本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种施氏假单胞菌FSTB-5的开放式培养方法及其应用。
背景技术：
来源于石油、化工、医药和化肥等行业的盐含量高于1%的高含盐废水普遍含有较高的COD，废水中污染物不断排放到环境中会引起严重的污染问题。淡水资源的缺乏问题日益严重，废水的处理及其回收利用更受到人们的重视。
物理或化学法处理高含盐废水中的COD，成本高并且可能会造成二次污染。传统生物法在处理低盐度废水时有很大优势，但在高盐、高酸碱、高温或低温逆环境中，微生物的降解能力就会受到抑制。耐盐菌技术正是基于工程领域的问题和急需而产生，通过科学方法驯化出处理高含盐废水的优势耐盐菌，该类菌体以其独特的细胞结构和物质组成能够在较高含盐度的环境中生长。耐盐菌处理高含盐废水具有普通活性污泥法无可比拟的优势，且比物理化学法成本低，会产生较为明显的经济效益和社会效益，可以为相关废水处理达标排放提供技术支撑。
施氏假单胞菌可用于废水中总氮脱除、COD脱除等多个领域。在采用施氏假单胞菌进行COD脱除领域：CN201110322523.4涉及到一种包含施氏假单胞菌、恶臭假单胞菌、穿孔假单胞菌和枯草芽孢杆菌的应用于特异性有机物降解的复合菌剂，对卤代烃类、苯酚类、苯酸类、芳香烃类、多环芳烃类、杂环化合物、邻苯二甲酸酯等有毒有害有机污染物具有特异降解能力。CN201210573242.0涉及到一种包含恶臭假单胞菌RW10S2、施氏假单胞菌、恶臭假单胞菌DN6和恶臭假单胞菌BIRD-1的应用于苯系物降解的复合菌剂。CN200910303045.5涉及到一种降解高分子多环芳烃（BAP，BGP，PAHs）效率较高的施氏假单胞菌MT-5。CN201310746598.4涉及到一种应用于提高厌氧产沼效率和污泥有机质分解率的施氏假单胞菌KY-02。CN201310680417.2涉及到一种应用于好氧反硝化的施氏假单胞菌JH-1，保藏号为CCTCC NO：M2013488，其可同步脱除有机废水中60-80%的COD。CN201110118549.7涉及到一种应用于兼性厌氧反硝化的施氏假单胞菌LZ-14，保藏号为CCTCC NO：M2011119，其可同步去除有机废水中的COD。
目前，已知筛选获得的施氏假单胞菌存在不具有耐盐性能或耐盐性能不佳等问题，不适用于高含盐废水的处理。特别是上述筛选获得的菌株大多是在无菌环境下培养获得，在长期开放式培养环境中，容易受到其他杂菌等的污染，这些杂菌在培养液中生长、繁殖，当其数量达到一定密度时，即对优势菌的生长繁殖造成影响，轻者不利于再扩大培养，重者会导致培养的失败。因此，在开放式培养体系中，如何有效地防止杂菌对培养体系的不利影响，是提高优势菌处理效果的关键因素。虽然有些在培养过程中采用了杀菌方法，如采用物理法过滤或者酸化法杀菌，或者在培养过程中添加抗生素等。但是，过滤的方法比较麻烦，处理不干净；酸化法在杀灭杂菌的同时优势菌本身的生长也受到了抑制；投加抗生素的方式，对优势菌也具有杀害作用，进而影响处理效果。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种施氏假单胞菌FSTB-5的开放式培养方法及其应用。本发明根据施氏假单胞菌FSTB-5的菌体特性，在采用含盐含COD废水开放式培养施氏假单胞菌FSTB-5过程中，投加特定的杀菌剂，可以显著降低杂菌污染，不会影响施氏假单胞菌FSTB-5的生长繁殖和废水处理效果。
本发明施氏假单胞菌FSTB-5的开放式培养方法，包括如下内容：在施氏假单胞菌FSTB-5的开放式培养过程中，投加杀菌剂；所述施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）FSTB-5，已于2015年6月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNo.10940；所述杀菌剂为林可霉素、二甲胺四环素、利福霉素SV、醋竹桃霉素、万古霉素、氨曲南、萘啶酸等中的一种或几种。
本发明中，所述的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）FSTB-5菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.10940；保藏日期：2015年6月1日。
本发明中，所述的施氏假单胞菌FSTB-5的主要形态特征为：菌落颜色为浅姜黄色，菌株个体为杆状；生理生化特征为：革兰氏阴性，氧化酶阴性，接触酶阳性，具有硝酸盐还原性能，可水解利用多种碳源。该菌株可应用于盐含量1.0wt%-10.0wt%的含盐废水中COD的高效脱除，而且能够在40℃高温下生长。
本发明中，所述的开放式培养是指在敞开式容器中进行，所有进入反应器的气体或者补加的料液都不进行无菌处理。
本发明中，培养施氏假单胞菌FSTB-5的生长环境尽管具有持续性的高盐选择压力，但在长期开放式培养时仍可能会有少量的其它干扰菌株生长，为防止干扰菌持续性繁殖生长成为优势菌，定期采样稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-2相似菌落的百分比，当相似百分比接近50%时投加杀菌剂，所述杀菌剂为林可霉素、二甲胺四环素、利福霉素SV、醋竹桃霉素、万古霉素、氨曲南、萘啶酸等中的一种或几种。由于施氏假单胞菌FSTB-5可以耐受上述杀菌剂，因此不会受到影响，可以稳定生长繁殖。本发明中，所述杀菌剂的投加浓度为0.01-100mg/L，持续投加2-7个培养周期。
本发明中，所述的施氏假单胞菌FSTB-5的开放式培养包括菌株活化、液体种子液培养、曝气培养、纯菌株检测和优势菌株维护等五个阶段，具体过程如下：
（1）菌株活化：将施氏假单胞菌FSTB-5接种到FSTB固体培养基的斜面或者平板中，25-40℃培养24-48小时，然后保存于4℃冰箱中。
（2）液体种子液培养：配制FSTB液体培养基，分装于三角瓶中，灭菌并冷却至室温后，无菌环境下挑取斜面或平板中活化的菌株接种到三角瓶中，25-40℃培养24-72h。所述FSTB液体培养基为：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH值范围4.5-8.5，优选为5.0-8.0。FSTB固体培养基是在液体培养基中加入20g/L的琼脂。
（3）曝气培养：在设有曝气装置的开放式反应器中加入FSTB-5液体培养基或者含盐含COD的废水，按照反应器体积比0.5%-25%的比例接种液体种子液，pH值控制在5.0-8.0，曝气培养48-96小时，之后进行周期性的补料和排料操作，排料量占反应器体积的5%-90%，补料量占反应器体积的5%-90%，也可补加少量的碳源、氮源和微量元素物质，培养24-48小时为1个培养周期，之后按照上述比例排出对应体积的培养液，由此得到含有高浓度施氏假单胞菌的浓菌液产品。
（4）纯菌株检测：采集上述培养完毕的菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-5相似菌落的百分比，当相似菌落百分比接近50%时投加杀菌剂，所述杀菌剂为林可霉素、二甲胺四环素、利福霉素SV、醋竹桃霉素、万古霉素、氨曲南、萘啶酸等中的一种或几种，投加浓度为0.01-100mg/L，持续投加2-7个培养周期，上浮的微生物在排水排料时排出，之后恢复正常的开放式培养操作流程。
（5）采集上述培养完毕的菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-5相似菌落的百分比，相似百分比达到65%以上，施氏假单胞菌FSTB-5成为优势菌。
本发明中，所述的施氏假单胞菌FSTB-5的开放式培养可以采用FSTB液体培养基，也可以含盐含COD的废水。所述含盐含COD的废水可以是经过预处理的化工合成废水、煤化工废水，也可以是炼油工艺、煤化工工艺及化工合成工艺等产生的废水经过反渗透减量化单元产生的浓盐水，优选采用环氧氯丙烷废水。所述废水的盐含量为0.5wt%-8.0wt%，优选1.0wt%-5.0wt%，COD（Cr法，下同）含量为200-20000mg/L。
本发明开放式培养获得施氏假单胞菌FSTB-5可以应用于各种含盐含COD废水的处理中，如可应用于盐含量1.0wt%-10.0wt%的含盐废水中COD的高效脱除，COD的去除率可达90%以上。或者当废水系统出现异常，可以直接投加上述培养获得的浓菌液产品，投加量按照每小时所处理废水体积的0.01%-3%进行投加。
本发明所述的耐盐施氏假单胞菌FSTB-5是一株在高含盐水体中具有较好COD脱除性能的菌株，耐盐能力强，处理效果好，可以直接用于含盐废水的处理，也可以投加到现有含盐废水处理系统中，提高废水处理效果。本发明方法根据施氏假单胞菌FSTB-5的菌体特性，在采用含盐含COD废水开放式培养施氏假单胞菌FSTB-5过程中，投加特定的杀菌剂，可以显著降低杂菌污染，不会影响施氏假单胞菌FSTB-5的生长繁殖和废水处理效果。本发明采用含盐含COD废水开放式培养施氏假单胞菌FSTB-5，极大的维持耐盐菌剂的生长特性和耐受特性，并降低耐盐菌剂的培养成本，不会影响菌体的生长和脱COD效果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的效果，但不因此限制本发明。
本发明实施例所采用的含盐含COD废水的水质为：COD浓度为2000mg/L，盐含量为2.8wt%。所述的开放式培养是指在敞开式容器中进行，所有进入反应器的气体或者补加的料液都不进行无菌处理。
实施例1
本发明施氏假单胞菌FSTB-5的开放式培养方法包括菌株活化、液体种子液培养、曝气培养、纯菌株检测和优势菌株维护五个阶段，具体过程如下：
（1）菌株活化：将施氏假单胞菌FSTB-5接种到含有FSTB固体培养基的平板中，35℃环境下培养48小时，然后保存于4℃冰箱中待用。所述FSTB固体培养基为：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，pH值7.8。
（2）液体种子液培养：配制FSTB液体培养基，分装于三角瓶中，灭菌并冷却至室温后，无菌环境下用接种环挑取斜面中活化后的菌株接种到三角瓶中，35℃条件下培养48小时。所述FSTB液体培养基为：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH值7.8。
（3）曝气培养：在开放式反应器中加入含盐废水，反应器需配备曝气装置，并可进行进水、调酸、调碱、补料和排水排料操作，按照体积百分比10%的比例接种液体种子液，开启培养过程后，培养过程中采用酸碱自动控制系统将培养液pH值范围控制在5.0-8.0，曝气培养72小时之后进行周期性的补料和排料操作，排料为反应器体积的50%的培养液，补料为反应器体积50%的含盐废水，培养24小时为1个培养周期，之后按照上述比例排出对应体积的培养液，由此得到含有较高浓度施氏假单胞菌的浓菌液产品。
（4）纯菌株检测：采集上述培养完毕的浓菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-5相似菌落的百分比，当相似菌落百分比接近50%时投加杀菌剂，所述杀菌剂为林可霉素，投加浓度为10mg/L，持续投加5个培养周期，上浮的微生物在排水排料时排出，之后恢复正常的开放式培养操作流程，继续培养3个周期后结束。
（5）采集上述培养完毕的菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-5相似菌落的百分比。
实施例2
处理工艺及操作条件同实施例1，不同之处在于：步骤（4）投加利福霉素SV，投加浓度为5mg/L，持续投加5个培养周期，上浮的微生物在排水排料时排出，之后恢复正常的开放式培养操作流程。采集上述培养完毕的菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-5相似菌落的百分比。
实施例3
处理工艺及操作条件同实施例1，不同之处在于：步骤（4）投加二甲胺四环素，投加浓度为25mg/L，持续投加5个培养周期，上浮的微生物在排水排料时排出，之后恢复正常的开放式培养操作流程。采集上述培养完毕的菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-5相似菌落的百分比。
实施例4
处理工艺及操作条件同实施例1，不同之处在于：步骤（4）投加万古霉素，投加浓度为20mg/L，持续投加5个培养周期，上浮的微生物在排水排料时排出，之后恢复正常的开放式培养操作流程。采集上述培养完毕的菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-5相似菌落的百分比。
实施例5
处理工艺及操作条件同实施例1，不同之处在于：步骤（4）投加醋竹桃霉素，投加浓度为5mg/L，持续投加5个培养周期，上浮的微生物在排水排料时排出，之后恢复正常的开放式培养操作流程。采集上述培养完毕的菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-5相似菌落的百分比。
实施例6
处理工艺及操作条件同实施例1，不同之处在于：步骤（4）投加萘啶酸，投加浓度为30mg/L，持续投加5个培养周期，上浮的微生物在排水排料时排出，之后恢复正常的开放式培养操作流程。采集上述培养完毕的菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-5相似菌落的百分比。
比较例1
处理工艺及操作条件同实施例1，不同之处在于：不投加杀菌剂。采集上述培养完毕的菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-5相似菌落的百分比。
比较例2
处理工艺及操作条件同实施例3，不同之处在于：不投加杀菌剂。采集上述培养完毕的菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-5相似菌落的百分比。
将实施例1-6投加杀菌剂的5个培养周期和比较例1-2不投加杀菌剂的5个培养周期的处理效果进行比较，同时对投加杀菌剂结束后继续培养3个周期后的效果进行比较。投加杀菌剂前的相似百分比均为50%，每个周期结束后取样检测培养液中的优势菌相似百分比、COD去除率和菌体浓度变化（以600nm时的吸光度数值OD600表示菌体浓度），效果如表1所示（表中0周期表示菌体培养的初始状态）。
表1施氏假单胞菌FSTB-5开放式培养效果
表1可知，本发明根据施氏假单胞菌FSTB-5的菌体特性，在采用含盐含COD废水开放式培养施氏假单胞菌FSTB-5过程中，投加特定的杀菌剂，可以显著降低杂菌污染，不会影响施氏假单胞菌FSTB-5的生长繁殖和废水处理效果。