一种犬松弛素原重组蛋白及犬松弛素原多克隆抗体的制备方法与流程

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种犬松弛素原重组蛋白的制备方法，本发明还涉及一种犬松弛素原多克隆抗体的制备方法。

背景技术：

松弛素(Relaxin，RLX)为胰岛素家族的一种短肽激素，具有广泛的生理功能，包括生殖调控、舒张血管、抗炎及促进炎性损伤愈合等，临床应用显示松弛素用于血压正常或升高的急性心衰患者，可改善患者呼吸困难和其它临床症状。在体内，经过转录和翻译首先合成前松弛素原(preprorelaxin)，犬前松弛素原基因序列全长534bp，编码177个氨基酸，包括A、B、C3个区域和1个信号肽；前松弛素原在信号肽酶作用下，切割信号肽后转变为松弛素原(prorelaxin)，其结构包含B链、C肽和A链；松弛素原通过蛋白酶水解切除C肽，形成具有活性的成熟松弛素，包括AB链及链内链间的三对二硫键。已有的研究显示松弛素原和松弛素可在血浆中检测到。

研究发现，妊娠期犬松弛素的分泌量逐渐增多，犬妊娠20d-30d血清松弛素浓度显著高于未怀孕时(未孕时其含量几乎可忽略不计)，妊娠35d血清松弛素含量最高，浓度为10ug/mL，分娩时或自发流产前突然降到检测不到的水平；Steinetz等(1996年)报道孕犬血清松弛素最早在妊娠18d时检测到，证实松弛素是犬妊娠早期的产物，可作为判断犬妊娠的一个标志；Braun等(1999年)报道妊娠期伊比利亚猞猁在妊娠32d-56d血清松弛素呈阳性，而尿液呈阴性，将妊娠29d-46d尿液浓缩可检出松弛素，提示可用于野生动物妊娠诊断的一种手段。国外犬松弛素检测的ELISA试剂盒已商业化，临床上在妊娠21d的犬血清中可检测到，通过检测松弛素对犬进行妊娠诊断已在美洲推广使用，但在中国还未推广使用。

松弛素可在化学合成其A肽链和B肽链的基础上经过体外折叠获得，但松弛素分子量较小仅6kD，难以测定其产物含量。利用基因工程技术克隆松弛素原基因并进行体外表达，已被证明是松弛素制备的有效技术途径。Reddy等(1992 年)报道猪松弛素原在大肠杆菌中成功进行原核表达，其蛋白质以包涵体形式在胞浆存在，占菌体蛋白的8％。Ann等(1993年)将猪松弛素cDNA在真核细胞CHO细胞中表达，发现表达的蛋白质为19kD的松弛素原，含量为250ng/ml。丁传天等(1997年)报道人黄体松弛素原基因在大肠杆菌BL21中表达，是分子量为20kD的可溶蛋白，占菌体蛋白的30％。Neumann等(2006年)将马松弛素原基因转染到MAC-T细胞中，得到分子量为19kD的马松弛素原产物。综上，目前对松弛素重组蛋白的研究主要集中在人、猪和马等，商品化的松弛素重组蛋白及抗体多为人源化，国外克隆了犬前松弛素原的基因序列，但犬松弛素原重组蛋白及其抗体制备还未见报道。

本试验，以分娩时犬胎盘组织为材料克隆犬前松弛素原基因cDNA并进行测序，生物信息学分析显示为犬前松弛素原基因编码序列，进而通过PCR扩增犬松弛素原基因cDNA，成功构建犬松弛素原原核表达载体pET28a-prorelaxin，并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并纯化获得重组蛋白，再以犬松弛素原重组蛋白作为免疫原免疫新西兰家兔，制备犬松弛素原多克隆抗体。犬松弛素原重组蛋白的获得，可望制成药物，用于妊娠维持，调控分娩进程，治疗难产，以及用于舒张血管、抗炎、促进组织愈合和抗纤维化等，为进一步研究犬松弛素生理功能及更好地将犬松弛素原用于临床打下基础。通过本方法制备的犬松弛素原多克隆抗体可用于建立松弛素原检测的各种技术，以对犬的生理机能进行评判，如用于犬妊娠诊断，完善犬松弛素原的临床应用。

技术实现要素：

针对目前无犬松弛素原重组蛋白及多克隆抗体制备的报道，本发明的目的是提供一种犬松弛素原基因工程重组蛋白的制备方法；本发明利用原核表达易培养、表达量高等特点，将表达的重组蛋白作为免疫原免疫新西兰家兔，得到特异性强、效价高的兔抗犬松弛素原多克隆抗体。

本发明所采用的第一技术方案是，一种犬松弛素原重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、以犬前松弛素原基因cDNA的克隆质粒pMD19-T-preprorelaxin为材料，提取质粒DNA，以GenBank公布的犬松弛素原基因cDNA序列设计并合成的一对上下游引物，进行PCR扩增；

步骤2、构建含有步骤1的PCR扩增产物的克隆载体pMD19-T-prorelaxin；

步骤3、将步骤2获得的克隆载体pMD19-T-prorelaxin加入到冰预冷的DH5α感受态细胞中，接种5ml含浓度为100μg/mlAMP的LB培养基，37℃震荡培养过夜，同时培养表达质粒pET28a的菌株，并用BamHI与XhoI双酶切，进行连接与转化，得到pET28a-prorelaxin表达菌；

步骤4、培养pET28a-prorelaxin表达菌，使用IPTG诱导pET28a-prorelaxin表达菌，产生粗重组犬松弛素原蛋白；

步骤5、采用亲和层析纯化粗重组犬松弛素原蛋白，在200-500mM咪唑处洗脱获得高浓度蛋白，所述重组犬松弛素原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在上述技术方案中，步骤1中PCR扩增引物具体为：上游引物P1：5'-GCGGATCCATGACGGATGACAA-3'，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示；下游引物P2：5'-GCCTCGAGTCAGCATCGGCTAG-3'，其碱基序列如SEQ ID NO：4所示。

步骤2构建pMD19-T-prorelaxin克隆载体的连接体系为：胶回收纯化产物5.0μL，载体0.5μL，SolutionI 4.5μL。

步骤3中酶切体系为：pMD19-T-prorelaxin或pET28a 20.0μL，BamHI 5.0μL，XhoI 5.0μL，10×Kbuffer 5.0μL，ddH₂O 15.0μL，37℃作用4h。

步骤4中pET28a-prorelaxin表达菌的培养具体为：挑取单菌落于10mlLB培养基中，37℃250rpm，过夜；转接1％过夜菌于1000mlLB培养基，37℃250rpm 3小时，然后加入1mM IPTG，25℃诱导5小时；离心收集1000ml表达目标蛋白的大肠杆菌培养物，超声破菌于40ml破菌缓冲液中，离心后分别收集沉淀和上清；将沉淀用NTAU溶解，离心取溶解上清，上样于预先平衡好的NTA纯化柱，其中，NTA纯化柱为5mlNTA介质，10倍柱体积NTAU-0缓冲液平衡；样品上样完成以后，使用NATU-0缓冲液洗柱8-10个柱体积；顺序使用NATU-X缓冲液各洗柱1个柱体积，X为不同浓度咪唑；分步收集不同组分并电泳检测，收集得到重组犬松弛素原蛋白。

本发明所采用的第二技术方案是，一种犬松弛素原的多克隆抗体制备方法，包括以下步骤：

步骤1、采用上述方法制备重组犬松弛素原蛋白；

步骤2、以步骤1中的重组犬松弛素原蛋白为抗原，对新西兰家兔进行免疫处理；

步骤3、对新西兰家兔颈动脉取血，收集血清，血清经ProteinA柱纯化，得到特异性针对目的蛋白的抗体。

在上述技术方案中，步骤2中对新西兰家兔进行的免疫处理具体为：采用重组prorelaxin蛋白作为免疫抗原，分装保存于4℃条件下，第1天，取1ml抗原加入1ml弗氏完全佐剂，乳化，颈背部皮下至少8点注射，免疫2只新西兰白兔；第15天，取1ml抗原加入1ml弗氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下至少8点注射，免疫2只新西兰白兔；第29天，取1ml抗原加入1ml福氏不完全佐剂，乳化,颈背部皮下至少8点注射，免疫2只新西兰白兔；第43天，取1ml抗原加入1ml弗氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下至少8点注射，免疫2只新西兰白兔；第53天，颈动脉取血，将兔子处死；兔血在4度放置过夜，于4℃，10000rpm条件下离心30分钟，收集上清，即得血清。

步骤3中血清纯化具体为：血清经0.45um滤膜过滤；取出protein A柱，用10倍柱体积PBS平衡，待PBS流干后，血清上样过柱，收集流穿；5倍柱体积PBS平衡，流干后，加入5倍柱体积的0.1M的PH2.5甘氨酸溶液，收集洗脱液，每管1ml，预先加入90ul、1M、pH8.8的Tris溶液中和；加入10倍柱体积PBS平衡，流干后加入2倍柱体积的20％乙醇，4度保存柱子；收集的洗脱液，完成纯化。

本发明所说的犬松弛素原重组蛋白及犬松弛素原多克隆抗体在临床上的应用。本发明的犬松弛素原重组蛋白可制成相关制品。动物实验表明：松弛素具有广泛的生理功能：一、在妊娠或胚胎植入时，注射松弛素可抑制子宫肌收缩；二、在分娩时，注射松弛素可软化子宫颈，促进耻骨联合分离。在卵泡发育和排卵、妊娠期间乳腺生长、胎儿附植以及发动分娩等方面起重要作用。它可以促进胎盘生长，在妊娠早期可以增加子宫血流量。经多年的研究现认识到，松弛素在非妊娠系统也有重要作用，如舒张血管、促进组织愈合、抗纤维化、刺激组织重构、维持器官稳态等作用。因此可将其制成药品用于子宫阵痛、妊娠维持、促进分娩、预防早产难产和胎衣不下、抗炎及治疗心血管疾病等。

本发明所说的犬松弛素原多克隆抗体在临床上的应用。通过本方法制备的犬松弛素原多克隆抗体可用于建立松弛素原检测的各种技术，进而检测样品中犬 松弛素原的分布和含量，以对犬的生理机能进行评判，如用于犬妊娠诊断，完善犬松弛素原的临床应用。

本发明的有益效果是：本发明首次尝试通过犬松弛素原基因原核表达在体外获得犬松弛素原重组蛋白，相对于通过感染动物细胞和化学合成来获得纯化的松弛素原蛋白，具有培养简单、成本低廉、蛋白表达量高等特点。

犬松弛素原重组蛋白纯化后作为免疫原，免疫新西兰家兔获得多克隆抗体。本发明多克隆抗体的制备，具有制备程序简单、制备时间短、成本低廉、蛋白表达量高、特异性强等优势。

所获得的犬松弛素原重组蛋白和高效价的犬松弛素原多克隆抗体，可以为进一步研究犬松弛素原的功能与作用奠定基础。将松弛素原重组蛋白制成相关药品，具有重要的临床应用价值；以犬松弛素原多克隆抗体建立检测犬松弛素原的方法，分析样品中松弛素原的分布和含量，具有广阔的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1prorelaxin片段的扩增图，其中：M，DNAMaker；1，北京犬prorelaxin基因；

图2pET28a-prorelaxin重组质粒的酶切鉴定图，其中：M，DNA Maker；1，pET28a-prorelaxin重组质粒；

图3本发明重组蛋白超声波裂解的SDS-PAGE电泳图，其中：M，蛋白分子量标(170kD，130kD，95kD，72kD，55kD，43kD，34kD，26kD，17kD，11kD)；Lane1，pET28a-prorelaxin总菌体裂解液(未诱导)；Lane2，pET28a-prorelaxin总菌体裂解液(1mM IPTG诱导4小时后，28℃)；Lane3，超声波裂解后的上清液；Lane4，超声波裂解后的沉淀物；

图4本发明重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中：M，蛋白分子量标准(170kD，130kD，95kD，72kD，55kD，43kD，34kD，26kD，17kD，11kD)；Lane1，超声波裂解后的沉淀物(待纯化样品)；Lane2，流穿样品；Lane3，NTAU-10洗脱样品；Lane4，NTAU-50洗脱样品；Lane5，NTAU-20洗脱样品；Lane6，NTAU-500洗脱样品。*NTAU-10/50/200/500为10/50/200/500不同咪唑浓度；

图5本发明重组蛋白的免疫印迹图，其中：图4中Lane 5和Lane6泳道的蛋白样品分别对应本图Lane 1和Lane 2的蛋白样品；

图6本发明多克隆抗体特异性检测的Western blotting图，其中：1-2均为犬松弛素原蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明提供一种犬松弛素原基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种犬犬松弛素原重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明采用的材料如下：

A、实验动物及组织、菌种、表达载体：犬胎盘组织取自四川农业大学教学动物医院剖腹产的一只北京犬，PBS清洗后分别剪成小块，分装于含RNA保存液的离心管中，-70℃保存。pMD19-T感受态细胞及克隆宿主菌E.coliDH5α，pET28a表达载体及BL21(DE3)表达菌株均为北京天根生化科技有限公司产品。2只3月龄左右健康新西兰家兔，体重约2.0kg。

B、主要生物学试剂：限制性内切酶BamHI与XhoI、T4DNA连接酶购自大连宝生物公司，DNA片段纯化回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，质粒DNA小量提取试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司，PrimeSTAR HS DNAPolymerase(高保真酶)、DNA标准分子量为宝生物(大连)有限公司产品，蛋白质标准分子量购自Fermentas公司，兔抗His多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG购自美国Rockland公司；其余相关试剂均为国产或者进口分析纯。

C、主要溶液的配制

细菌裂解缓冲液：50mM PBS，pH 7.4，0.5M NaCl；

NTAU-X缓冲液：50mM PBS，pH 7.4，0.5M NaCl，8M Urea，X mM咪唑。

D、主要仪器设备

Mltrasonieproeessor-500超声波裂解器，Autoseienee公司产品；Sigmal-15普通离心机，Sigma公司产品；Mini-SUB凝胶电泳装置，GelDoc2000凝胶成像分析系统，MiniProtean3凝胶电泳仪及转印装置，均为Bio-Rad公司产品。

实施例1犬松弛素原基因的原核表达

1.1、犬松弛素原基因扩增引物的设计与基因克隆

检索Genbank获得犬preprorelaxin基因cDNA序列(登录号：NM_001003132.1)，用生物信息学网站提供的在线软件分析序列，获得犬松弛素原(prorelaxin)基因cDNA序列。针对犬松弛素原基因序列设计一对引物，并在5'端引入BamHI酶切位点，3'端引入XhoI酶切位点。其中：上游引物P1：5'-GCGGATCCATGACGGATGACAA-3'，下游引物P2：5'-GCCTCGAGTCAGCATCGGCTAG-3'。

以北京犬前松弛素原基因cDNA的克隆质粒pMD19-T-preprorelaxin为材料，提取质粒DNA，以P1和P2作为扩增用引物，扩增出犬松弛素原基因cDNA。琼脂糖凝胶电泳后观察到PCR扩增片段大小约为459bp的特异性条带(图1)，与预期相符。双酶切结果显示(图2)，犬松弛素原cDNA扩增片段被完全切下，与预期大小一致。利用PCR方法从转化连接后得到的菌落中直接扩增犬松弛素原基因cDNA，挑取的菌落均扩增得到大小约459bp左右的片段，初步证实这些菌落中已成功转入，将重组质粒送到生物公司测序，证实目的片段已成功克隆。

1.2、犬松弛素原基因克隆载体pMD19-T-prorelaxin的构建与转化

将回收的prorelaxin基因片段与19-T Simple Vector载体充分混匀后，于16℃连接过夜，连接体系为：胶回收纯化产物5.0μL，载体0.5μL，SolutionI 4.5μL。连接完成后将连接产物转入DH5α感受态细胞。

1.3、犬松弛素原基因表达载体pET28a-prorelaxin的构建

1.3.1、质粒DNA的抽提

PCR鉴定确认后的pMD19-T-prorelaxin克隆菌，接种于5ml含AMP(100μg/ml)的LB培养基，37℃震荡培养过夜，用质粒DNA小量提取试剂盒抽提质粒DNA。

1.3.2、载体与片段酶切

将含重组质粒PMD19-T-prorelaxin质粒与表达质粒pET28a的菌株分别培养后，抽提质粒DNA，用BamHI与XhoI双酶切，50μL酶切体系：pMD19-T-prorelaxin或pET28a 20.0μL，BamHI 5.0μL，XhoI5.0μL，10×Kbuffer 5.0μL，ddH₂O 15.0μL，37℃作用4h，酶切产物经琼脂糖电泳确认后，凝胶回收试剂盒回收目的片段和pET28a表达载体。

1.3.3、连接与转化

取PCR管按顺序加入试剂：酶切后犬松弛素原基因片段4.5μL，线性化pET28a0.5μL，T4DNALigase Buffer 5.0μL，共10μL，混匀后置16℃，进行连接，取连接液全部转入DH5a大肠杆菌感受态细胞，程序和方法同上。

1.3.4、重组阳性转化子的筛选和鉴定

挑取数个单菌落接种于LB液体培养基(100μg/ml卡那霉素)中，37℃振荡培养过夜，抽提质粒DNA，进行双酶切和PCR鉴定，方法同前。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物和PCR产物。经PCR和双酶切鉴定阳性的克隆菌送大连宝生物有限公司测序。将测序鉴定正确的克隆菌命名为pet28a-prorelaxin并保存。

1.3.5、转化BL21(DE3)表达菌

将步骤1.3.4中鉴定的阳性克隆菌抽提质粒后，按步骤1.3.3的方法转化BL21(DE3)表达菌，挑取菌落接种于LB液体培养基中，37℃震荡培养16小时。将不同编号过夜培养后的菌液接种于20μL PCR缓冲体系中，利用全菌PCR法进行鉴定。将PCR反应鉴定为阳性的菌落命名为pET28a-prorelaxin表达菌。

1.3.6、重组犬松弛素原蛋白的表达及纯化

(1)挑取单菌落于10mlLB培养基(Kana抗性)中，37℃250rpm，过夜；

(2)1％过夜培养菌液转接于1000mlLB培养基(Kana抗性)，37℃250rpm 3小时，然后加入1mM IPTG，25℃诱导5小时；

(3)离心收集1000ml表达目的蛋白的大肠杆菌培养物，于40ml细菌裂解缓冲液中超声波裂解，离心后分别收集沉淀和上清；

(4)将沉淀用NTAU溶解，离心取上清液，上样于预先平衡好的NTA纯化柱(5ml NTA介质，10倍柱体积NTAU-0缓冲液平衡)；

(5)样品上样完成后，使用NATU-0缓冲液洗柱8-10个柱体积；

(6)顺序使用NATU-X缓冲液分别洗柱1个柱体积；(X为不同浓度咪唑)

(7)分步收集不同组分并电泳检测，最终将含目的蛋白的组分混合在一起。

重组蛋白在表达菌中大部分以包涵体形式表达，分子量大小在22KD左右(图3)。通过进一步的亲和层析可以获得较高纯度的犬松弛素原重组蛋白。NTA纯化结果表明(图4)，重组蛋白在变性条件下与NTA柱结合效果一般，在200-500mM咪唑处可洗脱获得较高浓度蛋白，重复多次实验并选取纯度较高部分进行合 并。

1.3.7、免疫印迹实验(Western-blotting)

将洗脱下来的犬松弛素原重组蛋白进行10％聚乙烯酰胺凝胶电泳，使用湿电转膜的方式，把重新组合的蛋白质电转递到PVDF膜，之后使用封闭液(PBST，5％脱脂奶粉，pH7.0)37℃条封闭1h，用PBST 1∶2000稀释抗His一抗，37℃放置1h，完全洗涤后，用1：6000的PBST浓度稀释HRP标记的抗兔IgG二抗，37℃作用1h，用1×PBST充分洗涤；再置于暗室添加发光底物(Thenno)，3min后，将其放置在Kozak胶片下曝光，显影及定影后，观察目的蛋白的表达情况。

犬松弛素原重组蛋白与抗His抗体相互作用后，用化学底物进行显色，可以观察到与预期相符的22KD大小的特异性蛋白条带(图5)，证明纯化产物即为犬松弛素原蛋白。

本研究先用生物信息学方法分析犬前松弛素原基因cDNA序列，推导获得犬松弛素原基因序列。将犬松弛素原基因重组到原核表达载体中，通过诱导表达得到目的蛋白。表达的重组蛋白中含有编码的His标签，可使用与之特异结合的镍柱纯化。松弛素原分子量较小，含有三对二硫键，包涵体形成可能性更高，我们通过降低诱导温度、降低IPTG浓度、降低摇床转速等方式来减少包涵体的形成。利用超声裂解技术裂解菌体，高速离心后即能轻易分离包涵体和可溶性蛋白。大量诱导表达后通过超声波裂解菌体，经SDS-PAGE检测，发现重组蛋白主要存在于沉淀中，说明此重组蛋白表达形式为包涵体。这与文献报道相符，Reddy等曾报道猪松弛素原在大肠杆菌中表达的蛋白质在胞浆形成包涵体，占菌体蛋白8％。

本实验成功构建了犬松弛素原基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中高效表达，表达形式为包涵体。通过SDS-PAGE电泳以及Western bloting实验证明表达的特异性产物为犬松弛素原蛋白。通过本方法制备的重组蛋白可用于制备犬松弛素原多克隆抗体。

实施例2犬松弛素原多克隆抗体的制备

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：2只3月龄左右健康新西兰白兔，体重约2.0kg。

1.1.2主要试剂：辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG购自美国Rockland公司。其余试剂均为国产分析纯(国药化试)其余相关试剂均为国产或者进口分析纯。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂为美国Sigma公司产品，ProteinA介质为美国GE公司产品；NaCl、KCL、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Tris、Glycine、EDTA、TMB、DMSO等为国产分析纯试剂

1.2方法

1.2.1新西兰家兔免疫

免疫家兔前耳缘静脉采血0.5mL，离心取血清作为阴性对照，-20℃保存。前述的犬松弛素原纯化重组蛋白作为免疫抗原，分装存留于4℃。免疫流程：第1天，取1ml抗原加入1ml福氏完全佐剂，乳化(检验乳化的程度：把一滴乳化抗原液滴在生理盐水里，如果没有散开，就说明达到了要求)，在颈部与背部皮下进行多点(最少8点)注射；第15天，取1ml抗原加入1ml福氏不完全佐剂，免疫新西兰家兔；第29天，重复上一次免疫；第43天，重复上一次免疫；第53天，颈动脉采血。兔血在4℃静置过夜，离心(4℃，10000rpm)30分钟，收集上清。

1.2.2血清纯化

血清经ProteinA柱纯化，可得到特异性针对目的蛋白的抗体，操作步骤如下：血清经0.45um滤膜过滤；取出protein A柱，用10倍柱体积PBS平衡，待PBS流干后，血清上样过柱，收集流穿；倍柱体积PBS平衡，流干后，加入5倍柱体积的0.1M的PH2.5甘氨酸溶液，收集洗脱液，每管1ml，预先加入90ul1M Tris溶液(pH8.8)中和；加入10倍柱体积PBS平衡，流干后加入2倍柱体积的20％乙醇，4度保存柱子；收集的洗脱液检测280nm的吸光值，吸光值大于1.0的合并，PBS透析过夜，ELISA检测效价。

1.2.3间接ELISA法检测抗体效价

ELISA具体操作步骤如下：(1)包被：将抗原用CBS稀释为1ug/ml，加入酶标板中，每孔100ul，4℃过夜；(2)封闭：将包被液弃去，每孔加入200ul封闭液(5％脱脂奶粉)，37℃放置1.5小时；(3)加入样本：弃去封闭液，加入样品(血清或者抗体)，每孔100ul加入酶标板，37℃放置1小时；(4)洗涤：用自来水 冲洗10次，拍干；(5)加入二抗：酶标羊抗兔用封闭液稀释至工作浓度，每孔100ul加入酶标板，37℃放置30分钟；(6)洗涤：用自来水冲洗10次，拍干；(7)加入TMB显色底物：每孔100ul加入酶标板，37℃放置15分钟；(8)加入终止液：每孔加入2M H₂SO₄50ul；(9)读数：酶标仪OD450nm读数。

1.2.4Western blotting检测

1.2.4.1电泳及转膜

(1)配胶：配制15％的分离胶，加入电泳用的玻璃板中，分离胶凝固后，配制5％的积层胶，加入玻璃板中，插入15孔梳子。

(2)电泳：根据顺序加样，每个样品上样量为30ng蛋白，装入电泳槽中，打开电源，恒压100V开始电泳，运行20min；然后将电压调至180V，运行60min，取出胶进行转膜。

(3)转膜：滤纸及PVDF膜先用转移缓冲液浸泡数分钟，再用去离子水浸泡数分钟。然后先铺三层滤纸，用滚筒赶气泡，再盖上PVDF膜，接着放上电泳胶，用滚筒赶气泡，最后铺三层滤纸，装入转移槽中，打开电源，恒压30V开始转膜，运行16h，转膜结束后使用眼科镊将膜夹出，放在5％脱脂奶溶液中封闭，放入反应盒中备用。

1.2.4.2Western Blot

(1)加一抗：anti-prorelaxin抗体用5％脱脂奶粉稀释(1：5000和1:20000)，加入反应盒中，室温缓摇2小时。

(2)洗膜：用PBST洗去未结合的一抗，每次10分钟，洗4次。

(3)加二抗：二抗(HRP标记羊抗兔)用5％脱脂奶粉稀释(1：5000)，加入反应盒中，室温缓摇60分钟。

(4)洗膜：用PBST洗去未结合的一抗，每次10分钟，洗4次。

(5)显色：在EP离心管中按照每1mlECL-PLUS显色液需要SolutionA1ml、Solution B 20ul的比例配置显色液，加入膜上(有蛋白的一面)，反应5分钟，X-film曝光。

2结果

2.1间接ELISA法检测抗体效价

用间接ELISA的方法检测待检血清效价，并记录其OD₄₅₀值。当待检血清OD₄₅₀(P) 值与阴性对照血清OD₄₅₀(N)值之比大于或等于2.1，且待检血清OD₄₅₀(P)大于或等于0.4时判断为阳性，故该抗体效价达到1:80000以上。结果(表1)表明本试验获得了高效价的prorelaxin多克隆抗体。

表1 prorelaxin多克隆抗体效价的ELISA检测

2.2 Western blotting检测抗体特异性

Prorelaxin蛋白转膜后分别与稀释度为1∶5000的一抗、二抗反应，Western blotting检测结果表明(图6)，anti-prorelaxin兔血清作为一抗在稀释至1∶5000时仍能与纯化后的蛋白反应，进一步证实了所制备的抗体能与重组蛋白特异性结合。

通过本方法制备的犬松弛素原多克隆抗体可用于建立松弛素原检测的各种技术，进而检测样品中犬松弛素原的分布和含量，以对犬的生理机能进行评判，如用于犬妊娠诊断，完善犬松弛素原的临床应用。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种犬松弛素原重组蛋白及犬松弛素原的多克隆抗体的制备方法

<130> 2015

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 459

<212> DNA

<213> 犬

<400> 1

acggatgaca agaaacttaa ggcatgtggt cgtgattatg tccgcctaca gattgaggtc 60

tgcggctcca tctggtgggg gagaaaggct ggccagctgc gggaacgtcg gcagatatcc 120

gaacccctgg cagaagttgt gccatcctcc atcatcaatg atccagaaat cttaagtttg 180

atgttgcaat ccattcccgg tatgccacag gaactgagga tagcaacacg gtctgggaag 240

gagaagttat taagagagct acactttgta ctggaagatt ccaatcttaa cttggaagaa 300

atgaagaaaa cttttcttaa cacacaattt gaagctgaag acaaaagcct ttcaaaatta 360

gataaacatc cccgaaaaaa gagagataac tacataaaaa tgagtgataa atgttgtaat 420

gtaggttgta ccagaagaga gcttgctagc cgatgctga 459

<210> 2

<211> 152

<212> PRT

<213> 犬

<400> 2

Thr Asp Asp Lys Lys Leu Lys Ala Cys Gly Arg Asp Tyr Val Arg Leu

1 5 10 15

Gln Ile Glu Val Cys Gly Ser Ile Trp Trp Gly Arg Lys Ala Gly Gln

20 25 30

Leu Arg Glu Arg Arg Gln Ile Ser Glu Pro Leu Ala Glu Val Val Pro

35 40 45

Ser Ser Ile Ile Asn Asp Pro Glu Ile Leu Ser Leu Met Leu Gln Ser

50 55 60

Ile Pro Gly Met Pro Gln Glu Leu Arg Ile Ala Thr Arg Ser Gly Lys

65 70 75 80

Glu Lys Leu Leu Arg Glu Leu His Phe Val Leu Glu Asp Ser Asn Leu

85 90 95

Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Thr Phe Leu Asn Thr Gln Phe Glu Ala

100 105 110

Glu Asp Lys Ser Leu Ser Lys Leu Asp Lys His Pro Arg Lys Lys Arg

115 120 125

Asp Asn Tyr Ile Lys Met Ser Asp Lys Cys Cys Asn Val Gly Cys Thr

130 135 140

Arg Arg Glu Leu Ala Ser Arg Cys

145 150

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcggatccat gacggatgac aa 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcctcgagtc agcatcggct ag 22