与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记及其扩增引物与应用的制作方法

本发明涉及分子标记，具体地说，涉及与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记。

背景技术：

番茄灰叶斑病(Tomato gray leaf spot)是近年来新流行的一种病害，该病病原菌为匍柄霉属(Stemphylium Wallroth)真菌，是一类丝状暗色砖格孢真菌，可以引起多种蔬菜病害。该病在世界范围内均有发生，温暖潮湿地区尤为严重。近年来，番茄灰叶斑病在我国南方和北方的春夏季普遍发生，在早春保护地特别是保护地硬果型番茄栽培中危害较为严重，常会造成番茄品质下降和产量锐减，给番茄生产造成严重影响，给农民造成了巨大的损失。

目前，已经挖掘了一些抗灰叶斑病的番茄种质资源，前人也利用了其中一些抗病材料对番茄灰叶斑病抗性遗传规律及分子标记进行了初步研究。Behare等(1991)利用番茄感病材料Moneymaker与抗病材料Motelle进行杂交后自交，获得124株F₂群体，通过RFLP图谱分析，将基因Sm定位于番茄11号染色体T10和TG110之间，二者距离为10.9cM。2009年Ji and Scott报道了一个能够检测Sm基因的Caps标记CT55，该标记是一个隐性标记，PCR产物约为400bp，经DdeI酶切后，感病材料和杂合材料产生330bp、200bp和140bp左右的条带，而抗病材料中产生200bp和140bp的条带，该标记不能区分感病材料与杂合材料，且其尚未在番茄种质资源中验证应用。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记及其扩增引物与应用。

本发明开发了一个与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记，利用PCR技术对该标记位点进行扩增，通过电泳检测扩增产物的片段数量和大小，判断被检番茄样品是否为抗灰叶斑病材料，进而实现对抗灰叶斑病番茄的辅助选育及快速鉴定。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。SEQ ID No.1所示的核苷酸序列长度为158bp。

第二方面，本发明提供用于扩增所述Indel标记的引物，所述引物的核苷酸序列如下：

Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG；

Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG。

第三方面，本发明提供一种具有灰叶斑病抗性番茄的筛选方法，以番茄材料的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物进行PCR扩增，扩增产物若含有158bp的权利要求1所述Indel标记，表明番茄材料具有灰叶斑病抗性。

第四方面，本发明提供所述引物在筛选番茄种质资源上的应用，以番茄材料的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物进行PCR扩增，根据扩增产物差异，实现番茄灰叶斑病抗性的鉴定或辅助选育。

进一步地，所述番茄材料包括但不限于番茄的种子、幼苗、叶片、根、茎。优选为幼嫩叶片。

所述番茄材料的基因组DNA通过本领域的常规方法提取，如：取番茄植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取基因组DNA。

进一步地，前述扩增产物差异，指产物电泳条带类型的差异。扩增出一条170bp的条带，为感灰叶斑病隐性纯合材料；扩增出一条170bp的条带和一条158bp的条带，为抗灰叶斑病显性杂合材料；扩增 出一条158bp的条带，为抗灰叶斑病显性纯合材料。可选择抗灰叶斑病显性纯合材料作为育种材料，使后代为抗灰叶斑病显性。

通过上述方法，可以准确、高效地在番茄候选材料的任何阶段对其进行灰叶斑抗性鉴定和筛选。不需要对扩增片段进行测序，仅通过产物电泳条带类型的差异即可准确实现番茄灰叶斑病抗性的鉴定或辅助选育。

作为优选，所述PCR扩增的总反应体系为10μL，其中：DNA模板(50ng·μL^-1)2μL，权利要求2所述引物(10μmol·L^-1)各0.25μL，2×GoGreen Master Mix(Promega公司产品)5μL，双蒸水2.5μL。

作为优选，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，32个循环；72℃保温6分钟，4℃保存。

上述PCR反应体系和反应程序能使PCR反应顺利进行，保证引物最大效率的进行扩增。

对扩增产物进行凝胶电泳检测时，采用3％琼脂糖凝胶电泳分离检测。上样量8μL，电泳时电压为180V，时间为：1.5～2.0h；或采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于180V恒功率电泳分离1.5h，最后银染显色。

第五方面，本发明还提供了含有所述引物的检测试剂盒。所述试剂盒的其他组分可为常规选择，只要能实现利用所述引物实现PCR扩增即可。

本发明的有益效果在于：

本发明不仅为番茄抗灰叶斑基因Sm的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有抗灰叶斑病的番茄新品种提供了高效途径。本发明基于开发的Indel标记引物提供用于辅助筛选具有灰叶斑抗性的番茄新品种的方法，可以在番茄候选材料的任何阶段对其进行灰叶斑抗性鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优 点。

本发明通过利用23份不同遗传背景的番茄资源进行验证，结果表明Sm-Indel验证的正确率为100％。

附图说明

图1为本发明实施例2中用Sm-Indel标记验证番茄亲本材料H1706(P1)、892-43(P2)、F₁以及F₂群体随机单株的部分琼脂糖和聚丙烯酰胺电泳检测结果；其中，P1：H1706(感灰叶斑病，S)；P2:892-43(抗灰叶斑病，R)。

图2为本发明实施例2中用Sm-Indel标记验证23份不同遗传背景的番茄材料的琼脂糖电泳检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

生物材料的来源和记载出处：

实施例所用的试验材料为品种H1706和高代自交系892-43。以H1706为母本，892-43为父本杂交，获得F₁，自交获得F₂群体。

番茄品种H1706(P1)：从美国番茄遗传资源中心(Tomato Genetics Resource Center)引进。该品种是由美国人Charlie John在20世纪60年代中期选育而成的加工类型番茄品种，有限生长类型，早熟，果实椭圆形，中等大小，抗枯萎病和黄萎病。该品种是国际番茄基因组计划的测序品种，在2012年的《Nature》第485期的第630页有记载。

番茄高代自交系892-43(P2)：由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的鲜食番茄抗病自交系，无限生长类型，中早熟，幼果无绿果 肩，成熟果粉红色。果实圆形，平均单果重220克左右，抗番茄叶霉病，番茄花叶病毒病(TMV)和灰叶斑病(新发现)。为现有已知品种，在本课题组高振华等人1995年发表在《中国蔬菜》第5期第11-14,21页的文章《番茄新品种中杂9号》中有记载。

23份不同遗传背景的番茄材料的具体来源和出处详见Lin等在《Nature Genetics》杂志2014年发表的文章《Genomic analyses provide insights into the history of tomato breeding》，其中10份为抗性材料，13份为感病材料。

主要试剂：

重测序的基因组信息详见Lin等在《Nature Genetics》杂志2014年发表的文章《Genomic analyses provide insights into the history of tomato breeding》，Indel标记引物是本实验室基于两亲本重测序的基因组信息、利用primer 3.0软件设计得到。

PCR实验使用Shanghai PromeGa公司的GoTaq Green Master Mix；

凝胶电泳使用康润公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至8％后使用。

下述实施例中所用的其他材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Sm-Indel标记的获得

一、番茄灰叶斑病苗期抗性鉴定

本试验以番茄高代自交系H1706(感病)和892-43(抗病)为母本和父本，自交获得F₁、F₂群体及F₃家系。2015年春，在中国农业科学院蔬菜花卉研究所鲜番课题组玻璃温室对H1706、892-43、F₁及441株F₂进行接种。将4片真叶完全展开的植株移到接种室内适应1-2天，接种室温度调至26℃，自然光照。接种之前，给植株浇足水分，保证接种室的高湿环境。采用喷雾法进行接种，接种时喷雾一定要均匀，保证各层叶片都能接上，喷菌液直至植株滴水为止。接种 后覆膜以保证湿度。48小时后揭膜，正常管理。7天后调查发病情况。病情分为0-5级，0级：植株正常，只有轻微病斑；1级：植株正常，少数老叶片有病斑；2级：植株正常；2-3片真叶有病斑，叶片出现萎蔫；3级：植株生长，底部叶片干枯，发脆；4级：植株萎蔫，大部分叶片脱落；5级：叶片干枯脱落，或整株死亡。

根据调查结果使用Microsoft Excel 2003及SAS8.0软件进行数据统计分析，判断分离比。

结果显示：感病亲本H1706植株表现出明显的症状，大多数植株死亡，而抗病亲本892-43植株生长正常，病斑主要出现在少数的老叶上，表现出较好的抗性。后代F₁均表现抗病；F₂群体共441株，其中340个单株表现为抗病，101个单株死亡表现为感病，抗病植株数与感病植株数比例为3.37:1，符合孟德尔3:1分离比例(χ²3:1＝1.03，P＝0.31)，表明番茄抗灰叶斑病基因Sm为一个显性单基因。

二、DNA提取和分子标记分析

取番茄植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及群体各单株的基因组DNA。

PCR反应体系为：总反应体系10μL，2μL DNA(50ng·μL^-1)，正向和反向引物(10μmol·L^-1)各0.25μL，5μL 2×GoGreen Master Mix(Promega公司产品)，双蒸水2.5μL。

引物使用番茄全基因测序开发的Indel引物：

正向引物：Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG；

反向引物：Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG。

PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环；72℃保温6min，4℃保存。

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，180V恒功率电泳分离1.5h，电泳后银染显色，统计带型。

三、初步定位的Indel分子标记筛选、数据统计及连锁图构建

Behare等(1991)已经将Sm基因初步定位到番茄第11号染色体RFLP标记TG110和T10之间。本试验将目标区域定位于整条11号染色体。首先对本课题现有的根据栽培番茄重测序信息设计的位于11号染色体的Indel标记进行多态性筛选，根据引物在染色体的位置及连锁情况选取其中7个多态性条带清晰可辨的标记构建Sm基因的遗传图谱。

共显性标记的统计方法：与母本(H1706)一致的带型记为a，与父本(892-43)一致的带型记为b，杂合的带型记为h，未扩增出的或模糊不清的记为u。

结果显示：

利用筛选出7对理想的多态性标记对H1706×892-43组合的441株F₂群体单株进行分析，结合调查性状数据利用Joinmap4.0构建连锁图。结果7个标记落在同一连锁群内，分别位于7个位点上，标记的遗传顺序与物理顺序一致。Sm基因落在连锁图内，位于标记Indel335和Indel240之间，与侧翼标记之间的遗传距离分别为0.6cM和1cM，两个侧翼标记的物理距离为3.55Mb。

四、筛选重组单株并对Sm定位结果进行验证

用侧翼分子标记Indel335和Indel240对4730个F₂群体单株进行筛选。针对初定位的染色体区段，结合番茄基因组序列(母本H1706)和父本(892-43)重测序的数据，利用primer 3.0软件在目标区段(约3.55Mb)共设计了11对具有多态性的Indel标记引物，对获得的重组单株进行基因型分析，随后对部分重要重组单株的F₃后代进行了抗病鉴定。根据重组单株基因型结果及其F₃后代抗病调查结果，将Sm基因定位在物理距离为185kb的范围内，并且获得了一个与该基因紧密连锁的标记Sm-Indel。

五、PCR扩增所得差异片段的回收纯化及测序

(1)目的片段的扩增、回收

具体操作为：

使用高保真酶进行PCR扩增，PCR结束后用2％琼脂糖凝胶检测产物，然后用胶回收试剂盒回收目的片段(高保真酶购自全式金公司，胶回收试剂盒购自Takara公司)。

(2)目的片段与载体的连接

反应体系为10μL：PMD18-T Vector1.0μL；Ligation bufferⅠ5.0μL；目的片段4.0μL。

在超净工作台上加样，混匀反应物，短暂离心，16℃连接约1h，过夜也不影响连接效率。

(3)连接产物的转化

1)取出感受态细胞，置于冰上融化；

2)将连接产物加入50μL感受态细胞中，置于冰上30min；

3)42℃水浴热激45s，注意不要晃动离心管；

4)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2min；

5)加入500μL LB液体培养基。在37℃，150rpm摇床上预培养1h；

6)将菌液涂布到含有100μg·mL^-1Amp、25μg·mL^-1IPTG和40μg·mL^-1X-GAL的LB固体培养基上，用一无菌的弯头玻棒轻轻的将菌液均匀涂开，置于室温直至液体被吸收；

7)倒置平板，37℃培养12～16h。

(4)重组质粒的蓝白斑筛选

经37℃培养后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色菌落，其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中，37℃，150rpm过夜培养。

(5)菌落PCR的检测

吸取1μL菌液作为模板进行PCR扩增。取8μL PCR产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，与PCR Marker标准分子量相比较检测插入片段的大小，与插入目的片段大小一致的克隆即为阳性克隆。

(6)克隆后载体的测序与分析

取3个阳性克隆菌液在甘油(330μL甘油中加入1000μL菌液)中各保存两份，一份-20℃保藏，一份送去测序。

其中Sm-Indel标记引物Sm-Indel-F/Sm-Indel-R扩增出的与番茄感灰叶斑病基因sm连锁的特征片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的特征片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2与番茄Sm基因连锁的Sm-Indel标记的验证

用对实施例1获得的与Sm基因连锁的Indel标记Sm-Indel对亲本、F₁及441份F₂单株材料以及23份不同遗传背景的番茄材料进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。验证采用实施例1中步骤二中的PCR扩增和检测方法。

经和所选材料的田间表型相比，该Sm-Indel标记验证441份F₂材料，结果显示，共有420个F₂单株的带型反映的表型数据与田间调查结果一致，准确率为95.2％(部分琼脂糖电泳检测结果示于图1)。其中不符合的部分与接病情况及调查的准确性有一定关系。

另外，采用现有已知的23份不同遗传背景的番茄品种材料重复验证该Sm-Indel标记，结果发现，在这23份材料中，有10份为抗灰叶斑病材料，13份为感灰叶斑病材料，所有的23份材料带型反映的表型数据与田间调查结果均一致对应，准确率为100％，见图2。

实施例3一种与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记

本实施例提供一种与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记，其具体核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，序列长度为158bp。

实施例4用于扩增实施例3所述Indel标记的引物

本实施例提供用于扩增实施例3所述Indel标记的引物，所述引物的核苷酸序列如下：

Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG；

Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG。

实施例5实施例4所述引物在筛选番茄种质资源上的应用

本实施例提供实施例4所述引物在筛选番茄种质资源上的应用。以番茄材料的基因组DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增，根据扩增产物差异，实现番茄灰叶斑病抗性的鉴定或辅助选育。

具体为：取番茄植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及群体各单株的基因组DNA。

PCR反应体系为：总反应体系10μL,2μL DNA(50ng·μL^-1)，正向和反向引物(10μmol·L^-1)各0.25μL，5μL 2×GoGreen Master Mix(Promega公司产品)，双蒸水2.5μL。

引物使用番茄全基因测序开发的Indel引物：

正向引物：Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG；

反向引物：Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG。

PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环；72℃保温6min，4℃保存。

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，180V恒功率电泳分离1.5h，电泳后银染显色，统计带型。

扩增出一条170bp的条带，为感灰叶斑病隐性纯合材料；扩增出一条170bp的条带和一条158bp的条带，为抗灰叶斑病显性杂合材料；扩增出一条158bp的条带，为抗灰叶斑病显性纯合材料。可选择抗灰叶斑病显性纯合材料作为育种材料，使后代为抗灰叶斑病显性。

通过上述方法，可以准确、高效地在番茄候选材料的任何阶段对其进行灰叶斑抗性鉴定和筛选。不需要对扩增片段进行测序，仅通过产物电泳条带类型的差异即可准确实现番茄灰叶斑病抗性的鉴定或辅助选育。

实施例6含有实施例4所述引物的试剂盒

本实施例提供一种试剂盒，包括如下组分：dNTP(2.5mM)、 MgCl₂(25mM)、Taq polymerase(2.5U)、10×Buffer、正向引物(10μmol·L^-1)、反向引物(10μmol·L^-1)、灭菌ddH₂O。

其中，正向引物为Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG；

反向引物为Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。