哺乳动物组织中多潜能干细胞的分离培养的制作方法

本发明涉及一种从哺乳动物组织器官中分离培养多潜能干细胞方法。

背景技术：

目前，公知的从哺乳动物受孕中期羊水中分离多潜能干细胞的方法有免疫磁珠法、两期培养法。而这两种方法均不能从人和哺乳动物组织器官中分离培养多潜能干细胞。本发明提供一种多潜能干细胞分离培养方法，该方法采用低浓度胰酶培养液培养哺乳动物组织原代细胞，从而分离培养组织中多潜能干细胞。

技术实现要素：

为了从哺乳动物组织中分离培养多潜能干细胞，本发明提供一种方法，该方法能够从哺乳动物组织中分离培养具有发育全能性潜能的干细胞。

本发明从哺乳动物组织中分离培养多潜能干细胞的技术方案是：在无血清的干细胞培养液中加入低浓度胰蛋白酶。用此培养液培养哺乳动物组织原代细胞可获得多潜能干细胞。其中，无血清的干细胞培养液可以保证在对组织原代细胞培养过程中多潜能干细胞不发生分化，低浓度胰蛋白酶对组织中多潜能干细胞起到一种筛选作用。

本发明的有益效果是，能够从哺乳动物组织中分离培养多潜能干细胞。哺乳动物组织中存在的多潜能干细胞是研究哺乳动物的许多疾病如遗传缺陷、肿瘤以及外源性病毒感染机理的理想细胞。

附图说明

下面结合附图和实例对本发明进一步说明

图1是绵羊胎儿肾组织多潜能干细胞；

图2是绵羊胎儿肾组织多潜能干细胞表达Oct4、SSEA-1的实时定量扩增曲线，其中，2.1为内参基因3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)，2.2为SSEA-1，2.3为Oct4；

图3是绵羊胎儿肾组织多潜能干细胞体外悬浮培养7天后形成的类胚体。

具体实施方式

图1中绵羊胎儿肾组织多潜能干细胞获得的具体步骤为：

1.配液

培养液I：DMEM+1％L-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％丙酮酸钠+微量β-巯基乙醇+5ng或500u/ml LIF+5ng/ml bFGF，用0.22μl的滤器过滤，4℃保存；培养液II：培养液I+15％FBS；培养液III：培养液I+0.01％胰蛋白酶，用0.22μl的滤器过滤，4℃保存。

2.绵羊胎儿肾组织多潜能干细胞分离培养

无菌条件下，采用组织机械分离方法分离、培养绵羊胎儿肾组织原代细胞，培养液II37℃5％CO2饱和湿度条件下培养48小时；待细胞克隆出现后用D-PBS洗3遍，而后加入培养液III，37℃5％CO2饱和湿度条件下培养18小时；1500r/min×5min离心收集细胞，用培养液II悬浮细胞，吹均，以105细胞/皿接种于6cm培养皿中，72小时后出现细胞克隆(图1)；传3～4代后冻存备用。

图2的具体步骤为

提取绵羊胎儿肾组织totalRNA，反转录前进行基因组DNA去除反应，然后反转录合成其cDNA，内参为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，引物信息见表1，Real Time PCR按照TaKaRa SYBR PremixEX TaqTM IIkit说明进行，每个样品3个重复(图2)。

基因组DNA去除反应：

两步法real time PCR标准程序：

表1 Real Time PCR引物序列

图3的具体步骤为

取生长状态好，形态良好的第5代绵羊胎儿肾组织多潜能干细胞，待细胞生长达到80％汇合度时，无菌条件下，D-PBS洗3遍，胰酶消化悬浮细胞，1500r/min×5min离心收集细胞，类胚体培养液(DMEM+15％FBS)重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/ml；6cm培养皿内加入15ml D-PBS，以20ul为一小滴并滴加在皿盖内侧；皿盖倒转盖在皿上，于37℃5％CO2饱和湿度条件下悬浮培养；7d后，无菌操作，收集小滴于6cm培养皿内，至显微镜下观察、拍照(图3)。