一种调控水稻植株株高的方法与流程

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种调控水稻植株株高的方法。

背景技术：

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，如何提高水稻的产量一直是人们研究的重点，株高是影响作物产量的一个重要性状。上世纪50年代初，基于基因渗入的半矮秆育种使得栽培农作物如小麦和水稻的产量有了巨大的提升。为了进一步提高水稻产量，育种家提出了理想株型育种，虽然针对不同稻作区有不同的理想株型模式，但普遍要求有适当的株高，而不是单纯的矮杆或半矮杆。因此，研究并揭示水稻株高发育的分子机理对植物株型建成的基础研究和指导生产育种具有重要的理论和实践意义。

水稻株高由复杂的基因调控网络控制。根据目前的报道，株高主要受激素如赤霉素（Gibberellin，GA）、油菜素内酯（Brassinosteroid，BR）、独脚金内酯（Strigolactone，SL）等相关途径和极性生长素运输（Polar Auxin Transport）的调控，其中GA和BR相关途径研究最为深入。多数矮化突变体的产生都是由于这两种植物激素的生物合成或响应途径的缺陷；随着GA受体GID1（GA-INSENSITIVE DWARF1）、GID2（GA-INSENSITIVE DWARF 2）和DELLA等关键蛋白的相继鉴定，GA控制植物株型建成的信号途径得以阐明。

在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，已克隆数个与BR信号响应和传导相关的基因。如 BRI1（Brassinosteroid-Insensitive 1），编码一个定位在质膜的LRR受体激酶（Receptor-like kinase, RLK）；BAK1（Bri1-associated Receptor Kinase 1）则可与BRI1产生互作；通过筛选及研究BR信号途径的突变体，人们还鉴定了BRI1下游的抑制因子BKI1 (BRI1 Kinase Inhibitor 1)，BIN2（BR-Insensitive 2），BES1（Bri1-EMS-Suppressor 1）以及BZR1（Brassinazole Resistant 1）。

此外，近年来鉴定了一种新的植物激素SL，其主要功能是调控植物茎的分枝，同时也控制株高发育。人们通过对水稻 htd（high tillering dwarf）、D10、D14、D3及D53等矮化突变体的深入研究，逐步揭示了SL调控侧枝及株高发育的分子机制。

综上所述，GA、BR和SL等植物激素调控植物株高发育的分子机制已日渐明晰，然而，其他影响株高发育的因素仍需进一步探究。

技术实现要素：

本发明揭示了一种控制植物株高的新的分子机制，并提供两种培育水稻矮化植株的方法。一种方法通过转基因表达突变型PTD1基因或定点突变了保守半胱氨酸密码子的ptd1基因实现矮化，另一种方法利用基因组靶向编辑内源的野生型ptd1基因实现矮化。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种调控水稻植株株高的方法，包括以下步骤：

S1. 将编码SEQ ID NO：2所示ptd1蛋白中第56位和/或76位和/或第102位和/或116位半胱氨酸的密码子定点突变为非半胱氨酸密码子，得到改造后的基因；

S2. 将改造后的基因与启动子连接后转入正常株高的水稻植株，筛选获得与正常株高的水稻植株相比，株高发生变化的植株即可。

发明人前期研究中发现一个表现为矮化的水稻植株，在该矮化植株的基础上通过图位克隆法获得野生型ptd1基因及矮化植株突变型PTD1基因。

进一步地，发明人发现野生型ptd1蛋白具有脂质转移蛋白典型的8个半胱氨酸基序，该保守基序是分子内形成二硫键的关键位点，另外，还发现ptd1蛋白中第56位与102位半胱氨酸以及76位与116位半胱氨酸能够分别两两形成第3，4位的二硫键，这两个二硫键的破坏正是突变基因PTD1调控株高的关键，因此，若想调控水稻植株株高，只需要对ptd1蛋白中第56位和/或76位和/或第102位和/或116位半胱氨酸进行突变。

优选地，本发明不对所述改造后的基因序列进行具体的限定，因为只要改造后的基因所编码的蛋白中第56位和/或76位和/或第102位和/或116位不是半胱氨酸使得它们不形成二硫键即可。

作为本发明的一种具体实施方式，所述改造后的基因可以是ptd1-mC102,116或ptd1-mC56,76，这两个基因中102位与116位（或56位与76位）编码的是甘氨酸。

优选地，本发明所述调控水稻植株株高为使正常株高的水稻植株产生矮化表型。

优选地，S1所述启动子为植物通用组成型启动子或ptd1基因的自身启动子。

作为一种具体的实施方案，本发明所述矮化水稻植株的方法，包括以下步骤：

S1. 将SEQ ID NO：3所述基因转入正常株高的水稻植株，进行超表达，得到转基因植物；

S2. 从S1所得到的转基因植物中筛选得到与正常株高的水稻植株相比，产生矮化表型的转基因植物。

作为另外一种具体的实施方案，本发明所述矮化水稻植株的方法，包括以下步骤：

S1. 向正常株高的水稻植株中导入由SEQ ID NO：5所述的自身启动子驱动的SEQ ID NO：3所述基因，得到表达SEQ ID NO：3所述基因的转基因植物；

S2. 从S1所得到的转基因植物中筛选得到与正常株高的水稻植株相比产生矮化表型的转基因植物。

本发明还提供一种基于ptd1基因靶向编辑的培育方法，包括以下步骤：

S1. 利用基因组靶向编辑系统将正常株高的水稻植株中SEQ ID NO：1所示ptd1基因进行靶向编辑，使所述基因第56位和/或76位和/或第102位和/或116位半胱氨酸密码子发生改变，致使突变后的基因编码的蛋白丧失第3和/或第4位二硫键，得到定点突变的植物；

S2. 从S1所得到的定点突变的植物中筛选得到与正常株高的水稻植株相比株高矮化的植物。

优选地，所述基因编辑系统可以是CRISPR/Cas系统。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种调控水稻植株株高的方法，是将编码SEQ ID NO：2所示ptd1蛋白中第56位和/或76位和/或第102位和/或116位半胱氨酸的密码子定点突变为非半胱氨酸密码子，得到改造后的基因；将改造后的基因与启动子连接后转入正常株高的水稻植株，筛选获得与正常株高的水稻植株相比，株高发生变化的植株。本发明利用基因工程手段表达突变型PTD1基因或定点突变了保守半胱氨酸密码子的ptd1基因进行分子育种，在调节植物株高、植物理想株型的建成上具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为水稻矮化突变体PTD1植株及株高相关基因PTD1/ptd1突变位点和二硫键形成模式图；其中，图1A显示突变体PTD1与野生型中花11（ZH11）的植株形态，右上角小图是PTD1抽穗时的形态；图1B为PTD1和ptd1基因的读码框及翻译蛋白比对图；图1C为ptd1二硫键形成模式，显示ptd1蛋白一级序列28～120位氨基酸，1，2，3和4表示半胱氨酸两两配对形成4对二硫键。

图2为水稻株高相关基因PTD1突变重现、超表达及定点突变ptd1基因的转基因植株的鉴定实物图。ZH11为野生型水稻植株中花11，其中，图2A中突变重现植株（t PTD1）即为突变型PTD1基因与自身启动子构建的突变重现载体转化ZH11的T₁代转基因植株；图2B中超表达植株（t Ubi-PTD1）为突变型PTD1基因与超表达启动子（Ubi）构建的载体转化ZH11的T₁代转基因植株；图2C中标注t ptd1-mC102,116的植株是转化定点突变了第102和116位半胱氨酸密码子的ptd1基因的T₀代植株，标注ZH11的是同批转化得到的不带转基因的再生植株，上述突变基因由ptd1自身启动子驱动，转化受体为ZH11。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，所使用的试剂或材料均为通过商业途径得到。

本发明前期研究中发现一矮化表型的水稻植株（图1A），通过图位克隆的方法获得了突变体PTD1基因，其图位克隆的过程同Characterization and genetic mapping of a Photoperiod-sensitive dwarf1 locus in rice (Oryza sativa L.)，PTD1基因序列如SEQ ID NO：3。

实施例1 PTD1的突变重现载体和超表达载体转化野生型水稻ZH11

根据日本晴参考序列设计包括编码区约500 bp及其上下游调控区各延伸约2.4 kb和2.1 kb的特异性PCR引物PTD1-RM-F和PTD1-RM-R（表1），利用高保真酶KOD-Plus结合长片段PCR（long-range PCR，LR-PCR）技术，以突变体PTD1的基因组DNA为模板，扩增约5 kb目的片段，用限制性内切酶Eco RI和Bam HI切割后克隆到植物双元载体pCAMBIA1300（CAMBIA公司，Canberra，Australia）上，获得突变重现载体。

另外设计包含候选基因PTD1整个ORF的基因特异性引物PTD1-OE-F和PTD1-OE-R（表1），以突变体PTD1总RNA为模板进行RT-PCR，扩增得到357 bp的cDNA片段，用KpnI/BamHI进行双酶切后克隆到pOX载体上，利用组成型表达的玉米泛素基因Ubi启动子驱动PTD1的表达，即超表达载体。

然后，通过农杆菌EHA105介导的遗传转化将上述突变重现载体和超表达载体分别导入野生型水稻ZH11植株中，通过潮霉素筛选转基因植株，利用引物HPT-F 和HPT-R（表1）对转基因植株进行潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）的PCR鉴定，并对转入的PTD1基因进行测序鉴定。结果表明，将PTD1突变重现载体导入野生型受体ZH11中，大多数转化体重现了突变型PTD1的表型，植株表现为矮化（图2A）；另外，在野生型水稻ZH11中超表达PTD1，经鉴定转基因阳性植株中均表现出不同程度的矮化表型（图2B），综上所述，多个突变重现以及超表达的独立转化个体均能再现PTD1的矮化表型，这证明了PTD1基因的生物学功能与水稻株高调控相关。

实施例2 水稻株高相关基因PTD1/ptd1的核苷酸序列及蛋白结构

通过PCR扩增ptd1和PTD1的基因组序列并进行测序，发现水稻矮化植株中的PTD1是在野生型ptd1编码区第303 bp处发生了一个G碱基的缺失以及在第305 bp处发生了一个G→T的替换，导致了其编码区从363 bp缩短至357 bp，而其编码的蛋白质从突变点起发生了移码突变（图1B），ptd1和PTD1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示。

ptd1和PTD1的蛋白序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示，ptd1编码由120个氨基酸残基组成的蛋白多肽，其前端1～27位氨基酸为信号肽，在蛋白成熟加工后切除，其成熟蛋白分子量约9.5 kDa，等电点为8.69；而PTD1则编码由118个氨基酸残基组成的蛋白多肽，其信号肽与野生型相同，因此成熟蛋白分子量约9.1 kDa，等电点为9.06；野生型ptd1蛋白具有脂质转移蛋白典型的8个半胱氨酸基序（Eight-cysteine motif, 8 CM），该保守基序是分子内形成二硫键的关键位点。而突变型PTD1由于100位氨基酸后产生移码突变，其102和116位半胱氨酸丧失，导致蛋白不能正常形成二硫键，这一结构特点是使植株产生矮化表型的关键所在（图1B，C）。

实施例3 对ptd1中形成第3，4位二硫键的关键半胱氨酸密码子进行突变并转化ZH11

对ptd1蛋白进行分析发现，其第31，41，55，56，76，78，102，116位氨基酸为半胱氨酸，是形成分子内二硫键的重要氨基酸，其中56与102位半胱氨酸以及76与116位半光氨酸分别两两形成第3，4位二硫键（图1C），研究表明，这两个二硫键的破坏正是突变基因PTD1调控植物株高的关键，因此可以对ptd1中关键半胱氨酸密码子进行点突变，以实现与突变基因PTD1相同的功能。

利用Ω-PCR技术（所述Ω-PCR技术参考文献：Robust one-Tube Ω-PCR Strategy Accelerates Precise Sequence Modification of Plasmids for Functional Genomics）对ptd1基因进行点突变，将102与116位（或56与76位）半胱氨酸所在的密码子点突变为非半胱氨酸的密码子（如改为甘氨酸的密码子），并将改造得到的ptd1-mC102,116（或ptd1-mC56,76）基因与ptd1自身启动子构建到植物双元载体pCAMBIA1300上（引物序列如表2，下划线部分为点突变位置）。然后，通过农杆菌EHA105介导的遗传转化将上述载体导入野生型水稻ZH11植株中，通过潮霉素筛选转基因植株，利用PCR对转基因植株进行HPT基因鉴定，并对转入基因的突变点进行测序鉴定。结果表明，将ptd1点突变载体导入野生型受体ZH11中，有多个独立的遗传转化事件重现突变体PTD1的表型（图2C），表明点突变破坏第3，4位二硫键后的ptd1具有调控植物株高的功能。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种调控水稻植株株高的方法

<130>

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 363

<212> DNA

<213> 水稻株高相关基因ptd1的核苷酸序列

<400> 1

atggctccaa ggtgcgcgac gctggcggtg gtggtggtgc tggtggcggc cgtggtggcg 60

ccgccgacgg cggtgcgcgc ggctatctcg tgctcggcgg tgtacaacac gctgatgccg 120

tgcctgccgt acgtgcaggc ggggggcacg gtgcccaggg cgtgctgcgg cggcattcag 180

agcctgctcg ccgccgccaa caacaccccc gatcgccgca ccatctgcgg ctgcctcaag 240

aacgtcgcca acggcgcctc cgggggcccc tacatcaccc gcgccgccgc gctcccctcc 300

aagtgcaacg tctccctccc ttacaagatc agcaccagcg tcaactgcaa cgcgataaac 360

tag 363

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> ptd1编码的氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Pro Arg Cys Ala Thr Leu Ala Val Val Val Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Val Val Ala Pro Pro Thr Ala Val Arg Ala Ala Ile Ser Cys Ser

20 25 30

Ala Val Tyr Asn Thr Leu Met Pro Cys Leu Pro Tyr Val Gln Ala Gly

35 40 45

Gly Thr Val Pro Arg Ala Cys Cys Gly Gly Ile Gln Ser Leu Leu Ala

50 55 60

Ala Ala Asn Asn Thr Pro Asp Arg Arg Thr Ile Cys Gly Cys Leu Lys

65 70 75 80

Asn Val Ala Asn Gly Ala Ser Gly Gly Pro Tyr Ile Thr Arg Ala Ala

85 90 95

Ala Leu Pro Ser Lys Cys Asn Val Ser Leu Pro Tyr Lys Ile Ser Thr

100 105 110

Ser Val Asn Cys Asn Ala Ile Asn

115 120

<210> 3

<211> 357

<212> DNA

<213> 突变型PTD1的核苷酸序列

<400> 3

atggctccaa ggtgcgcgac gctggcggtg gtggtggtgc tggtggcggc cgtggtggcg 60

ccgccgacgg cggtgcgcgc ggctatctcg tgctcggcgg tgtacaacac gctgatgccg 120

tgcctgccgt acgtgcaggc ggggggcacg gtgcccaggg cgtgctgcgg cggcattcag 180

agcctgctcg ccgccgccaa caacaccccc gatcgccgca ccatctgcgg ctgcctcaag 240

aacgtcgcca acggcgcctc cgggggcccc tacatcaccc gcgccgccgc gctcccctcc 300

aattcaacgt ctccctccct tacaagatca gcaccagcgt caactgcaac gcgataa 357

<210> 4

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<212> PRT

<213> PTD1编码的氨基酸序列

<400> 4

Met Ala Pro Arg Cys Ala Thr Leu Ala Val Val Val Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Val Val Ala Pro Pro Thr Ala Val Arg Ala Ala Ile Ser Cys Ser

20 25 30

Ala Val Tyr Asn Thr Leu Met Pro Cys Leu Pro Tyr Val Gln Ala Gly

35 40 45

Gly Thr Val Pro Arg Ala Cys Cys Gly Gly Ile Gln Ser Leu Leu Ala

50 55 60

Ala Ala Asn Asn Thr Pro Asp Arg Arg Thr Ile Cys Gly Cys Leu Lys

65 70 75 80

Asn Val Ala Asn Gly Ala Ser Gly Gly Pro Tyr Ile Thr Arg Ala Ala

85 90 95

Ala Leu Pro Ser Asn Ser Thr Ser Pro Ser Leu Thr Arg Ser Ala Pro

100 105 110

Ala Ser Thr Ala Thr Arg

115

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<212> DNA

<213> ptd1基因自身启动子的核苷酸序列

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ccagcaaccc cgtcgtcaga agtgttggca gatctaaatc tgtaaggaag cagcatctga 180

tgaacccgat cgaccagcat ctagctcatc tagctccgcc atttacgctc gatcgcagag 240

gtgcaatggc tttaggcagg ccacgtccgg ggcaagtcat taaatcagag gtactccatg 300

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actatacgtc ggtccatgca gaatttgttc gtcgatctga ttattgtagc aaaaaaccga 480

gctagacaca cgataggatt aggatataca tcgacaccca tagtctcttg caacacgtcg 540

gatctcaatt agtatctgca ctaaccatat tgatctaaca aaacatgatt atagtgtaag 600

atcaatgtgt gttttgattc ttattctgtg atgaacaatt gacatatgtg attatcggtt 660

ttgatatttg gagattatcg tcgaagtggt tttggagata atcaattttc aggagatgaa 720

tagggtttac tgatttgtcg ggaccggtca gaccgggcgg ttgttgccgg tcagacagga 780

gctatgtgag cggtcagacc ggcttgcccg cggtctgacc ggccgacgct gtgtcggttt 840

cggtttcggg ttgtttcttt ggatatccgt gattgtttca tggttatggc ttatagatgg 900

atactatacg tatataatac tgttgtttgc tacgaatgag ttaagttgga gatagcttgg 960

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atttgcggtg atggaccggg agtcggctta gtggtaagac gatatccgtg gtggttagat 1080

atcatacgag atactaagac tagagttgat gcacgtggtt ggtgaagatt ccatatggca 1140

tacgatggag gtattgtgtg cgtatgggat gcggagtcga atttggaagg agtccaaatt 1200

tggtacgatt ggttatgttg agtttctttc ttgtactaga gggtttcgta aggtgtttag 1260

gactcttagt atgagtttgg ttcgtggctt taggctgcct acctcatgta taaatagagg 1320

gggagcgtga ggctttccgg tatcgctttt ttatcgcttt tcaaagcgtg gagttgatag 1380

tttagttagg gtttcgagtt tagtcaagat ttttgtaagg aatgctgttg ttgcactttg 1440

taaacacaga gagaagcaat aaagttgtca tctactttga gagttcttcg atttgtgttt 1500

caccaggttt cggcggtcta accggcatct caccggcggt cagaccggcg acctactggc 1560

ggtcagaccg gctaaggcga ggcggtcaga ccggcggcgg cgacaggagc tggcgattga 1620

tctcggcggt tcgaccggtg ttacaacctc ggtcagaccg acgatatcca ggcggtcaga 1680

ccggcgctac tacttcggtc agaccgcgat ccatcgattt cgaggataac ttttattttc 1740

gctaaatttt ttttgttttt gggtatacca accattcact cctctctggt tggtttagtt 1800

cttgtgattt aatcttacat atagtgagtt ctcgcttgct gtttttgctt ctcttccttt 1860

tgctggagct tattggtttc ttagccagcg tttctagttt ctctttcttt tcctgttccc 1920

gaatcccggg cgatggttgt ccggctgccg tgtcgtgtaa aaacttgctt ttgcttattc 1980

taatagaatg acgtgtaatt ccttgtcaca ttcataaaaa aaatgaatta atcatcgctt 2040

caccgtcaaa agttgtatgg ttaatcctac cgaattgtca aatcgagcat ggcatacgtt 2100

aaaaagctca aacagcaagt gcatcttgca gactacacca tcacagagtc cagaattatc 2160

agaacgatca aacgtctggt aaaaatgcat cccccaaaaa accctcctcc tatttcagtc 2220

aaattctgac cacacacacg gccatctgct accagctcgc gttcttaact cctcccctaa 2280

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ggaagcccca ttccatcc 2358

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<212> DNA

<213> PTD1-RM-F

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<210> 7

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<212> DNA

<213> PTD1-RM-R

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attagaattc ctcctgctgc tggcctcaca gac 33

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<211> 31

<212> DNA

<213> PTD1-OE-F

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attaggtacc gctgacatgg ctccaaggtg c 31

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> PTD1-OE-R

<400> 9

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<212> DNA

<213> HPT-F

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gtctccgacc tgatgcagct ctcgg 25

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> HPT-R

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gtccgtcagg acattgttgg ag 22

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<212> DNA

<213> 1300-ptd1 C 102G&C116 G-F

<400> 12

gggaacgtct ccctccctta caagatcagc accagcgtca acgggaacgc gtacgt 56

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<211> 57

<212> DNA

<213> 1300-ptd1 C102G&C116 G -R

<400> 13

cccgttgacg ctggtgctga tcttgtaagg gagggagacg ttccccttgg aggggag 57

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

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<400> 14

cccagggcgt gcgggggcgg cattcagagc ctgctcgccg cc 42

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 1300-ptd1C56G-R

<400> 15

ctgaatgccg cccccgcacg ccctgggcac cgtgcccccc gc 42

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 1300-ptd1C76G-F

<400> 16

cgccgcacca tcgggggctg cctcaagaac gtcgccaacg gc 42

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<211> 42

<212> DNA

<213> 1300-ptd1C76G-R

<400> 17

cttgaggcag cccccgatgg tgcggcgatc gggggtgttg tt 42