提高胶原纤维材料抗拉强度的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，包括以下步骤：1)用醋酸溶液溶解天然胶原蛋白，并对磷酸盐缓冲溶液透析，得到胶原浓度为1?20mg/mL、pH为6.0?9.0的胶原溶液；2)将胶原溶液转入置于离心机中的离心管内，离心5?120分钟；所述离心机的转子为水平转子；3)将离心管垂直置于水浴或恒温培养箱中，静置2?48小时得到胶原胶；4)将胶原胶置于0.5%?10%的戊二醛水溶液中交联1?24h，随后用蒸馏水反复漂洗；5)自然干燥12?36小时后，置于鼓风干燥箱中，继续干燥12?36小时，得到胶原纤维材料。本发明方法制备的胶原纤维材料中胶原纤维具有一致的排列方向趋势，材料的抗拉强度得以明显提升。
【专利说明】提高胶原纤维材料抗拉强度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学生物材料【技术领域】，具体涉及一种提高胶原纤维材料抗拉强度的 方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，天然胶原（特别是I型胶原）在生物医学材料、医学组织工程、医学美容 等领域得到了越来越广泛的应用。如胶原海绵在创伤修复、快速止血中的应用；胶原胶在面 部皮肤除皱、靶向药物制备及药物缓释中的应用；胶原复合材料在人造血管、人造皮肤和骨 骼、人工眼角膜移植以及人造跟腱和肌腱/韧带等医学组织工程中的应用。
[0003] 良好的抗拉强度是医学组织工程材料要求的一项重要指标。如人造跟腱、人造肌 腱材料在植入跟腱或肌腱/韧带的缺损部位后，不仅要求材料具有良好的诱导细胞生长功 能，同时要求材料具有较好的抗拉强度以承受人体运动应力并确保材料在机体自身组织修 复完整之前保持良好的材料形态和力学性能。但是，现有的胶原基生物材料抗拉伸强度往 往不能满足医学组装工程应用的实际需求。
[0004] 自组装（胶原纤维重组）是天然胶原的重要分子行为特征。研究发现，生物体内以 自组装模式形成的胶原纤维在热稳定性、耐酶降解性和生物力学性能等方面均显著优于胶 原单体分子的体外性能表现。因此，利用纤维重组的方法制备胶原基生物材料成为提升胶 原材料各项性能的一种有效手段。如，中国授权发明专利CN100372579C提供了一种含有自 体组织化磷灰石-胶原复合体的交联磷灰石-胶原多孔体及其制备方法，该方法利用纤维 重组技术制备哺乳动物胶原和磷灰石的复合材料，可用于骨组织工程；中国授权发明专利 CN101323670B公开了一种医用级重建胶原交联改性的方法，该方法利用纤维重组技术改进 胶原的性能并应用于医用生物材料。
[0005] 胶原的体外纤维重组分为成核、纤维成长和平衡三个阶段。其中，成核阶段是数个 胶原单分子有序聚集形成胶原微纤维的过程，该过程中胶原微纤维的形态、分布决定了最 终胶原纤维的形态分布。在正常情况下，胶原微纤维的分布和取向是完全随机的，因此最终 获得的重组胶原纤维材料中胶原纤维的分布方向也是各向同性的。为了满足医学组织工程 领域的需求，特别是对材料抗拉强度的要求，有学者尝试制备具有相同取向分布的胶原纤 维材料。如，利用电场、磁场或流体力学诱导的方法在胶原纤维重组过程中驱使胶原纤维分 布方向趋于一致。中国发明专利CN102341436A公开了一种取向胶原凝胶的制备方法，该方 法利用纤维重组技术结合流体力学作用制备具有高度取向的胶原凝胶。这种具有一致纤维 取向的材料的优势在于：由于胶原纤维分布方向一致，从而极大地提高了材料的抗拉伸强 度，同时，在医学组织工程领域中，这种材料能诱导细胞沿纤维取向方向迁移和增殖，从而 能更快地修复跟腱、肌腱/韧带组织。但是，这种利用电场、磁场或流体力学诱导的制备方 法亦存在不足，如操作条件要求高、所需仪器设备复杂、不能实现大规模样品的制备等。本 发明提供了一种简便方法以制备具有相同纤维取向趋势的胶原纤维材料。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种简便且能有效增强胶原纤维材料抗拉强 度的方法，以满足人工跟腱、肌腱等医用材料对材料抗拉性能的要求。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
[0008] 1)在冰浴条件下，用醋酸水溶液溶解天然胶原蛋白，并对磷酸盐缓冲溶液（即 PBS)透析以调节胶原溶液pH，得到胶原浓度为1?20mg/mL、pH为6. 0?9. 0的胶原溶液；
[0009] 2)将胶原溶液转入置于离心机中的离心管内，在15?45°C条件下，控制相对离心 力为1?30g，离心5?120分钟；所述离心机的转子为水平转子（swing-out rotor);
[0010] 3)将步骤2)处理后的离心管垂直置于25?45°C水浴或恒温培养箱中，静置2? 48小时得到胶原胶；
[0011] 4)在室温条件下，将步骤3)得到的胶原胶置于0. 5%?10%的戊二醛水溶液中交 联1?24h，随后用蒸馏水反复漂洗；
[0012] 5)在室温条件下，将步骤4)得到的交联胶原胶自然干燥12?36小时后，置于鼓 风干燥箱中，在25?45°C条件下继续干燥12?36小时，得到胶原纤维材料。
[0013] 进一步地，所述步骤5)在自然干燥过程中，将胶原胶的一端垂直向下固定，向另 一端持续施加〇· 1?ION的垂直拉力。
[0014] 进一步地，所述步骤1)中，所述天然胶原是从哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤、 跟腱组织中提取并分离纯化的具有完整三螺旋分子结构的天然胶原。
[0015] 进一步地，所述步骤1)中，所述醋酸水溶液的浓度为0. 1?I. Omol/L，对磷酸盐缓 冲溶液透析的温度为〇?10°c。
[0016] 进一步地，所述步骤2)的离心条件为：温度为20?30°C，相对离心力为3?10g， 离心时间为5?20分钟。
[0017] 进一步地，所述步骤3)中，水浴或恒温培养箱的温度为25?45°C，静置时间为 12?36小时。
[0018] 进一步地，所述步骤4)中，戊二醛水溶液的浓度为0.5%?3%，交联时间为12? 24h。
[0019] 本发明具有以下优点：
[0020] 由于胶原的体外纤维重组分为成核、纤维成长和平衡三个阶段，其中，成核阶段胶 原纤维核的排列方向直接决定了最终胶原纤维的排列取向。发明人发现，在胶原组装的成 核阶段对组装体系进行离心处理，在离心力的作用下，胶原纤维核能沿离心力方向排布，并 在后续组装的纤维成长阶段保持这种排列趋势。在此基础上，在干燥过程中针对胶原胶进 一步施加与离心力方向相同的拉伸力，可以使胶原纤维取向更进一步的趋于一致，从而得 到具有更高抗拉强度的胶原纤维材料。该方法与现有的具有一致性取向胶原纤维材料的制 备方法相比，更加简便易行，且能够开展较大规模的材料制备。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为实施例1制备得到的胶原纤维材料用扫描电镜观察胶原纤维的电镜图谱。 (fii头标注为尚心力方向）
[0022] 图2为实施例2制备得到的胶原纤维材料用扫描电镜观察胶原纤维的电镜图谱。 (fii头标注为尚心力方向）
[0023] 图3为对比例制备得到的胶原纤维材料用扫描电镜观察胶原纤维的电镜图谱。
[0024] 图4为实施例1、实施例2和对比例制备得到的胶原纤维材料的拉伸强度对比图 (每组测定材料样品数η = 10)。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0026] 本发明所设计的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法包括以下步骤：
[0027] 1)在冰浴条件下，用醋酸水溶液溶解天然胶原蛋白，并对磷酸盐缓冲溶液（即 PBS)透析以调节胶原溶液pH，得到胶原浓度为1?20mg/mL、pH为6. 0?9. 0的胶原溶液； 醋酸水溶液的浓度为〇. 1?I. Omol/L，对磷酸盐缓冲溶液透析的温度为0?KTC ;
[0028] 2)将胶原溶液转入置于离心机中的离心管内，在15?45°C条件下，控制相对离心 力为1?30g，离心5?120分钟；所述离心机的转子为水平转子；
[0029] 3)将步骤2)处理后的离心管垂直置于25?45°C水浴或恒温培养箱中，静置2? 48小时得到胶原胶；
[0030] 4)在室温条件下，将步骤3)得到的胶原胶置于0. 5%?10%的戊二醛水溶液中交 联1?24h，随后用蒸馏水反复漂洗；
[0031] 5)在室温条件下，将步骤4)得到的交联胶原胶自然干燥12?36小时后，置于鼓 风干燥箱中，在25?45°C条件下继续干燥12?36小时，得到胶原纤维材料。
[0032] 实施例1
[0033] 在冰浴条件下，用0. 5mol/L的醋酸水溶液溶解提取自草鱼鱼皮的I型胶原蛋白。 在4°C条件下对磷酸盐缓冲溶液透析使胶原溶液的pH调整为7. 0,得到浓度为3mg/mL的胶 原溶液。将胶原溶液转移至IOmL离心管中，在25°C、相对离心力3g条件下离心5分钟。随 后将离心管小心、垂直的取出并垂直转移至恒温箱中，30°C条件下继续静置24小时。从离 心管中取出胶原胶，转移至1 %的戊二醛溶液中交联24h，随后取出胶原胶并用蒸馏水反复 洗涤；然后在室温条件下，将胶原胶的一端垂直固定，向另一端持续施加〇. 7牛的垂直向下 拉力，自然干燥24小时之后将胶原胶转移至鼓风干燥箱中30°C条件下继续干燥24小时后 得到胶原纤维材料。
[0034] 实施例2
[0035] 在冰浴条件下，用0. 5mol/L的醋酸水溶液溶解提取自草鱼鱼皮的I型胶原蛋白。 在4°C条件下对磷酸盐缓冲溶液透析使胶原溶液的pH调整为7. 0,得到浓度为3mg/mL的胶 原酸溶液。将胶原溶液转移至IOmL离心管中，在25°C、离心力3g条件下离心5分钟。随后 将离心管小心、垂直的取出并垂直转移至恒温箱中，30°C条件下继续静置24小时。从离心 管中取出胶原胶，转移至1 %的戊二醛溶液中交联24h，随后取出胶原胶并用蒸馏水反复洗 涤；然后在室温条件下自然干燥24小时之后将胶原胶转移至鼓风干燥箱中30°C条件下继 续干燥24小时后得到胶原纤维材料。
[0036] 对比例
[0037] 在冰浴条件下，用0. 5mol/L的醋酸水溶液溶解提取自草鱼鱼皮的I型胶原蛋白。 在4°C条件下对磷酸盐缓冲溶液透析使胶原溶液的pH调整为7. 0,得到浓度为3mg/mL的 胶原酸溶液。将胶原溶液转移至IOmL离心管中，垂直转移至恒温箱中，30°C条件下静置24 小时。从离心管中取出胶原胶，转移至1 %的戊二醛溶液中交联24h，随后取出胶原胶并用 蒸馏水反复洗涤；然后在室温条件下自然干燥24小时之后将胶原胶转移至鼓风干燥箱中 30°C条件下继续干燥24小时后得到胶原纤维材料。
[0038] 从图1-3的扫描电镜的图谱可以发现，相较于对比例中胶原纤维完全随机的排列 方式，实施例2中胶原纤维出现了明显的沿离心力方向排列的趋势。而在干燥阶段施加垂 直拉力后，实施例1中胶原纤维的这种取向性排列趋势更加明显。
[0039] 从图4中可以观察到，实施例2胶原材料的拉伸强度与对比例方法制备得到的材 料差异极显著（P < 〇.〇1)，说明采用本发明方法后，胶原材料的抗拉伸力学性能得以显著 提升。同时，与实施例2胶原材料相比，实施例1胶原材料的拉伸强度又有了进一步提高， 说明在干燥阶段施加垂直拉力可以进一步增强本发明的有益效果。
【权利要求】
1. 一种提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，包括在冰浴条件下用醋酸水溶液溶解天 然胶原制备胶原溶液的步骤、对磷酸盐缓冲溶液透析以调节胶原溶液PH的步骤，其特征在 于：经以上步骤处理后，所得胶原溶液浓度为1?20mg/mL、pH为6. O?9. O ;然后再进行以 下步骤： 1) 将胶原溶液转入置于离心机中的离心管内，在15?45°C条件下，控制相对离心力为 1?30g，离心5?120分钟；所述离心机的转子为水平转子； 2) 将步骤1)处理后的离心管垂直置于25?45°C水浴或恒温培养箱中，静置2?48 小时得到胶原胶； 3) 在室温条件下，将步骤2)得到的胶原胶置于0. 5%?10%的戊二醛水溶液中交联 1?24h，随后用蒸馏水反复漂洗； 4) 在室温条件下，将步骤3)得到的交联胶原胶自然干燥12?36小时后，置于鼓风干 燥箱中，在25?45°C条件下继续干燥12?36小时，得到胶原纤维材料。
2. 根据权利要求1所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于：所述步骤 4)在自然干燥过程中，将胶原胶的一端垂直向下固定，向另一端持续施加0. 1?ION的垂直 拉力。
3. 根据权利要求1或2所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于：所述 天然胶原是从哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤、跟腱组织中提取并分离纯化的具有完整三 螺旋分子结构的天然胶原。
4. 根据权利要求1或2所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于：所述 步骤1)的离心条件为：温度为20?30°C，相对离心力为3?10g，离心时间为5?20分 钟。
5. 根据权利要求3所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于：所述步骤 1) 的离心条件为：温度为20?30°C，相对离心力为3?10g，离心时间为5?20分钟。
6. 根据权利要求1或2所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于：所述 步骤2)中，水浴或恒温培养箱的温度为25?45°C，静置时间为12?36小时。
7. 根据权利要求3所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于：所述步骤 2) 中，水浴或恒温培养箱的温度为25?45°C，静置时间为12?36小时。
8. 根据权利要求1或2所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于：所述 步骤3)中，戊二醛水溶液的浓度为0.5%?3%，交联时间为12?24h。
9. 根据权利要求3所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于：所述步骤 3) 中，戊二醛水溶液的浓度为0. 5%?3%，交联时间为12?24h。
10. 根据权利要求1或2所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于：所 述步骤1)中，所述醋酸水溶液的浓度为0. 1?I. Omol/L，对磷酸盐缓冲溶液透析的温度为 0 ?KTC。
【文档编号】C08J3/24GK104213238SQ201410392802
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月11日 优先权日:2014年8月11日
【发明者】汪海波, 赵燕, 汪海婴 申请人:武汉轻工大学