专利名称：玉米浸泡水中提取、提纯脂多糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种脂多糖提取、提纯的方法，特别是从玉米浸泡水中提取、提纯脂多糖的方法背景技术在现有技术中，采用乙醇分布沉淀法提取脂多糖，会使大量蛋白质随脂多糖一起沉淀，得到的产品中脂多糖的含量很低(＜3％)，在此基础上，尽管采用了离子交换色谱法进行纯化，产品纯度仍不理想(90％左右)。
发明内容
本发明的目的是克服以上不足，提供一种提取、提纯脂多糖的方法，本方法可以大大减化脂多糖的提取、提纯操作步骤，同时明显提高最终产品的纯度。
本发明的目的通过以下措施实现采用超滤法、等电点法、三氯乙酸法三种方法联合分离玉米浸泡水中的蛋白质，再用纳滤膜将浸泡水浓缩，并通过乙醇沉淀法进一步分离浸泡水中的蛋白质，最后，用活性炭将脂多糖从浸泡水中提取出来1、等电点法分离蛋白及普通多糖用饱和氢氧化钠溶液调节浸泡水中的PH值到7.3，将浸泡液通过分离机分离，在每分钟3000转转速下离心25分钟，分离沉淀上清液。
2、超滤法分离蛋白及普通多糖选用截留分子量10万的超滤膜，对上述上清液进行超滤，取过滤液。
3、三氯乙酸法分离蛋白及普通多糖
在上述滤液中加入占其体积0.5％的三氯乙酸，搅拌30分钟，于每分钟3000转条件下离心25分钟，分离出上清液。
4、浓缩采用纳米过滤装置，将分离蛋白及普通多糖后的浸泡水浓缩6-10倍，经纳滤膜过滤，取浓缩后的浸泡水。所述的纳滤膜为聚酰胺管式膜，膜面积0,8-1.2平方米，纯水通量为每小时每平方米180-220升。
5、再分离用乙醇沉淀法进一步分离蛋白质和一般多糖加入浓度为95％的乙醇，使浸泡水中乙醇浓度达到30％，搅拌5分钟，于每分钟2600转下离心30分钟，分离出上清液。
6、提取将上述上清液PH值调整为6.50，加入占其重量1.5-2.5％的经处理的活性炭，搅拌15分钟，静置10分钟，最后过滤，分离取出吸附了脂多糖活性炭。
活性炭使用前处理方法如下将蒸馏水和发烟硝酸按1∶1混合，将活性炭粉末倒入其中并浸泡5小时，浸泡温度为70～80℃。浸泡后放走酸水，用蒸馏水反复冲洗至中性。
7、提纯将吸附了脂多糖的活性炭装填于1.6×90厘米的色谱柱中，用10毫摩尔每升三羟甲基氨基甲烷-盐酸/10毫摩尔每升氯化钠进行洗脱，洗脱液流速为每小时8毫升，分步收集洗脱液，每管收集4毫升，共收集52管，将第27～36管洗脱液合并，冷冻干燥。
将DEAE-葡聚糖凝胶A-50装填于1.6×40厘米的色谱柱中。取上述干燥产物0.25克，溶于6毫升的10毫摩尔每升三羟甲基氨基甲烷-盐酸/10毫摩尔每升氯化钠中，将其加入色谱柱。用浓度依次增加的三羟甲基氨基甲烷-盐酸/氯化钠溶液进行洗脱，同时进行分步收集。每管收集6毫升，共收集60根管，洗脱剂流速为每小时8毫升。
8、脱盐将第34～52根管的洗脱液合并，用葡聚糖凝胶G-15层析柱进行脱盐，以超纯水洗脱，最后冻干得到脂多糖成品。
本发明的效果在于在简化了操作步骤的同时，明显的提高了脂多糖产品的纯度。所得产品中脂多糖含量达97.4％以上。
具体实施例方式
实施例1制药过程中玉米浸泡水提取、提纯脂多糖的方法如下1、等电点法分离蛋白及普通多糖用饱和氢氧化钠溶液调节浸泡水中的PH值到7.3，将浸泡液通过分离机分离，在每分钟3000转转速下离心25分钟，分离沉淀上清液。
2、超滤法分离蛋白及普通多糖选用截留分子量10万的超滤膜，对上述上清液进行超滤，取过滤液。
3、三氯乙酸法分离蛋白及普通多糖在上述滤液中加入占其体积0.5％的三氯乙酸，搅拌30分钟，于每分钟3000转条件下离心25分钟，分离出上清液。
4、浓缩采用纳米过滤装置，将分离蛋白及普通多糖后的浸泡水浓缩8倍，经纳滤膜过滤，取浓缩后的浸泡水。所述的纳滤膜为聚酰胺管式膜，膜面积1平方米，纯水通量为每小时每平方米200升。
5、再分离用乙醇沉淀法进一步分离蛋白质和一般多糖加入浓度为95％的乙醇，使浸泡水中乙醇浓度达到30％，搅拌5分钟，于每分钟2600转下离心30分钟，分离出上清液。
6、提取将上述上清液PH值调整为6.50，加入占其重量2％的经处理的活性炭，搅拌15分钟，静置10分钟，最后过滤，分离取出吸附了脂多糖活性炭。
活性炭使用前处理方法如下将蒸馏水和发烟硝酸按1∶1混合，将活性炭粉末倒入其中并浸泡5小时，浸泡温度保持在70～80℃。浸泡后放走酸水，用蒸馏水反复冲洗至中性。
7、提纯将吸附了脂多糖的活性炭装填于1.6×90厘米的色谱柱中，用10毫摩尔每升三羟甲基氨基甲烷-盐酸/10毫摩尔每升氯化钠进行洗脱，洗脱液流速为每小时8毫升，分步收集洗脱液，每管收集4毫升，共收集52管，将第27～36管洗脱液合并，冷冻干燥。
将DEAE-葡聚糖凝胶A-50装填于1.6×40厘米的色谱柱中。取上述干燥产物0.25克，溶于6毫升的10毫摩尔每升三羟甲基氨基甲烷-盐酸/10毫摩尔每升氯化钠中，将其加入色谱柱。用浓度依次增加的三羟甲基氨基甲烷-盐酸/氯化钠溶液进行洗脱，同时进行分步收集。每管收集6毫升，共收集60根管，洗脱剂流速为每小时8毫升。
8、脱盐将第34～52根管的洗脱液合并，用葡聚糖凝胶G-15层析柱进行脱盐，以超纯水洗脱，最后冻干得到脂多糖成品。
权利要求
1.一种玉米浸泡水中提取、提纯脂多糖的方法，其特征是本方法通过分别采用超滤法、等电点法、三氯乙酸法三种方法分离玉米浸泡水中的蛋白质，再用纳滤膜将浸泡水浓缩，并通过乙醇沉淀法进一步分离浸泡水中的蛋白质，最后，用活性炭将脂多糖从浸泡水中提取出来(1)等电点法分离蛋白及普通多糖用饱和氢氧化钠溶液调节浸泡水中的PH值到7.3，将浸泡液通过分离机分离，在每分钟3000转转速下离心25分钟，分离沉淀上清液；(2)超滤法分离蛋白及普通多糖选用截留分子量10万的超滤膜，对上述上清液进行超滤，取过滤液；(3)三氯乙酸法分离蛋白及普通多糖在上述滤液中加入占其体积0.5％的三氯乙酸，搅拌30分钟，于每分钟3000转条件下离心25分钟，分离出含蛋白及普通多糖的上清液；(4)浓缩采用纳米过滤装置，将分离蛋白及普通多糖后的浸泡水浓缩6-10倍，经纳滤膜过滤，取浓缩后的浸泡水；(5)再分离在上述浓缩浸泡水中加入浓度为95％的乙醇，使浸泡水中乙醇浓度达到30％，搅拌5分钟，于每分钟2600转下离心30分钟，分离后取上清液；(6)提取将上述上清液PH值调整为6.50，加入占其重量1.5-2.5％的经处理的活性炭，搅拌15分钟，静置10分钟，最后过滤，分离取出吸附了脂多糖活性炭；(7)提纯将吸附了脂多糖的活性炭装填于1.6×90厘米的色谱柱中，用10毫摩尔每升三羟甲基氨基甲烷-盐酸/10毫摩尔每升氯化钠进行洗脱，洗脱液流速为每小时8毫升，分步收集洗脱液，每管收集4毫升，共收集52管，将第27～36管洗脱液合并，冷冻干燥；将DEAE-葡聚糖凝胶A-50装填于1.6×40厘米的色谱柱中。取上述干燥产物0.25克，溶于6毫升的10毫摩尔每升三羟甲基氨基甲烷-盐酸/10毫摩尔每升氯化钠中，将其加入色谱柱。用浓度依次增加的三羟甲基氨基甲烷-盐酸/氯化钠溶液进行洗脱，同时进行分步收集。每管收集6毫升，共收集60根管，洗脱剂流速为每小时8毫升；(8)脱盐将第34～52根管的洗脱液合并，用葡聚糖凝胶G-15层析柱进行脱盐，以超纯水洗脱，最后冻干得到脂多糖成品。
2.根据权利要求1所述的玉米浸泡水中提取、提纯脂多糖的方法，其特征是所述的活性炭使用前处理方法是将蒸馏水和发烟硝酸按1∶1混合，将活性炭粉末倒入其中并浸泡5小时，浸泡温度为70～80℃。浸泡后放走酸水，用蒸馏水反复冲洗至中性。
3.根据权利要求1或2所述的玉米浸泡水中提取、提纯脂多糖的方法，其特征是所述的纳滤膜为聚酰胺管式膜，膜面积0，8-1.2平方米，纯水通量为每小时每平方米180-220升。
全文摘要
本发明提供一种在玉米浸泡水中提取、提纯脂多糖的方法。先通过等电点法、超滤法、三氯乙酸法联合使用分离浸泡水中的蛋白质，经进行纳滤膜浓缩，再用乙醇沉淀法进一步分离蛋白质，然后用活性炭提取浸泡水中的脂多糖，通过活性炭色谱法和离子交换色谱法提纯脂多糖，最终得到的脂多糖产品纯度高达97.4％以上。
文档编号C08B37/00GK1546532SQ200310109680
公开日2004年11月17日 申请日期2003年11月28日 优先权日2003年11月28日
发明者钱东平, 曲保雪, 杨世凤, 霍晓静, 牛晓颖, 孟祥书, 李瑞奇, 杨晓娟, 齐晓娜 申请人:河北农业大学