的方法，其中所述比较步骤是在RANKL、COMP和OPG中的每一种上进行的。
8.权利要求1的方法，其中所述IL-17A拮抗剂是与人IL-17A结合并抑制其活性的单 克隆抗体或单克隆抗体片段。
9.权利要求8的方法，其中所述IL-17A拮抗剂是人源化单克隆抗体或完全人单克隆抗体。
10.权利要求8的方法，其中所述IL-17A拮抗剂是人源化单克隆抗体片段或完全人单 克隆抗体片段。
11.权利要求8的方法，其中所述单克隆抗体或单克隆抗体片段是加入聚乙二醇的。
12.权利要求1的方法，其中所述炎性关节病是类风湿性关节炎、银屑病性关节炎或关 节强直性脊椎炎。
13.权利要求12的方法，其中所述炎性关节病是类风湿性关节炎。
14.权利要求14的方法，其中所述IL-17A拮抗剂是包含具有SEQIDNO :1的轻链和具 有SEQ ID NO 2的重链的人源化单克隆抗体。
15.一种预测IL-17A拮抗剂对炎性关节病患者骨侵蚀的抑制功效的方法，所述方法包括a.在用IL-17A拮抗剂的初次治疗周期之前，测定采自所述患者的第一血清样品中至 少一种关节破坏生物标记的水平；b.在所述初次治疗周期结束时，测定采自所述患者的至少第二血清样品中所述关节破 坏生物标记的水平；和c.比较第一和第二血清样品中所述关节破坏生物标记的水平；其中与第一血清样品中的水平相比，第二血清样品中所述关节破坏生物标记的水平正 常化，就预测IL-17A拮抗剂很可能有效抑制所述患者的关节破坏，而且其中所述患者是人 或非人类动物。
16.权利要求15的方法，其中所述关节破坏生物标记选自软骨寡聚基质蛋白(C0MP)、 I型胶原的C-端交联端肽(CTX-I)、II型胶原的C-端交联端肽(CTX-II)、人软骨糖蛋白-39 (HC gp-39)、护骨蛋白(OPG) ,NFkB受体激活蛋白配体(RANKL)、骨钙蛋白和酒石酸 抗性酸性磷酸酶(TRACP)同工型5b。
17.权利要求15的方法，其中所述初次治疗周期是至少1周、至少2周、至少4周、至少 8周、至少12周、至少18周、至少24周或至少48周。
18.权利要求15的方法，所述方法还包括将第一和第二血清样品中生物标记的水平 与所述生物标记血清水平的正常范围进行比较，其中如果第一血清样品中所述关节破坏生 物标记的水平在正常范围之外，而第二血清样品中所述生物标记的水平落入正常范围之 内，则预测所述IL-17A拮抗剂能有效抑制所述患者的关节破坏。
19.权利要求15的方法，所述方法还包括在用IL-17A拮抗剂的至少一个后续治疗周 期结束时，测定采自所述患者的第三血清样品中所述关节破坏生物标记的水平，其中第三 血清样品中所述生物标记的水平比第二血清样品中所述生物标记的水平更正常化，则预测 所述IL-17A拮抗剂很可能有效抑制所述患者的关节破坏。
20.权利要求19的方法，其中所述后续治疗周期是至少12周、至少24周或至少48周。
21.权利要求15的方法，其中所述生物标记是RANKL、COMP或0PG。
22.权利要求15的方法，其中所述生物标记是RANKL。
23.权利要求15的方法，其中所述测定和比较步骤是在RANKL和COMP中的每一种或者 RANKL、COMP和OPG中的每一种上进行的。
24.权利要求15的方法，其中所述IL-17A拮抗剂是与IL-17A结合并抑制其活性的单 克隆抗体或单克隆抗体片段。
25.权利要求24的方法，其中所述患者是人，所述IL-17A拮抗剂是人源化单克隆抗体 或完全人单克隆抗体。
26.权利要求24的方法，其中所述患者是人，所述IL-17A拮抗剂是人源化单克隆抗体 片段或完全人单克隆抗体片段。
27.权利要求24的方法，其中所述单克隆抗体或单克隆抗体片段是加入聚乙二醇的。
28.权利要求24的方法，其中所述IL-17A拮抗剂是人源化单克隆抗体或完全人单克隆 抗体，而且在初次治疗周期期间，所述患者用所述抗体的一定剂量进行治疗，所述治疗显示 出能有效抑制炎性关节病患者群体的关节破坏。
29.权利要求15的方法，其中所述炎性关节病是类风湿性关节炎、银屑病性关节炎或 关节强直性脊椎炎。
30.权利要求29的方法，其中所述炎性关节病是类风湿性关节炎。
31.权利要求30的方法，其中所述IL-17A拮抗剂是包含具有SEQIDNO :1的轻链和具 有SEQ ID NO 2的重链的人源化单克隆抗体。
32.权利要求15的方法，其中所述患者对用不同抗风湿药的先期治疗是炎症无反应者ο
33.权利要求15的方法，其中所述患者对用不同抗风湿药的先期治疗是炎症反应者。
34.一种用IL-17A拮抗剂治疗患者的炎性关节病的方法，所述方法包括a.测定采自所述患者的第一血清样品中至少一种关节破坏生物标记的水平；b.在初次治疗周期期间，按照第一给药方案，将所述IL-17A拮抗剂给予所述患者；c.在初次治疗周期结束时，测定采自所述患者的至少第二血清样品中所述关节破坏生物标记的水平；和d.比较第一和第二血清样品中所述生物标记的水平；和e.如果第二血清样品中所述生物标记的水平在规定范围之内，则在至少一个后续治疗 周期期间，按照第一给药方案，将所述IL-17A拮抗剂给予所述患者；或f.如果第二血清样品中所述生物标记的水平在规定范围之外，则在至少一个后续治疗 周期期间，按照第二给药方案，将所述IL-17A拮抗剂给予所述患者，其中第二给药方案包 括在后续治疗周期期间所给予的IL-17A拮抗剂总量大于初次治疗周期所给予的总量，其中所述规定范围选自(i)未治疗的未患炎性关节病的受试者中存在的所述关节破坏生物标记的血清水平范 围；和( )在炎性关节病患者群体中测得的所述关节破坏生物标记的平均水平的置信区间 为至少80%所限定的范围，所述患者已按照第一给药方案用IL-17A拮抗剂治疗一段时间， 治疗时间等于初次治疗周期或者更长一些，其中在等于后续治疗周期或比后续治疗周期长 的时间周期期间，按照第一给药方案，在用IL-17A拮抗剂治疗后，所述群体表现出关节破 坏被抑制。
35.权利要求34的方法，其中所述关节破坏生物标记选自软骨寡聚基质蛋白(C0MP)、 I型胶原的C-端交联端肽(CTX-I)、II型胶原的C-端交联端肽(CTX-II)、人软骨糖蛋 白-39 (HC gp-39)、护骨蛋白(OPG) ,NFkB受体激活蛋白配体(RANKL)、骨钙蛋白和酒石酸 抗性酸性磷酸酶(TRACP)同工型5b。
36.权利要求34的方法，其中所述规定范围定义为在炎性疾病患者群体中测得的所述 关节破坏生物标记的平均水平的置信区间为至少85%、至少90%或至少95%，所述患者已 按照第一给药方案用IL-17A拮抗剂进行治疗，初次时间周期为至少4周，其中在后续治疗 周期为至少12周期间，按照第一给药方案，在用IL-17A拮抗剂治疗后，所述群体表现出关 节破坏被抑制。
37.权利要求34的方法，其中所述初次治疗周期为至少1周、至少2周、至少4周、至少 8周或至少12周。
38.权利要求34的方法，其中所述后续治疗周期为至少12周、至少24周或至少48周。
39.权利要求34的方法，其中所述关节破坏生物标记是RANKL。
40.权利要求34的方法，其中所述炎性关节病是类风湿性关节炎、银屑病性关节炎或 关节强直性脊椎炎。
41.权利要求34的方法，其中所述患者是人，所述炎性关节病是类风湿性关节炎，所述 IL-17A拮抗剂是包含具有SEQ ID NO :1的轻链和具有SEQ ID NO :2的重链的人源化单克 隆抗体。
42.权利要求34的方法，其中所述患者对用不同抗风湿药的先期治疗是炎症无反应者。
43.权利要求34的方法，其中所述患者对用不同抗风湿药的先期治疗是炎症反应者。
44.权利要求34的方法，其中所述IL-17拮抗剂是不与IL-23结合的抗体，所述方法 还包括在初次治疗周期期间、在后续治疗周期期间或同时在初次和后续治疗周期期间，将 IL-23拮抗剂给予所述患者。
45.一种用于治疗炎性关节病的药盒，其中所述药盒包括药物组合物和用于测定采 自患者的血清样品中至少一种关节破坏生物标记水平的试剂，其中所述药物组合物包含 IL-17A拮抗剂，所述关节破坏生物标记选自软骨寡聚基质蛋白(C0MP)、I型胶原的C-端交 联端肽(CTX-I)、II型胶原的C-端交联端肽(CTX-II)、人软骨糖蛋白-39 (HCgp-39)、护骨 蛋白(OPG)、NF κ B受体激活蛋白配体(RANKL)、骨钙蛋白和酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRACP) 同工型5b。
46.权利要求45的药盒，其中所述炎性关节病是类风湿性关节炎，所述IL-17A拮抗剂 是包含具有SEQ ID NO :1的轻链和具有SEQID NO :2的重链的人源化单克隆抗体，所述关节 破坏生物标记是RANKL。
47.一种用于治疗炎性关节病的制造的药物产品，所述产品包含含有IL-17A拮抗剂的 药物制剂和使用说明书，使用说明书用于在用IL-17A拮抗剂治疗之前和治疗期间测定患 者血清中至少一种关节破坏生物标记的水平。
48.权利要求47的制造的药物产品，其中所述关节破坏生物标记选自软骨寡聚基质蛋 白(COMP)、I型胶原的C-端交联端肽(CTX-I)、II型胶原的C-端交联端肽(CTX-II)、人软 骨糖蛋白-39 (HC gp-39)、护骨蛋白(OPG) ,NFkB受体激活蛋白配体(RANKL)、骨钙蛋白和 酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRACP)同工型5b。
49.权利要求47的制造的药物产品，其中所述使用说明书还包括推荐使用所述药物制 剂治疗在用不同抗风湿药的先期治疗之后所述生物标记水平异常的患者。
50.权利要求47的制造的药物产品，其中所述使用说明书还包括推荐使用所述药物制 剂治疗在用不同抗风湿药的先期治疗之后是炎症无反应者的患者。
51.权利要求43的制造的药物产品，其中所述炎性关节病是类风湿性关节炎，所述 IL-17A拮抗剂是包含具有SEQ ID NO 1的轻链和具有SEQ ID NO :2的重链的人源化单克 隆抗体，所述关节破坏生物标记是RANKL、COMP或0PG。
52.IL-17A拮抗剂在制备用于治疗炎性关节病患者以抑制关节破坏的药物中的用途， 其中所述患者在用不同抗风湿治疗的先期治疗之后至少一种关节破坏生物标记水平异常。
53.权利要求52的用途，其中所述关节破坏生物标记选自软骨寡聚基质蛋白(COMP)、 I型胶原的C-端交联端肽(CTX-I)、II型胶原的C-端交联端肽(CTX-II)、人软骨糖蛋 白-39 (HC gp-39)、护骨蛋白(OPG) ,NFkB受体激活蛋白配体(RANKL)、骨钙蛋白和酒石酸 抗性酸性磷酸酶(TRACP)同工型5b。
54.权利要求52的用途，其中所述患者对用不同抗风湿治疗是炎症无反应者。
55.权利要求52的用途，其中所述患者对用不同抗风湿治疗是炎症反应者。
56.权利要求52的用途，其中所述IL-17A拮抗剂是包含具有SEQIDNO 1的轻链和具 有SEQ ID N0:2的重链的人源化单克隆抗体，所述关节破坏生物标记是RANKL、C0MP或0PG。
全文摘要
本发明公开了用于治疗类风湿性关节炎和相关关节炎性皮疹等炎性关节病的新的方法和药物产品。所述方法和产品使用骨和软骨代谢或破坏的各种血清标记，包括软骨寡聚基质蛋白(COMP)和NFB受体激活蛋白配体(RANKL)，作为评价炎性关节病中IL-17A拮抗剂对关节破坏的效果的生物标记。
文档编号G01N33/50GK101932935SQ200880103506
公开日2010年12月29日 申请日期2008年6月20日 优先权日2007年6月20日
发明者C·朝, E·P·鲍曼, S·-J·陈 申请人:先灵公司