本发明系关于一种筛检华人中过敏性鼻炎之高危险群或区分鼻炎类型的方法，尤其关于经由测定抗原胜肽转运蛋白质1(antigen peptide transporter 1，TAP1)的对偶基因中转译第637位置的氨基酸(TAP1-637)的密码子，以于华人中筛检过敏性鼻炎的高危险群或区分鼻炎类型的方法。
背景技术：
过敏性鼻炎(allergic rhinitis)是指有过敏体质的人，对于环境当中的一些过敏原，例如灰尘、霉菌、花粉、尘螨、动物的毛屑、特定食物，或者气候变化、空气污染等因素过度敏感所造成的过敏现像，通常与家族性的遗传有关。过敏性鼻炎的典型症状包括打喷嚏、鼻子痒、流鼻水、鼻塞、眼睛痒、喉咙痒、慢性咳嗽、经口呼吸、夜间打鼾等，长期出现前述症状，可能进一步导致病患出现头晕、头痛、精神不济、失眠等症状，严重影响病患之生活品质。
目前临床上对于过敏性鼻炎的诊断方法，主要是根据病患持续性出现典型的过敏性鼻炎症状，再辅以血液常规检查，例如检验免疫球蛋白E(IgE)及/或嗜伊红性白血球(eosinophils)在血液中的浓度，若病患持续出现典型的过敏性鼻炎症状，且血液中IgE及/或嗜伊红性白血球的浓度升高，则表示患者很有可能已 罹患过敏性鼻炎。然而，前述传统的诊断方法，无法在易罹患过敏性鼻炎的患者发病之前就进行诊断，因此，过敏性鼻炎的高危险群(例如，因家族遗传而导致罹患过敏性鼻炎的机率大幅提高者)无法在发病之前就先确诊，故无从提早预防罹患过敏性鼻炎。
抗原胜肽转运蛋白质(antigen peptide transporter，简称「TAP」)为抗原胜肽转运蛋白质1(antigen peptide transporter1，或称为transporter antigen peptide 1，简称「TAP1」)与抗原胜肽转运蛋白质2(antigen peptide transporter 2，或称为transporter antigen peptide 2，简称「TAP2」)所形成的异二聚体蛋白质，分别由TAP1基因以及TAP2基因所编码。TAP可将胜肽由细胞质运送至内质网中。
TAP1及TAP2各具有一疏水性穿膜区域(domain)与一ATP-结合区域(ATP-binding domain)。先前研究发现，TAP1基因及TAP2基因的基因多态性(polymorphisms)包括第333号位置的氨基酸(位于疏水性穿膜区域)，以及第637号位置的氨基酸(位于ATP-结合区域)，其中，TAP第333号位置及/或第637号位置的氨基酸的变异可能会改变基质的特异性及TAP的功能。研究显示，以罹患过敏性鼻炎的日本人作为研究个体，TAP1的多态性与过敏性鼻炎之间并无关联性(参见Takeuchi K等人的文献，Lack of association between gene polymorphism of transporters associated with antigen processing and allergic rhinitis in a Japanese population.Ann Otol Rhinol Laryngol.2002；111:460–463，该文献全文并于此处以供参考)。
然而，本案发明人研究后意外发现，对于华人而言，TAP1的对偶基因中转译第637位置的氨基酸(TAP1-637)的密码子以及第333位置的氨基酸(TAP1-333)的密码子(codon)的多态性则与过敏性鼻炎之间存在高度的关联性。因此。可通过TAP1的对偶基因中转译第637位置的氨基酸(TAP1-637)的密码子以及第333位置的氨基酸(TAP1-333)的密码子(codon)的检测，来筛检华人中过敏性鼻炎的高危险群及/或区分鼻炎类型。
技术实现要素：
本发明的一目的，在于提供一种体外筛检过敏性鼻炎的高危险群的方法，包括：(1)检测一受筛检个体的检体中抗原胜肽转运蛋白质1(antigen peptide transporter 1，TAP1)之对偶基因中转译第637位置之氨基酸(TAP1-637)的密码子，其中该受筛检个体一华人；以及(2)判断步骤(1)的测定结果，当步骤(1)的测定结果显示该对偶基因序列的二TAP1-637的密码子皆对应甘氨酸(glycine，Gly)，则该受筛检个体为过敏性鼻炎的高危险群。
本发明的另一目的，在于提供一种区分鼻炎类型的方法，包括：(1)检测一受检测个体的检体中抗原胜肽转运蛋白质1的对偶基因中转译第637位置的氨基酸(TAP1-637)的密码子，其中该个体为一患有鼻炎的华人；以及(2)判断步骤(1)的测定结果，当步骤(1)的测定结果显示该对偶基因序列的二TAP1-637的密码子皆对应甘氨酸，则所述鼻炎为过敏性鼻炎。
本发明的详细技术内容及部分具体实施态样，将描述于以下内 容中，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明之特征。
附图说明
第1图所示为基因组DNA进行ARMS-PCR后进行电泳分析的电泳图，其中，泳道「M」为电泳标记物(marker)；泳道1为Val-333与Ile-333的异型体；泳道2为Ile-333的同型体；泳道3为Asp-637与Gly-636的异型体；泳道4为Asp-637的同型体。
具体实施方式
以下将描述根据本发明的部分具体实施态样；但是，在不背离本发明精神下，本发明尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述者。此外，除非文中有另外说明，于本说明书中(尤其是在权利要求中)所使用之「一」、「该」及类似用语应理解为包含单数及复数形式。
本案发明人发现，TAP1-637的多态性与华人的过敏性鼻炎有关，若一受筛检个体的对偶基因序列的二TAP1-637的密码子皆对应甘氨酸(Gly-637)，则该受筛检个体为过敏性鼻炎之高危险群，而若该华人本身已为鼻炎患者(例如，已出现鼻炎之症状)，则该鼻炎为过敏性鼻炎。
因此，本发明提供一种体外筛检过敏性鼻炎的高危险群的方法，所述方法包括：(1)检测一受筛检个体的该检体中TAP1的对偶基因中转译第637位置的氨基酸(TAP1-637)的密码子，其中该受筛检个体为一华人；以及(2)判断步骤(1)的测定结果，当步骤(1)的测定结果显示该对偶基因序列的二TAP1-637的密码子 皆对应甘氨酸，则该受筛检个体为过敏性鼻炎的高危险群。
于本发明中，所谓「华人」是指具有中华血统的族群，包括例如，中国大陆及中国台湾人。于根据本发明的部分实施态样中，是以中国台湾人为受筛检个体。
适用本发明方法步骤(1)的检体并无特殊限制，只要该检体包含受筛检个体的基因组DNA(genomic DNA)即可。举例言之，该检体可为选自以下的至少一者：血液、血浆、尿液、唾液、指甲、皮肤、及头发，且较佳为血液与血浆的至少一者。此外，该检体的用量亦无特殊限制，只要可提供所需生物信息即可。
于本发明方法的步骤(1)中，可使用任何合宜方法来测定TAP1的对偶基因中转译第637位置的氨基酸的密码子。举例言之，可于步骤(1)进行选自以下的至少一种：聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction)、扩增阻碍突变系统聚合酶连锁反应(amplification-refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR)、聚合酶连锁反应-限制酶片段长度多型性分析(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis，PCR-RFLP)、及印记杂交(southern blot)分析。如后附实施例所示，于根据本发明的部分实施态样中，使用针对TAP1-637的特异性引子进行ARMS-PCR，以分析所述检体，后续再进行洋菜胶电泳分析经ARMS-PCR增幅的核酸产物。
于本发明方法的步骤(2)中，利用步骤(1)的测定结果来判断受筛检个体是否为过敏性鼻炎的高危险群，其中，当步骤(1) 的测定结果显示TAP1对偶基因的二TAP1-637的密码子皆对应甘氨酸(即，该受筛检个体为属于Asp-637同型体(homozygous))时，则该受筛检个体为过敏性鼻炎的高危险群。
于本发明方法中，除了检测检体中TAP1的对偶基因中转译第637位置的氨基酸的密码子以外，可进一步检测检体中TAP1的对偶基因中转译第333位置的氨基酸的密码子的步骤，以提高筛检的准确率。举例言之，可于本发明的步骤(1)中更包括测定该TAP1的对偶基因序列中转译第333位置的氨基酸的密码子的步骤，当测定结果显示该对偶基因序列的二TAP1-637的密码子皆对应甘氨酸，且该二TAP1-333的密码子各自对应缬氨酸或异白氨酸(即，二TAP1-333的密码子皆对应缬氨酸、二TAP1-333的密码子皆对应异白氨酸、或者其中一TAP1-333的密码子系对应缬氨酸，另一TAP1-333的密码子系对应异白氨酸)，则该受筛检个体为过敏性鼻炎的高危险群。
根据本发明方法，若受筛检个体本身已出现鼻炎症状(例如，打喷嚏、鼻子痒、流鼻水、鼻塞等)及/或经血液常规检查诊断为罹患鼻炎，则可利用本发明前述筛检方法，以区分该鼻炎类型。因此，本发明亦提供一种体外区分鼻炎类型的方法，包括：(1)检测一个体的检体，测定TAP1之对偶基因中转译TAP1-637的密码子，其中该个体为一患有鼻炎的华人；以及(2)判断步骤(1)的测定结果，当步骤(1)的测定结果显示该对偶基因序列的二TAP1-637的密码子皆对应甘氨酸，则所述鼻炎为过敏性鼻炎。其中，有关该个体的选择、检体种类与采集方式、以及测定TAP1的 对偶基因中转译TAP1-637的密码子的方法与较佳实施态样等，均如上述的说明，且该区分方法亦可进一步包括如上述的测定TAP1之对偶基因序列中转译第333位置的氨基酸的密码子的步骤。
兹以下列实施例进一步例示说明本发明。其中该等实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。本发明保护范围权利要求所示。
实施例：TAP1基因多态性的分析
A.受测个体
本实施例所使用的受测个体包含160位中国台湾人，其中73位经诊断为患有过敏性鼻炎的患者，其余87位为健康个体，所有受测个体皆由义大医院(高雄市，中国台湾)的门诊所招集，并经受测个体同意而进行下述实验。所述73位经诊断为患有过敏性鼻炎的患者的诊断方式是基于以下一或多种诊断标准而确诊：(1)打喷嚏、水样鼻漏(watery rhinorrhea)、及鼻塞等临床症状；(2)过敏性疾病的家族史；(3)血清中升高的总IgE浓度，鼻涂片(nasal smears)的嗜酸性球增多症(eosinophilia)；(4)皮肤测试对于一或多个一般性的吸入性过敏原呈阳性，包括尘螨、花草混合物(grass mix)、猫过敏原(cat allergen)、和树木花粉混合物；及(5)对于一或多个一般性的吸入性过敏原的激发测试呈阳性。所有健康个体(即，作为控制组的个体)皆对于前述过敏性鼻炎的相关症状与检测标准呈阴性。160位受测个体的性别及平均年龄如下表1所示。
表1
B.收集血液样本
分别抽取20毫升上述160位受测个体的血液样本至添加有肝素的真空采血管(BD Biosciences，新泽西州，美国)，并立即使用QIAamp DNA Blood Mini套组(Qiagen公司，加利福尼亚州，美国)，根据套组的使用说明进行基因组DNA的萃取，之后，将基因组DNA样本储存于-80℃，以供下述分子分析实验使用。
C.扩增阻碍突变系统聚合酶连锁反应
使用扩增阻碍突变系统聚合酶连锁反应(amplification-refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR)分析上述B所获得的基因组DNA样本，以分析TAP1基因于第637号位置的氨基酸及第333号位置的氨基酸的多态性。首先，制备PCR反应混合物，添加1毫克基因体DNA、0.2毫摩尔浓度去氧核醣核苷三磷酸(deoxynucleotide triphosphates，dNTP)、0.25微克寡核苷酸引子(共4种)、2单位(unit)DNA聚合酶(Stratagene，加利福尼亚州，美国)，以及添加至体积100微升的1倍反应缓冲液。其中，添加至该PCR反应混合物中的4种寡核苷酸引子，其中两种(分别为正股与反股)寡核苷酸设计成使其3’端核苷酸可互补至编码333号位置的氨基酸或637号位置的氨基酸的TAP1核苷酸的两种变异体的其中一者。另外 两种(分别为正股与反股)寡核苷酸是设计成使其互补至位于多态性的核苷酸的任一侧上的不对称距离的两翼序列(flanking sequences)，用于检测编码333号位置的氨基酸或637号位置的氨基酸的多态性之引子的序列系如表2与所附序列表所示。
表2
将上述PCR反应混合物置于Perkin-Elmer 9700热反应器(Perkin-Elmer，康涅狄格州，美国)，进行ARMS-PCR，反应条件如下：于95℃进行起始变性5分钟；于95℃进行变性1分钟、于58℃进行粘合2分钟、以及于72℃进行延长2分钟，重复35循环；并于72℃进行最终延长10分钟。接着，将PCR反应产物以2％洋菜胶电泳进行分离，并使用溴化乙锭(ethidium bromide)进行染色。于电泳分析中，对于TAP1-637的检测，使用长度为429碱基对(bp)的核酸片段作为控制组核酸片段，其中除了该控制组核酸片段以外，若电泳结果仅另外显示长度为307bp的单一核酸片段，则表示该检体的TAP1的对偶基因序列中转译第637位置的氨基酸的密码子皆对应天门冬氨酸(即，Asp-637同型体)；若电泳结果仅另 外显示长度为180bp的单一核酸片段，则表示该检体的TAP1的对偶基因序列中转译第637位置的氨基酸的密码子对应甘氨酸(即，Gly-636同型体)，若同时显示长度为307bp以及180bp的核酸片段，则表示该检体为Asp-637与Gly-636的异型体(heterozygous))。至于TAP1-333的检测，使用长度为533bp的核酸片段作为控制组核酸片段，其中除了该控制组核酸片段以外，若电泳结果仅另外显示长度为241bp的单一核酸片段，则表示该检体之TAP1之对偶基因序列中转译第333位置的氨基酸的密码子皆对应异白氨酸(即，Ile-333同型体)；若电泳结果仅另外显示长度为352bp的单一核酸片段，则表示该检体的TAP1的对偶基因序列中转译第333位置的氨基酸的密码子皆对应缬氨酸(即，Val-333同型体)，若同时显示长度为241bp以及352bp的核酸片段，则表示该检体为Val-333与Ile-333之异型体)。
图1显示四种类型的检体的电泳实验结果，其中，泳道「M」为电泳标记物(marker)；泳道1为Val-333与Ile-333的异型体；泳道2为Ile-333的同型体；泳道3为Asp-637与Gly-636的异型体；泳道4为Asp-637的同型体。
D.检体分析结果及统计分析
将上述160位受测个体的样本如上述方式进行ARMS-PCR与电泳分析，之后将所有样本的数据进行统计分析，使用SPSS软体(版本13.0，SPSS公司，伊利诺州，美国)，利用叶兹校正(Yates'correction)进行卡方检定(chi square test)，以分析TAP1对偶基因的TAP1-637与TAP1-333的多态性与过敏性鼻炎的关联性。 统计数值以p值(p value)小于0.05视为具有统计上的显著差异性。统计结果显示于下表3及表4。
表3
NS：无显著差异
表3所示为TAP1对偶基因的TAP1-637与TAP1-333的多态性分析结果，其中，对偶基因的任一TAP1-333的密码子对应缬氨酸标示为类型a、对偶基因的任一TAP1-333的密码子对应异白氨酸标示为类型b、对偶基因的任一TAP1-637的密码子对应天门冬氨酸标示为类型c、对偶基因的任一TAP1-637的密码子对应甘氨酸标示为类型d；以及对偶基因的任一TAP1-333的密码子是对应异白氨酸且任一TAP1-637的密码子对应天门冬氨酸标示为类型A、对偶基因的任一TAP1-333的密码子系对应缬氨酸且任一TAP1-637的密码子对应甘氨酸标示为类型B、对偶基因的任一TAP1-333的密码子对应缬氨酸且任一TAP1-637的密码子对应天门冬氨酸标示为类型C、以及对偶基因的任一TAP1-333的密码子对应异白氨酸且任一TAP1-637的 密码子对应甘氨酸标示为类型D。表3的结果显示，相较于控制组，过敏性鼻炎组的受测个体，其TAP1-637的密码子对应甘氨酸的机率较高(即，过敏性鼻炎组的检体呈类型d、B、或D的机率高于控制组)。
表4
表4是将上述160位受测个体的ARMS-PCR与电泳分析结果进一步进行统整，以显示TAP1对偶基因的二TAP1-333与二TAP1-637的多态性与过敏性鼻炎的关联性。其中，表4所载的类型a、b、c、d、A、B、C、及D皆为如表3的定义；若单一受测个体的TAP1对偶基因皆呈类型a，则标示为「TAP1基因型a/a」，其余基因型的标示皆依此类推。
如表4的结果所示，「TAP1基因型d/d」的受测个体(即，TAP1对偶基因的二TAP1-637的密码子皆对应甘氨酸)皆患有过敏性鼻炎，且相较于控制组，数据p值小于0.05，显示数据具有统计上的显著差异。此外，若进一步分析TAP1-333，可将该等「TAP1基因型d/d」的受测个体区分为「TAP1基因型B/B」(即，TAP1对偶基因的二TAP1-637的密码子皆对应甘氨酸，且TAP1-333的密码子皆对应缬氨酸)以及「TAP1基因型B/D」(即，TAP1对偶基因之二TAP1-637的密码子皆对应甘氨酸，且其中一TAP1-333的密码子是对应缬氨酸，另一TAP1-333的密码子是对应异白氨酸)，结果显示，相较于控制组，「TAP1基因型B/B」以及「TAP1基因型B/D」的数据p值皆小于0.05，具有统计上的显著差异。
前述的实验结果显示，经由检测对偶基中TAP1-637(或进一步合并检测TAP1-333)，当结果显示对偶基因序列的二TAP1-637的密码子皆对应甘氨酸(或进一步合并检测TAP1-333，显示TAP1-333的密码子各自对应缬氨酸或异白氨酸)时，则可该受筛检的华人为过敏性鼻炎的高危险群，且若受筛检的华人本身即为鼻炎患者，则该鼻炎为过敏性鼻炎。